<strike id="yasec"></strike>
完成機構(gòu)：中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所茶樹資源與改良研究中心、國家茶樹改良中心,杭州310008
構(gòu)建基因組文庫的步驟
A 分離基因組DNA；B 用超聲波或限制酶等進行基因組DNA部分或完全降解；C 將降解物進行分級得到所需大小DNA片段；D 將DNA片段與載體連接(一般用λ噬菌體載體)；E 將重組體導入宿主細胞；F 最后篩選鑒定重組子克隆。
建立基因組文庫的方法2—λ噬菌體基因組文庫 可插入較大片段，最大可達23kb
建立基因組文庫的其他方法：cosmid基因組文庫 YAC基因組文庫 BAC基因組文庫
基因文庫的質(zhì)量標準：
重組克隆的總數(shù)不宜過大， 以減輕篩選工作的壓力；載體的裝載量最好大于基因的長度， 避
免基因被分隔克隆；克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域, 以利克隆排序；克隆片
段易于從載體分子上完整卸下,重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選
建立cDNA文庫的基本步驟
(1)隔離總RNA和凈化mRNA (2)合成的雙鏈互補脫氧核糖核酸適合插入一個克隆載體(3)克隆cDNA合適的向量(4)轉(zhuǎn)移到合適的宿主細胞的重組載體(5)篩查陽性克隆
cDNA克隆的策略
(1)自身引導的第二鏈合成+同聚物加尾（2）cDNA克隆方法的改進。尾隨第一鏈寡核苷酸（DC）允許使用寡核苷酸引物（ DG）將要開展的第二鏈（3）cDNA的定向克隆
從基因文庫中篩選分離目的基因克隆(1)制備核酸探針進行雜交篩選(2) 制備抗體進行免疫雜交篩選(3)根據(jù)生物大分子間的相互作用篩選目的基因(4)利用PCR技術篩選目的基因文庫(5)利用噬菌體表面展示技術分離目的cDNA克?。菏删w展示(phage display)：是在噬菌體表面表達已融合到噬菌體外殼蛋白的重組蛋白或多肽的技術。
應用噬菌體展示技術的關鍵是構(gòu)建表達性基因文庫，這種文庫稱為噬菌體展示文庫(phage display library )。
常用的構(gòu)建噬菌體顯示文庫的表達載體有兩類：絲狀噬菌體和以這些噬菌體復制起始序列為基礎構(gòu)建的噬菌粒(phagemid)。
mRNA差別顯示技術原理：
在 mRNA3′端的 poly (A)5’上游的 2個堿基只有 1 2種組合。與此相對應，共可人工合成12種不同的下游引物，用以反轉(zhuǎn)錄mRNA 合成cDNA第一條鏈。這種引物通常稱為3’端錨定引物，它由Oligo-d T后面接上兩個堿基 (如 5′T1 1 - 1 2 MN3′, M=G、C或 A; N=A、G、C或 T)構(gòu)成。這樣，每一種此類人工合成的寡核苷酸引物，都將能夠把總mRNA群體的1/12分子反轉(zhuǎn)錄成mRNA-cDNA雜交分子。由此可知，使用5′T1 1 - 1 2 MN3′引物，可以將整個mRNA群體在cDNA水平上，分成大致相等的但序列結(jié)構(gòu)不同的12份亞群體。
DDRT-PCR的主要步驟：
Ⅰ.從不同發(fā)育階段或不同基因型的細胞群體中分離mRNA，并以3'錨定引物作為反轉(zhuǎn)錄的引物，合成第一鏈cDNA；Ⅱ.用5'隨機引物和某個3'端錨定引物對擴增第一鏈(摻入32P-dNTP)；Ⅲ.用DNA變性測序膠分離擴增產(chǎn)物，X光片曝光后檢測差別條帶；Ⅳ.回收特異性差別條帶；Ⅴ.用同一引物對擴增已回收的DNA條帶；Ⅵ.用Northern，Southern及測序法分析所得的條帶；Ⅶ.以該DNA片段做探針，篩選全長cDNA或核基因。
DNA插入誘變法分離目的基因
DNA插入誘變法主要用于植物目的基因的克隆分離研究。其基本原理是，當一段特定的DNA序列插入到植物基因的內(nèi)部或其鄰近位置時，一般會誘導該基因發(fā)生突變形成突變體植株，或者在插入位置產(chǎn)生一個新的基因。 如果該DNA插入序列是已知的，便可用它作為DNA分子探針，從突變體植株的基因組DNA文庫中篩選得到突變基因片段。然后利用此突變基因片段制備探針，從野生型植株的基因組DNA文庫中克隆出野生型的目的基因。這樣，插入的DNA序列相當于在植物基因上貼了一張標簽，因此，DNA插入誘變法又叫DNA標簽法(DNA tagging)。
差別雜交和減法雜交技術分離目的基因
差別雜交
構(gòu)建了基因文庫后，如沒有任何可供選擇的探針進行篩選，或沒有任何有關目的基因的核苷酸序列信息時，可以考慮用差別雜交法篩選目的基因片段。差別雜交(Differential hybridization)也稱為差別篩選(Differential screening)法。
特別適用于分離在特定組織中或發(fā)育的特定階段表達的基因以及受生長因子調(diào)控的基因，亦可有效地用來分離經(jīng)特殊處理誘導表達的基因。
差別雜交的技術原理：有目的基因能正常表達和不能表達的兩個不同的細胞群體。
在這種情況下，分別制備兩種不同細胞群體的mRNA提取物，其中一個群體含有一定比例的目的基因mRNA ，另一個群體不含有目的基因mRNA。
差別雜交的技術原理過程：
以這兩種總mRNA(或是它們的cDNA拷貝)為探針，分別對由表達目的基因的細胞群體構(gòu)建的cDNA文庫進行篩選。
當以目的基因表達的mRNA群體為探針時，所有包含重組體的菌落都呈陽性反應，在X光底片上呈現(xiàn)黑色斑點;
