中藥制劑--酶類制劑

在人類和動植物活的機體中，普遍存在一類特殊蛋白質(zhì)。它們參與生化反應(yīng)，而且使反應(yīng)進行得極快，這類物質(zhì)是天然催化劑－－酶類。酶具有高度專一性和極高的活性，使有機化合物在體內(nèi)以一定的反應(yīng)順序轉(zhuǎn)換。酶是生物細胞合成的，存在于細胞內(nèi)的稱為胞內(nèi)酶；由細胞內(nèi)合成而分泌到細胞外起作用的酶稱作胞外酶。各種動物器官、組織和體液中含有酶的種類和數(shù)量差別甚大。通常所含酶的總量并不很少，但每一種酶的含量卻很少，常在百萬分之幾至百分之幾。因此酶的提取、分離、純化與確認(rèn)要靠較高水平的生物化學(xué)技術(shù)。

酶的發(fā)現(xiàn)是十九世紀(jì)（1833年）有人從麥芽浸液中提得第一個具有活力的蛋白質(zhì)－－淀粉酶。到目前科學(xué)家們已從生物體內(nèi)提純確認(rèn)出八百多種酶。但是應(yīng)用到醫(yī)藥方面作為醫(yī)藥用的酶類制劑不過才有幾十種。然而，祖國醫(yī)藥學(xué)對含酶類藥物的記述確很早，如《藥品化義》中記載：“大麥芽，炒香開胃，以除煩悶；生用力猛，主消麥面食積，癥瘕氣結(jié)，胸膈脹滿，郁結(jié)痰涎，小兒傷乳，又能行上焦滯血。若女人氣血壯盛，或產(chǎn)后無兒飲乳，乳房脹痛，丹溪用此二兩，炒香搗去皮為末，分作四服立消，其性氣之銳，散血行氣，迅速如此，勿輕視之”。又如《本草蒙荃》中記載：牛肚“健脾胃，免飲積食傷”等等。由于受技術(shù)限制，而未能進一步提純?nèi)胨帯５纱苏f明，酶類制劑與中藥己早有淵源關(guān)系，現(xiàn)在我們討論酶類制劑，也可認(rèn)為是中藥制劑的發(fā)展。

酶類制劑的分類

酶制劑按其臨床應(yīng)用來分類，主要有以下幾種：

消化類：這類酶研究最早，是品種最多的一類酶。它們的作用是消化和分解食物中各種成分，如淀粉、脂肪、蛋白質(zhì)等使變成比較簡單的物質(zhì)，便利腸胃道的吸收。當(dāng)體內(nèi)消化系統(tǒng)失調(diào)，消化液分泌不足時，服用這一類酶就能夠補充和糾正體內(nèi)消化酶的不足，恢復(fù)正常消化機能。在這一類酶中主要有胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纖維素酶、木瓜酶、凝乳酶、無花果酶、菠蘿酶等。

抗炎凈創(chuàng)類：這一類酶是目前在治療上發(fā)展最快，用途最廣的一種。這種酶大多數(shù)都是蛋白質(zhì)水解酶，能夠分解發(fā)炎部位纖維蛋白的凝結(jié)物，消除傷口周圍的壞疽、腐肉和碎屑。其中有些酶能夠分解膿液中的核蛋白使成簡單的嘌呤和嘧啶，降低膿液的粘性、達到凈潔創(chuàng)口、消除癡皮、排除膿液抗炎消腫的目的。在這一類酶中，主要有胰蛋白酶、糜蛋白酶、雙鏈酶，α一淀粉酶、胰脫氧核糖核酸酶等。給藥的方法有外敷、噴霧、灌注、注射、口服等。它們可以單獨使用，也可以與抗菌素等合用，治療各種潰瘍、炎癥、血腫、膿胸、肺炎、支氣管擴張、氣喘等癥。

血凝和解凝類：這一類酶都是從血液中提取出來的，有的能促使血液凝固，有的卻能溶解血塊。凝血酶的作用是促使血中纖維蛋白元變成不溶性纖維蛋白,從而促使血液凝固，防止微血管出血。纖維蛋白溶解酶的作用是溶解血塊，為目前臨床上最新的一種酶制品…… 治療血栓靜脈炎、冠狀動脈栓塞等。

解毒類：這一類酶的主要作用是解除體內(nèi)或因注射某種藥物產(chǎn)生的一種有害物質(zhì)。主要品種有青霉素酶、過氧化氫酶和組織胺酶等。青霉素酶能夠分解青霉素分子中的β一內(nèi)酰胺環(huán)，使變成青霉噻唑酸，消除因注射青霉素引起的過敏反應(yīng)。

