茶樹多酚氧化酶研究進展

摘要：多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,PPO)是茶樹(camellia sinensis)中普遍存在的一種酶，是紅茶制作中品質(zhì)形成的關(guān)鍵酶類。多酚氧化酶可催化氧化兒茶素類物質(zhì)形成茶黃素類(TFs)色素，而后者對紅茶色、香、味等品質(zhì)形成具有關(guān)鍵作用。

關(guān)鍵詞：紅茶；茶黃素；多酚氧化酶

多酚氧化酶是一類末端氧化酶，酶分子由主酶和金屬輔基組成。多酚氧化酶在自然界中分布極廣，廣泛存在于植物體內(nèi)，能夠催化氧化多酚類物質(zhì)生成醌，在茶樹生理代謝及茶葉加工等過程中對產(chǎn)品品質(zhì)形成有極為重要的作用，也是植物葉子、果實等褐變的主要作用酶類。茶樹多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)的研究始于19世紀末20世紀初。茶樹PPO分子量大小為144000±16000，最佳底物為鄰苯二酚，適宜的pH范圍為5～7，最適pH值為5.7(以鄰苯二酚為底物)嘲。多酚氧化酶以其在紅茶加工中的重要作用受到廣泛關(guān)注和研究。本文就多酚氧化酶的分類、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因結(jié)構(gòu)、功能等方面闡述多酚氧化酶的相關(guān)研究。

1 多酚氧化酶的分類

根據(jù)多酚氧化酶催化底物的不同，多酚氧化酶分為單酚氧化酶(酪氨酸酶，tyrosinase，EC.1.14.18.1)、雙酚氧化酶(兒茶酚氧化酶，catchol-oxidase，E C.1.10.3.1)和漆酶(laccase，EC.1.10.3.2)等。多酚氧化酶的共同特征是能夠通過有氧氧化酚或多酚類物質(zhì)生成其對應(yīng)的醌同。酪氨酸酶可有氧催化單羥基酚生成二醌。兒茶酚氧化酶可有氧催化鄰苯二酚生成二醌。漆酶有氧催化苯酚或?qū)Ρ椒由蓪Ρ锦?。酪氨酸酶和漆酶主要存在于微生物中，兒茶酚氧化酶則主要分布在植物中。酪氨酸酶活性中心有2個Cu2+，與周圍N原子和O原子形成3種不同的狀態(tài)，催化氧化過程分兩步：首先使單酚及其衍生物鄰位羥基化，生成鄰二酚及其衍生物；二是氧化鄰二酚及其衍生物生成相應(yīng)的醌。漆酶的催化氧化作用主要表現(xiàn)在使底物生成自由基和酶分子中Cu2+的協(xié)同傳遞電子和價態(tài)變化。漆酶的催化底物范圍很廣，可以催化單酚、三酚、鄰酚和對位二酚。此外，漆酶還可催化氧化維生素C、對苯二胺爭屹。酪氨酸酶和漆酶工程菌已得到成功構(gòu)建并表達。

兒茶酚氧化酶通常被稱作多酚氧化酶(PPO)，普遍分布于植物體各器官和組織內(nèi)。其含量和活性隨植物體的生長而不斷變化，分子量大小也因植物種類不同，同一種植物的部位不同、同一部位的多基因家族的控制成員不同而不同，且受植物生長條件的影響，具有空間和時間特異性。

按溶解狀態(tài)茶葉PPO分為游離態(tài)和束縛態(tài)兩大類。前者主要存在于細胞液中，為可溶態(tài)；后者較前者多而且主要存在于葉綠體、線粒體等細胞器中，并與這些細胞器膜特異結(jié)合，為不溶態(tài)。

2 多酚氧化酶的細胞學(xué)定位

PPO是一種質(zhì)體酶，存在于光合植物葉綠體類囊體以及非光合植物的質(zhì)體類囊體中，如根細胞質(zhì)體、表皮細胞質(zhì)體、胚軸細胞質(zhì)體、頂端組織細胞質(zhì)體等。在光合組織部位中，PPO定位于葉綠體類囊體膜上；在非光合組織部位中，PPO定位于各種質(zhì)體的囊泡中。但具有質(zhì)體的組織細胞也可能不存在PPO，或者無PPO活性，例如在C4植物葉中，只在葉肉組織中探測到PPO活性，維管束鞘細胞盡管葉綠體豐富，卻檢測不到PPO活性。