而以目的基因不表達的mRNA群體為探針時，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈陽性反應，在X光底片上呈現(xiàn)黑色斑點。
比較這兩種底片并對照原平板，變可以挑選出含有目的基因的菌落，供進一步研究用。
差別雜交法的局限性：首先，差別雜交的靈敏度比較低，不適合低豐度mRNA的目的基因的分離。其次，差別雜交需要篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量的噬菌斑，是一項十分耗時耗力的工作；第三，差別雜交重復性差。差別雜交涉及文庫的濾膜影印，不同濾膜之間的DNA保有量往往不均一，雜交所得的信號強度也會不一致，需要重新進行點雜交，以做進一步的陽性克隆鑒定工作 。
mRNA減法雜交基本原理：從表達目的基因的組織中提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，然后與無目的基因表達的組織中提取的mRNA做過量雜交，在兩種組織中均表達的基因產(chǎn)物形成程cDNA/mRNA雙鏈雜交分子，而特異mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA片段仍然保持單鏈狀態(tài)，這種單鏈cDNA分離出來即為差異表達的序列。
基因突變技術分為兩大類：位點特異性突變和隨機突變。位點特異性突變又分兩種類型：一類是通過寡核苷酸介導的基因突變(oligonucleotide-mediated mutagenesis)；第二類是利用PCR,以雙鏈DNA為模板所進行的基因突變。
寡核苷酸介導的定點誘變的原理
使用化學合成的含有突變堿基的寡核苷酸片段作引物，啟動單鏈DNA分子進行復制，隨后這段寡核苷酸引物便成了新合成的DNA子鏈的組成部分。因此，所產(chǎn)生出來的新鏈便具有已發(fā)生突變的堿基序列。要求所設計的寡核苷酸引物除了所需的突變位點之外，與目的基因編碼的區(qū)段完全互補。
作為誘變劑的寡核苷酸序列，同待誘變的目的基因的互補序列之間，能形成一種穩(wěn)定的唯一的雙鏈結(jié)構(gòu)。決定雙鏈區(qū)段穩(wěn)定性的主要因素是堿基的組分、核苷酸的錯配以及寡核苷酸引物的長度等。
寡核苷酸介導的定點誘變的基本步驟
(a)將要進行突變的目標基因(或DNA片段)克隆于M13噬菌體載體或噬菌粒載體。(b)從重組的M13或噬菌粒中制備單鏈DNA。(c)將設計好的寡核苷酸突變引物的5’端用T4多核苷酸激酶進行磷酸化。(d)將上述突變引物與目標基因(單鏈的DNA模板)進行退火。(e)在存在DNA聚合酶和dNTP的情況下，使退火引物沿單鏈DNA模板延伸，然后新生鏈的末端用T4 DNA連接酶連接。(f)轉(zhuǎn)染易感細菌。(g)篩選出帶有突變的目標基因的噬菌斑。(h)從突變的重組噬菌體制備單鏈DNA，通過DNA序列分析確認突變位點的正確性。(i)從重組的M13噬菌體復制型雙鏈DNA中回收突變的目標基因(DNA片段)。(j)將突變了的基因(DNA片段)重組入表達載體進行表達。
第五章
受體細胞應具備的條件
(1)便于重組DNA分子的導入。如易形成感受態(tài)，具有較高的轉(zhuǎn)化效率；(2) 能使重組體DNA分子穩(wěn)定存在于細胞中。如限制性缺陷型； (3) 便于重組體的篩選。如具有與重組體互補的遺傳性狀； (4) 受體細胞遺傳穩(wěn)定性高，易于擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生長，能進行高密度培養(yǎng)；對動物細胞要可懸浮培養(yǎng)，對培養(yǎng)基適應性要好；(5)安全性高，無治病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染：感染與寄生缺陷型；(6)蛋白水解酶少,利于外源蛋白在細胞內(nèi)的積累。尤其是對枯草芽孢桿菌。(7) 受體細胞的密碼子偏倚性要??；(8) 具有較好的翻譯后加工機制，便于真核目的基因的高效表達。 ▲糖蛋白不能在E.coli中表達；(9) 在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應用價值；(10)對于用于基因擴增或基因高效表達的受體要用重組整合缺陷型。
第六章
克隆基因高表達的相關因素
1有效轉(zhuǎn)錄開始 關鍵的一步，并限制外源基因表達的一步！構(gòu)建表達載體的同時，選擇強的和可控制的啟動子和相關終止序列。
2有效延長和終止轉(zhuǎn)錄正確 3 mRNA的穩(wěn)定性4有效地轉(zhuǎn)錄開始5遺傳密碼子偏向6核糖核酸處理過程7終止密碼子8表達載體9重組蛋白
Lac 表達系統(tǒng) 以大腸桿菌 lac 操縱子調(diào)控機理為基礎設計、構(gòu)建的表達系統(tǒng)
具有多順反子結(jié)構(gòu)，基因排列次序為：啟動子（lacP）- 操縱基因（lacO） - 結(jié)構(gòu)基因（lacZ-lacY-lacA）；正調(diào)節(jié)因子 CAP；負調(diào)節(jié)因子 lac I
Tac 表達系統(tǒng)
tac啟動子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的雜合啟動子。
調(diào)控模式與 lacUV5 相似，但 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平高于 trp 和 lacUV5啟動子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有較高基因表達水平的情況下，選用 tac 啟動子比用 lacUV5 啟動子更優(yōu)越。