診斷類：這一類酶是用作臨床上各種生化檢查的試劑，幫助臨床診斷。最常用的有葡萄糖氧化酶，β一葡萄糖苷酸酶和尿素酶。如尿素酶是測定血液中尿素的濃度和尿中尿素的含量的，從而可檢查腎功能。

酶制劑的一般提取方法:

酶的制備一般包括三個基本步驟，即提取、純化和結(jié)晶（或制劑）。首先將所需要的酶從原料中引入溶液，此時不可避免地要夾帶著一些雜質(zhì)，而后再將酶從溶液中選擇地分離出來，或者從酶溶液中選擇地除去雜質(zhì)，最后制成純凈的酶制劑。

1）酶的提取

胞外酶可以直接進行提取分離；胞內(nèi)游離存在的“離酶”以及與顆粒體（如細胞核、線粒體、微粒體、質(zhì)膜）結(jié)合的“結(jié)酶”都有一個破碎細胞過程，“結(jié)酶”還有一個轉(zhuǎn)變成水溶液的問題。因此對酶類的提取要采用多種方法，常用的細胞破碎法如下：

機械法：如絞碎、刨碎、勻漿、研磨、擠壓或超聲波等。研磨時還可加入細砂、石英粉、氧化鋁等以利細胞破碎。

化學(xué)法：用鹽、堿、表面活性劑、EDTA、丙酮和正丁醇等可使細胞破碎、顆粒體結(jié)構(gòu)解體，從而把酶釋放出來。例如常將胰臟用數(shù)倍量丙酮處理2～3次，制成丙酮粉供多種酶的提取用；用膽酸鹽處理膜結(jié)構(gòu)上的脂蛋白和“結(jié)酶”，使兩者形成復(fù)合物，并帶上靜電荷，由于電荷之間的排斥作用，使膜破裂，達到溶解。

酶解法：用組織自溶或用溶菌酶、脫氧核糖核酸酶、磷脂酶等降解細胞膜結(jié)構(gòu)，然后再進行提取。但應(yīng)知道組織自溶法對某些酶的提取是不利的，如胰蛋白是以酶原形式純化后再激活成胰蛋白酶的，若用自溶法提取，酶原已轉(zhuǎn)成酶，純化就很困難。而用純的工具酶降解法是無此缺點，但成本較高。

凍融法：采用反復(fù)冷凍與融化時由于細胞中形成了冰晶及剩余液體中鹽濃度的增高可以使細胞破裂。

酶的提取溶劑可以用水、一定濃度的乙醇、乙二醇、丁醇和稀鹽溶液、緩沖溶液等；也可以用稀堿或稀酸溶液，如用稀硫酸提取胰蛋白酶，用稀鹽酸提取胃蛋白酶。溶劑用量一般為原料重量的1～5倍。攪拌可加速提取，但轉(zhuǎn)速不宜太快，否則會產(chǎn)生泡沫而難以過濾或使酶變性。多數(shù)酶的提取要在50C以下操作，但有的酶在較高溫度下提取更好，如胃蛋白酶在450C提得收率較高，一般可在一5～＋400C間適當(dāng)選擇。提取液的pH應(yīng)在酶的穩(wěn)定pH范圍內(nèi)，并應(yīng)遠離其等電點的pH為宜，如蛋白酶選用pH 2．5～3，0，胰蛋白酶和α一糜蛋白酶則用0．25 N硫酸提取。若在中性或堿性提取時，最常用的是0．15 mol/L氯化鈉、0.02～0．05mol/L磷酸緩沖液、0．02-0.05 mol/L焦磷酸緩沖液。正丁醇的親脂性強，能透入酶的脂質(zhì)結(jié)合物中，又兼有親水性，有類似表面活性劑的作用，適用于提取“結(jié)酶”。

為了減少提取液體積，可用多段逆流提取或柱型抽提法。液渣分離可用過濾法(如板框壓濾、旋轉(zhuǎn)真空過濾）或離心法。過濾時可加硅藻土、紙漿等為助濾劑。離心時可加入氫氧化鋁凝膠、磷酸鈣凝膠等以除去懸浮的膠體物質(zhì)。