3多酚氧化酶酶源及其同工酶

Tanaka T．等研究多種供試材料后發(fā)現(xiàn)這些材料勻漿液均可氧化EC和EGC形成茶黃素，其中枇杷、日本梨和藍梅合成茶黃素的能力比茶葉強。吳紅梅用不同材料和不同方法提取PPO并制取茶色素發(fā)現(xiàn)，茶、蘋果、梨的PPO制取茶色素效果為佳。李適用毛栓菌PPO氧化兒茶素，產(chǎn)物中酯型茶黃素比例較高閻。趙淑娟進行微生物菌種篩選后得到一株產(chǎn)PPO菌株，對其進行發(fā)酵試驗測得其酶活為256U/mL。

茶葉PPO同工酶的研究始于20世紀六七十年代。Buzun等通過聚丙烯酸胺凝膠電泳分離出了6種PPO組分，并測算出其分子量剛。安徽農(nóng)學(xué)院從福鼎大白茶等材料中分離出PPO同工酶6～7條，它們均可促進鄰苯二酚氧化，對表沒食子兒茶素沒食子酸酯、鄰苯二酚氧化最為顯著閻。劉仲華等從茶鮮葉中分離得到六條同工酶帶，按照遷移率由小到大排列依次為PP01—PP06，其中PP02、PP04、PP06對多酚類敏感性較強，而PPO1、PP03、PPO5對多酚類敏感性不強。在催化兒茶素氧化聚合形成茶黃素(TFs)的過程中，各同工酶所起作用由大到小依次為：PPO1、PP03、PPO5、PP02、PP04、PP06。PPO1不僅熱穩(wěn)定性好，也成為最終唯一殘留的PPO組分閉。葛超等研究發(fā)現(xiàn)不同品種梨的PPO同工酶的帶數(shù)、遷移率和區(qū)帶染色情況也存在差異。王坤波研究發(fā)現(xiàn)不同來源PPO同工酶的酶帶相似，但酶帶數(shù)目、Rf值及分子量均有差異：梨有11條同工酶帶，蘋果4條，茶葉5條，蘑菇5條，而漆酶只有1條。酶帶Rf值集中在0.40—0.70；茶葉PPO同工酶的相對分子量大于94kDa。并分析比較得出不同來源PPO合成茶黃素能力由大到小為：梨PPO，茶葉PPO，微生物PPO，蘋果PPO，漆酶PPO，蘑菇PPO。在所有供試梨品種中，豐水梨PPO同工酶譜帶最多，酶活性最大，合成茶黃素的能力最強閉。

4多酚氧化酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

現(xiàn)有研究表明PPO定位于質(zhì)體膜上。PPO首先在細胞質(zhì)中合成含有轉(zhuǎn)運肽（導(dǎo)肽）的前體肽，導(dǎo)肽引導(dǎo)PPO進入質(zhì)體后被切除，PPO成為有活性的成熟蛋白。導(dǎo)肽通常位于N末端，含有80~90個氨基酸，蛋白酶切割的位點一般是丙氨酸一絲氨酸或丙氨酸一丙氨酸之間。導(dǎo)肽N端含大量的親水性氨基酸殘基，C端約有50%疏水氨基酸殘基。在PPO的C端非編碼區(qū)還含有一些糖類，可能對維持PPO的正確構(gòu)象起作用。植物PPO具有高度的同源性，功能活性部位都有兩個富含組氨酸(His)的銅離子結(jié)合區(qū)(CuA和CuB)，CuA區(qū)和CuB區(qū)各有3個保守的His，通過配位鍵形成特定的空間三維結(jié)構(gòu)。Klabunde對成熟PPO進行晶體衍射研究印證了銅離子與組氨酸共價結(jié)合，其中H88.H109.H218與CuA共價結(jié)合，CuB與Hzlo.H244.H274共價結(jié)合。

5多酚氧化酶的基因結(jié)構(gòu)

借助基因工程技術(shù)對PPO基因研究至今，番茄、蠶豆、煙草、甘蔗、杏、美洲商陸、葡萄、日本梨、桃等的PPO基因已被克隆。對已克隆的植物PPO基因分析發(fā)現(xiàn)PPO是由核基因編碼表達，多基因控制的蛋白酶，具有基因家族的特性。大多PPO由多個基因編碼，多則6～7個基因，少則2—3個。但對葡萄PPO基因研究發(fā)現(xiàn)，葡萄PPO是由單個基因編碼表達。趙東以已發(fā)表的PPO基因中的保守序列設(shè)計引物克隆得到茶樹PPO基因部分序列，發(fā)現(xiàn)茶樹PPO基因與其它植物的PPO基因同源性較高，尤其是銅結(jié)合部位序列基本一致。