包涵體蛋白
在一定條件下，外源基因的表達產(chǎn)物在大腸桿菌中積累并致密地聚集在一起，形成無膜的裸露結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)稱為包涵體(inclusion body, inclusive body)。
包涵體主要由蛋白質(zhì)組成，并且大部分為外源基因的表達產(chǎn)物，它們具有正確的氨基酸序列，但構(gòu)像卻是錯誤的，因而包涵體蛋白一般沒有生物學活性。
除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。
包涵體形成的原因
主要因為在重組蛋白的表達過程中，缺乏某些蛋白質(zhì)折疊過程中需要的酶和輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。此外，還有以下原因：
(1)表達量過高。(2) 重組蛋白的氨基酸組成(3)重組蛋白所處的環(huán)境：溫度、pH(4)缺少真核生物中翻譯后修飾所需酶類(5)培養(yǎng)條件不佳
酵母基因表達載體的種類
自主復制型質(zhì)粒載體:含酵母基因組的DNA復制起始區(qū)、選擇標記和克隆位點等關鍵元件。較高拷貝數(shù)，細胞分裂時不能平均分配到子細胞中。
整合型質(zhì)粒載體:不含酵母基因組的DNA復制起始區(qū)，但含有整合介導區(qū)。
著絲粒型質(zhì)粒載體:在自主復制型質(zhì)粒載體基礎上構(gòu)建而成，增加了酵母染色體有絲分裂穩(wěn)定序列元件，可保證平均分配到子細胞中。1-2拷貝/細胞。
酵母人工染色體:以線性雙鏈DNA形式存在于酵母細胞，每個細胞只有單拷貝。
原核表達系統(tǒng) 表達調(diào)控方式 組成型,誘導型 表達產(chǎn)物定位 分泌型,不分泌型(細胞內(nèi),細胞膜,周質(zhì)空間) 產(chǎn)物純化方式 是否融合蛋白,是否一步親和純化 產(chǎn)物溶解狀況 可溶,包含體,分泌型
在各種表達系統(tǒng)中，最早被采用進行研究的是原核表達系統(tǒng)，這也是目前掌握最為成熟的表達系統(tǒng)。該項技術的主要方法是將已克隆入目的基因DNA片段的載體(一般為質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化細菌(通常選用的是大腸桿菌)，通過IPTG誘導并最終純化獲得所需的目的蛋白。其優(yōu)點在于能夠在較短時間內(nèi)獲得基因表達產(chǎn)物，而且所需的成本相對比較低廉。但與此同時原核表達系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點：如通常使用的表達系統(tǒng)無法對表達時間及表達水平進行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達可能會對宿主細胞產(chǎn)生毒害作用，過量表達可能導致非生理反應，目的蛋白常以包涵體形式表達，導致產(chǎn)物純化困難；而且原核表達系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達產(chǎn)物的生物活性較低
為克服上述不足，許多學者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入真核基因調(diào)控領域，其優(yōu)點是
①根據(jù)原核生物蛋白與靶DNA間作用的高度特異性設計，而靶DNA與真核基因調(diào)控序列基本無同源性，故不存在基因的非特異性激活或抑制
②能誘導基因高效表達，可達105倍，為其他系統(tǒng)所不及；
③能嚴格調(diào)控基因表達，即不僅可控制基因表達的“開關”，還可人為地調(diào)控基因表達量
因此，利用真核表達系統(tǒng)來表達目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達系統(tǒng)有酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。
2RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結(jié)合的技術。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結(jié)合的技術。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。。RT-PCR用于對表達信息進行檢測或定量。另外，這項技術還可以用來檢測基因表達差異或不必構(gòu)建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術，更靈敏，更易于操作。逆轉(zhuǎn)錄反應可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應產(chǎn)物進行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進行。
逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：
1、 依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈
2、 Rnase水解活性：水解RNA雜合體中的RNA