2)酶液的濃縮

提取的酶液為減少純化操作容積，通常先進行濃縮。工業(yè)上可用真空減壓濃縮、薄膜濃縮、冷凍濃縮和逆向滲透作用進行濃縮。對于少量酶液下述方法濃縮更合適：

用葡聚糖凝膠（分子篩）濃縮：取相當(dāng)于酶液量1/5的干葡聚糖凝膠G15或G25，分次加入酶液中，攪拌30 min，使凝膠吸水膨脹，進行吸濾。經(jīng)重復(fù)數(shù)次操作即可在短時間內(nèi)把酶液濃縮至所需的體積。也可將酶液裝于透析袋內(nèi)，埋入干凝膠中，袋內(nèi)酶液也可得到濃縮。

用聚乙二醇濃縮：將稀酶液裝入透析袋內(nèi)，袋外復(fù)以聚乙二醇，袋內(nèi)水份被袋外的聚乙二醇所吸收，在短時間內(nèi)可以達到濃縮的目的，得到所需的濃酶液。

用超濾法濃縮：超濾技術(shù)在其可篩分范圍內(nèi)分離酶分子時不發(fā)生“相態(tài)”變化，可以避免酶蛋白變性，且分離度快，所以愈來愈被廣泛采用。各種不同孔徑的超濾膜，適用于實驗室規(guī)模及一定工業(yè)規(guī)模的酶液濃縮。如國產(chǎn)二醋酸纖維素制成10～200?？讖降某瑸V膜，用于實驗室規(guī)模固氮酶液的脫鹽和濃縮，效果良好。

3）雜質(zhì)的去除

酶提取液中常含有雜蛋白、多糖、脂類及核酸等雜質(zhì)，可用下述方法去除：

調(diào)PH和加熱法：利用蛋白質(zhì)對酸、堿和熱變性方面性質(zhì)的差異，可去除非活性雜蛋白。如制備脂肪酶時，在pH 3、4時以400C溫度加熱150 min，淀粉酶活力可喪失90%而被除去，而脂肪酶活力仍保持80％以上。

蛋白質(zhì)表面變性法：蛋白質(zhì)表面變性后其性質(zhì)有所不同，借以去除雜蛋白。如制備過氧化氫酶時，加入氯仿和乙醇進行振蕩可以將雜蛋白變性而去除。。

蛋白質(zhì)沉淀劑法：利用醋酸鋁、利凡諾、單寧酸、離子型表 面活性劑等蛋白質(zhì)沉淀劑可以去除雜蛋白及粘多糖類雜質(zhì)。使用時要注意這類試劑?？梢鹈缸冃允Щ?，因此應(yīng)迅速除去。

選擇性變性法：各種蛋白質(zhì)對變性劑的穩(wěn)定性不同，可以用選擇性變性劑去除雜蛋白。如細胞色素丙對三氯醋酸較穩(wěn)定，所以在制備時可用2．5%三氯醋酸使其他雜蛋白變性使 沉淀除去。。

加保護劑熱變性法：酶與底物或競爭性抑制劑結(jié)合后，其穩(wěn)定性常顯著增加。所以常用它們?yōu)楸Ｗo劑，再用一些劇烈手段破壞雜蛋白，如用D-甲基苯甲酸為D-氨基酸氧化酶的保護劑，經(jīng)加熱除去雜蛋白，使該酶得到很好的提純。

核酸沉淀劑法：酶液中的核酸類雜質(zhì)，可以用氯化錳、魚精蛋白硫酸鹽等沉淀劑使其沉淀而除去。必要時，也可用核糖核酶將核酸降解后除去。

4)酶的純化

酶是蛋白質(zhì)，因此凡用于蛋白質(zhì)的純化手段均適用于酶的純化，如鹽析法、聚乙二醇沉淀法、有機浴劑分級沉淀法、等電點法、選擇性沉淀法、各種柱層析法（吸附層析、離子交換層析、凝膠過濾）、各種電泳法及親和層析等。不同之處是酶的純化過程尚需選用迅速簡便的活力測定方法，以追蹤酶的去向。在選用酶的活力測定方法時，分析方法的迅速要比其精確度更為重要。如寧可要一個需時5min，準(zhǔn)確度為5%的方法；也不要一個需時30 min，準(zhǔn)確度為0．5%的方法。在建立活力測定法之后，再根據(jù)各單元純化步驟及活力分布情況用列表形式表達，表的內(nèi)容包括：操作步驟、總體積、酶濃度（每毫升酶活力）、總活力、蛋白質(zhì)濃度mg/ml）、比活力（即純度、酶活力單位/毫克蛋白）、產(chǎn)率%（每步總活力除以第一步的總活力）和純化倍數(shù)（每步比活力除以第一步比活力）。

一個典型的酶純化過程常包括多個單元

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