與其他真核基因不同，已克隆的番茄、蠶豆、煙草、甘蔗、杏、美洲商陸、葡萄、日本梨、桃等的PPO基因均不含內(nèi)含子。陳忠正等以英紅9號茶葉為材料，克隆得到PPO基因全長序列，發(fā)現(xiàn)茶樹PPO基因也沒有內(nèi)含子。郝欣以福鼎大白等茶葉為材料，分別從基因組DNA和RNA人手，克隆得到PPO基因全長序列，兩種產(chǎn)物的核酸序列一致，同樣說明茶樹PPO基因不含內(nèi)含子網(wǎng)。但研究發(fā)現(xiàn)香蕉、菠蘿等PPO基因中有小片段內(nèi)含子。

6 多酚氧化酶的生理功能

6.1 多酚氧化酶與紅茶品質(zhì)的關(guān)系

PPO作為紅茶發(fā)酵中的關(guān)鍵酶，對茶葉品質(zhì)的形成至關(guān)重要，對茶葉適制性有很大的影響。茶葉中PPO含量高、活性大，有利于紅茶品質(zhì)形成與積累，適制紅茶；反之則適制綠茶。紅茶在發(fā)酵過程中利用茶葉自身酶系發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)，形成紅茶特有的色、香、味。綠茶加工需要殺青，要高溫使PPO迅速失活，失去酶促氧化功能以生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)綠茶；而在紅茶加工中則需要PPO充分發(fā)揮其酶促氧化功能，催化兒茶素類物質(zhì)氧化形成茶色素類物質(zhì)。兒茶素類底物氧化觸發(fā)了一些香氣前體物質(zhì)的偶聯(lián)氧化，生成各種各樣的香氣成分，從而形成紅茶特有的品質(zhì)。

竹尾忠一研究紅茶制造中PPO的活性變化后發(fā)現(xiàn)鮮葉中PPO活性在茶葉萎凋過程中逐漸增加，酶活性隨萎凋溫度提高而有較快增長。不論輕萎凋或重萎凋，PPO活性均有快速增加。但另有研究表明PPO活性隨茶鮮葉的失水而活性降低，適當補充水分后，PPO活性又得到恢復(fù)。劉仲華等研究發(fā)現(xiàn)，PPO活性隨萎凋過程中茶葉失水而提高，含水量為65%左右時活性達到頂峰，但進一步過度萎凋使PPO活性降低?？傊?，萎凋過程中PPO活性的提高有重要的意義，是紅茶制作工序中的關(guān)鍵步驟。

紅茶發(fā)酵過程中添加外源PPO可提高發(fā)酵葉中的PPO活性，有利于紅茶的發(fā)酵，提高茶黃素含量，改善紅茶湯色，增加紅茶香氣。七十年代開始，國內(nèi)外利用PPO加速茶葉發(fā)酵制作高品質(zhì)速溶紅茶并取得顯著效果。馬鈴薯、無花果、葡萄甚至是某些種屬的真菌中的PPO應(yīng)用到紅茶制造中也均有利于紅茶茶黃素的積累，使紅茶茶湯顏色加深，香氣加高，品質(zhì)得到相應(yīng)提高。在黑茶和白茶加工中PPO均進行了不同程度的催化反應(yīng)，有利于形成各自特有的品質(zhì)特征。

應(yīng)用茶鮮葉勻漿懸浮發(fā)酵工藝生產(chǎn)紅茶，在發(fā)酵方式上較傳統(tǒng)發(fā)酵工藝有所變化。夏濤研究茶鮮葉勻漿懸浮發(fā)酵后發(fā)現(xiàn)，懸浮發(fā)酵中PPO活性受到抑制，但仍能正常催化兒茶素類底物生成茶黃素類物質(zhì)。懸浮發(fā)酵體系中添加有機溶劑可增加溶氧，明顯促進PPO氧化兒茶素類底物生成茶黃素。

6.2 多酚氧化酶的其他功能

光合植物中PPO定位于葉綠體類囊體膜上，由此推測PPO可能與植物光合作用有關(guān)，PPO可能對光合作用進行反向調(diào)節(jié)并參與構(gòu)成電子傳遞鏈和能量轉(zhuǎn)換[44,45]。通過對金魚草素合成酶的研究發(fā)現(xiàn)，金魚草素合成酶以查耳酮為特異底物，催化生成橙酮，而后者是花色素形成的主要原因，金魚草素合成酶與PPO的結(jié)構(gòu)極為相似，由此推測PPO可能參與花色素的形成。此外有研究表明PPO還與植物體中乙烯的形成等生長發(fā)育過程有關(guān)。

PPO參與植物體的損傷免疫應(yīng)答。植物組織受損傷時，PPO增加表達量，與酚類底物作用生成酮，酮與蛋白質(zhì)共價結(jié)合降低了親核氨基酸的營養(yǎng)供應(yīng)能力，從而可抵御病蟲危害，促進傷口的愈合。但PPO在病蟲害等傷害中的作用機制尚未完全闡明，有待深入研究。此外，對真菌的PPO研究后發(fā)現(xiàn)，真菌PPO可以降解木質(zhì)素，聚合木質(zhì)素的氧化產(chǎn)物。