3、 依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補的雙鏈cDNA
用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細胞mRNA，三種都可。
實驗方法如下
http://show.bioon.com/protocol/smallclass.asp?typeid=1724&newstype=RT-PCR
3 質(zhì)粒是染色體外能夠進行自主復制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器和細菌細胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子。現(xiàn)在習慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。許多細菌除了染色體外，還有大量很小的環(huán)狀DNA分子，這就是質(zhì)粒(plasmid)（補充：部分質(zhì)粒為RNA）。質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)粒稱為附加體(episome)，這類質(zhì)粒能夠整合進細菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。
目前，已發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的細菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細菌質(zhì)粒都是閉合環(huán)狀DNA分子(簡稱cccDNA)。細菌質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量一般較小，約為細菌染色體的0.5%～3%。根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小，大致上可以把質(zhì)粒分成大小兩類：較大一類的相對分子質(zhì)量是40×106以上，較小一類的相對分子質(zhì)量是10×106以下(少數(shù)質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量介于兩者之間)。每個細胞中的質(zhì)粒數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的復制特性。按照復制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類：一類是嚴緊型質(zhì)粒，當細胞染色體復制一次時，質(zhì)粒也復制一次，每個細胞內(nèi)只有1～2個質(zhì)粒；另一類是松弛型質(zhì)粒，當染色體復制停止后仍然能繼續(xù)復制，每一個細胞內(nèi)一般有20個左右質(zhì)粒。一般分子量較大的質(zhì)粒屬嚴緊型。分子量較小的質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的復制有時和它們的宿主細胞有關，某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的復制屬嚴緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。
在基因工程中，常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。人工構(gòu)建的質(zhì)粒可以集多種有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點、抗生素耐藥性等。常用的人工質(zhì)粒運載體有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環(huán)素基因(Tcr)和抗氨芐青霉素基因(Apr)，并含有5種內(nèi)切酶的單一切點。如果將DNA片段插入EcoRI切點，不會影響兩個抗生素基因的表達。但是如果將DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切點，就會使抗四環(huán)素基因失活。這時，含有DNA插入片段的pBR322將使宿主細菌抗氨芐青霉素，但對四環(huán)素敏感。沒有DNA插入片段的pBR322會使宿主細菌既抗氨芐青霉素又抗四環(huán)素，而沒有pBR322質(zhì)粒的細菌將對氨芐青霉素和四環(huán)素都敏感。pSC101與pBR322相似，只是沒有抗氨芐青霉素基因和PstI切點。質(zhì)粒運載體的最大插入片段約為10 kb(kb表示為千堿基對)。
4 基因診斷（gene diagnosis）是以探測基因的存在，分析基因的類型和缺陷及其表達功能是否正常，從而達到診斷疾病的一種方法。它是繼形態(tài)學、生物化學和免疫學診斷之后的第四代診斷技術，它的誕生與發(fā)展得益于分子生物學理論和技術的迅速發(fā)展。
常用基因診斷技術：
一、Southern印跡法（Southern blot）
基本原理是：硝酸纖維膜或尼龍濾膜對單鏈DNA的吸附能力很強，當電泳后凝膠經(jīng)過DNA變性處理，覆以上述濾膜，再于其上方壓上多層干燥的吸水紙，借助它對深鹽溶液的上吸作用，凝膠上的單鏈DNA將轉(zhuǎn)移到濾膜上。轉(zhuǎn)移是原位的，即DNA片段的位置保持不變。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，經(jīng)過80℃烘烤的DNA，將原位地固定于膜上。
當含有特定基因片段已原位轉(zhuǎn)移到膜上后，即可與同位素標記了的探針進行雜交，并將雜交的信號顯示出來。雜交通常在塑料袋中進行，袋內(nèi)放置上述雜交濾膜，加入含有變性后探針的雜交溶液后，在一定溫度下讓單鏈探針DNA與固定于膜上的單鏈基因DNA分子按堿基到互補原理充分結(jié)合。結(jié)合是特異的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能結(jié)合上β珠蛋白的探針。雜交后，洗去膜上的未組合的探針，將Ⅹ線膠片覆于膜上，在暗盒中日光進行放射自顯影。結(jié)合了同位素標記探針的DNA片段所在部位將顯示黑色的雜交帶，基因的缺失或突變則可能導致帶的缺失或位置改變。
二、聚合酶鏈反應
近年來，基因分析和基因工程技術有了革命性的突破，這主要歸功于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）的發(fā)展和應用。應用PCR技術可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小時內(nèi)體外擴增數(shù)十萬至百萬倍。擴增的片段可以直接通過電泳觀察，也可用于進一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素提高其敏感性來觀察，而通過擴增至百萬倍后直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷可以縮短至數(shù)小時。
三、擴增片段長度多態(tài)性
小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA的長度多態(tài)性可以通過PCR擴增后電泳來檢出，并用于致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）連鎖分析法。PCR擴增后，產(chǎn)物即等位片段之間的差別有時只有幾個核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用于突變性質(zhì)不明的連鎖分析.
四、等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法
當基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時，可以合成等基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素標記進行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用于探測點突變時一般需要合成兩種探針，與正?；蛐蛄型耆恢?，能與之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正常基因序列穩(wěn)定雜交，這樣，就可以把只有一個堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來.
PCR可結(jié)合ASO，即PCR－ASO技術，即先將含有突變點的基因有關片段進行體外擴增，然后再與ASO探針作點雜交，這樣大大簡化了方法，節(jié)約了時間，而且只要極少量的基因組DNA就可進行。
五、單鏈構(gòu)象多態(tài)性診斷法
單鏈構(gòu)象多態(tài)性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指單鏈DNA由于堿基序列的不同可引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同，從而可用于DNA中單個堿基的替代、微小的缺失或手稿的檢測。用SSCP法檢查基因突變時，通常在疑有突變的DNA片段附近設計一對引物進行PCR擴增，然后將擴增物用甲酰胺等變性，并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構(gòu)象差異將表現(xiàn)為電泳帶位置的差異，從而可據(jù)之作出診斷。
本文地址:http://www.mcys1996.com/cha/27442.html.
聲明： 我們致力于保護作者版權(quán)，注重分享，被刊用文章因無法核實真實出處，未能及時與作者取得聯(lián)系，或有版權(quán)異議的，請聯(lián)系管理員，我們會立即處理，本站部分文字與圖片資源來自于網(wǎng)絡，轉(zhuǎn)載是出于傳遞更多信息之目的,若有來源標注錯誤或侵犯了您的合法權(quán)益，請立即通知我們(管理員郵箱：douchuanxin@foxmail.com)，情況屬實，我們會第一時間予以刪除，并同時向您表示歉意,謝謝!
上一篇: 茶文化的延續(xù)與蝶變
下一篇: 谷雨茶節(jié),
Copyright ? 2023-2024 大道家園 版權(quán)所有
身體不適時請至正規(guī)醫(yī)院就診！勿延誤！站內(nèi)信息時效及準確性不足！部分文章及資料為作者提供或網(wǎng)友推薦收集整理而來，僅供愛好者學習和研究使用，版權(quán)歸原作者所有。
備案號： 陜ICP備2022010374號-1 聯(lián)系方式：douchuanxin@foxmail.com
.png)
展.png)
生.png)