7展望

作為紅茶制造中的關(guān)鍵酶類，PPO對紅茶品質(zhì)的形成有至關(guān)重要的作用。選擇PPO含量高、活性高的茶葉資源生產(chǎn)紅茶，有利于提高紅茶的品質(zhì)，拓展紅茶市場。國內(nèi)外嘗試紅茶制造中添加外源PPO對紅茶發(fā)酵進行改善并取得了重要進展。速溶紅茶制作時，添加PPO可提高紅茶制取率，增加可溶性物質(zhì)的含量，減輕紅茶的苦澀味，顯著提高了速溶紅茶的品質(zhì)。茶黃素作為紅茶中的主要品質(zhì)因子，在抑菌、抗病毒、降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化、抗突變、抗衰老、抗癌防癌等方面也卓有成效，已有抗齲齒牙膏等多種產(chǎn)品面市。但由于茶葉本身PPO含量不高，生產(chǎn)的紅茶中茶黃素含量也相應(yīng)較低，而且提取制備復(fù)雜，產(chǎn)品純度低、成本高，難以規(guī)?；a(chǎn)。如何以兒茶素類物質(zhì)為原料，篩選活性高的PPO應(yīng)用于紅茶生產(chǎn)、茶黃素合成、速溶茶生產(chǎn)，具有重要的實際意義。

基因工程技術(shù)的發(fā)展和茶葉研究的深入使得二者能夠結(jié)合起來。應(yīng)用基因工程技術(shù)，克隆高活性的PPO基因，構(gòu)建表達工程菌，獲得工程蛋白酶，應(yīng)用于紅茶生產(chǎn)，有利于提高紅茶品質(zhì)，而且可廣泛應(yīng)用于紅茶加工、茶黃素生產(chǎn)等方面，這也將推動我國紅茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

應(yīng)用基因工程技術(shù)可獲得茶樹優(yōu)良種質(zhì)資源。黃建安等采用PCR-SSCP分析與個體DNA測序相結(jié)合的方法研究茶樹PPO基因，并對酶切位點變異作進一步的PCR-RFLP分析，探討了SNP與茶樹品種適制性及遺傳背景的關(guān)聯(lián)性，并指出HpaⅡ酶切位點在引物L7/L8擴增區(qū)段多態(tài)性較豐富，適制紅茶的品種多為AA基因型，此位點能被HpaⅡ完全酶切?；蛑亟M技術(shù)促進了PPO基因的克隆與體外表達。番茄、蘋果的PPO基因在大腸桿菌中已得到表達，但表達產(chǎn)物不具有活性。李桂琴等對鴨梨PPO基因編碼區(qū)序列進行了克隆及表達，表達產(chǎn)物具有酶活性，但活性較低。其原因可能有：一是由于大腸桿菌自身的保護機制，自身的蛋白酶將外源表達蛋白視為異物而將其降解，導(dǎo)致無目的蛋白積累；二是PPO活性的發(fā)揮需要銅離子結(jié)合并形成正確的三維結(jié)構(gòu)，但由原核表達系統(tǒng)缺乏翻譯后加工過程，表達的蛋白并未正確折疊，而是形成包含體，導(dǎo)致酶的活性比較低。此外，在原核表達系統(tǒng)DNA轉(zhuǎn)錄、翻譯過程中稀有密碼子缺少、堿基錯配、突變等原因均有可能造成蛋白無表達或無活性。吳貽良用成熟PPO基因構(gòu)建表達載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后得到部分可溶性蛋白，但大部分為不可溶蛋白，將蛋白復(fù)性后，所得酶活為20.12U/mg;又把成熟PPO基因分別克隆人非分泌型載體pPICZA和分泌型載體pPICZaA，在畢赤酵母GS115表達后測其酶活分別為29.12U/mg和26.92U/mg閣。因此，如何獲得高表達高活性的PPO基因，如何解決原核表達系統(tǒng)的包含體問題，以及如何提高PPO基因體外表達蛋白的活性是未來研究的核心問題。

相比較常規(guī)游離酶制劑，固定化酶技術(shù)有著顯著的優(yōu)越性：穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、經(jīng)濟實用等。國內(nèi)外固定化PPO的方法主要有包埋法和吸附一交聯(lián)法等。在優(yōu)質(zhì)紅茶、茶黃素生產(chǎn)中，為了更有效地利用PPO，PPO固定化研究也將受到越來越多的關(guān)注。

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