RAPD分子標(biāo)記及其在油茶遺傳育種研究中的應(yīng)用（綜述）

小小茶農(nóng) 2023-11-20 09:45:01

RAPD分子標(biāo)記及其在油茶遺傳育種研究中的應(yīng)用（綜述）

分子標(biāo)記是一種新型的遺傳標(biāo)記，為林木遺傳育種研究提供了新的手段

，并在縮短育種周期

、提高育種效益等方面展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景

。本文介紹了RAPD分子標(biāo)記原理

、特點(diǎn)及其在油荼遺傳育種研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀與前景

。

完成機(jī)構(gòu)：中南林業(yè)科技大學(xué)國家林業(yè)局經(jīng)濟(jì)林育種與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長沙410004

王世偉的主要研究成果

1.Shi-Wei Wang

，Min Wang．Breeding of NHase hyper-producing Rhodococcus ruber strain LUV30-06 and Verification of mutants by RAPD．The　6th International Conference on Bioinformatics and Biomedical Engineering (iCBBE2012)

，Shanghai

，China. (2012) 4：486-490．（EI）
2.Shiwei Wang

，Qinghui Wang，Ying Zhai1，Min Wang．Screening of NHase high-producing Rhodococcus ruber Strain TQD-58 by Both Parents Inactivated Protoplast Fusion．2012 International Symposium on Information Technology in Medicine and Education(ITME2012), Hokkaido

，Japan.(2012)：737-740 (EI)．
3.Shiwei Wang

，Yujie Dai，Jianxin Wang

，Yanbing Shen

，Heng Zheng，Min Wang．Title: Molecular insights into substrate specificity of Rhodococcus ruber CGMCC3090 by Gene Cloning and Homology Modeling．Enzyme and Microbial Technology (accepted

，SCI)．
4.王世偉;王敏.腈類物降解菌多樣性和產(chǎn)腈水合酶研究進(jìn)展,中國生物工程雜志,2011,31(9):117-123
5. 王世偉

，楊曉杰，王中革

，楊小花

，李旭業(yè)，馮檸

，RAPD分子標(biāo)記對高粱DNA經(jīng)花粉管導(dǎo)入玉米自交系的驗(yàn)證

，齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) 2011，27（1）：54-60
6.劉軍,王世偉,趙凱,周東坡,白蟻的生物防治現(xiàn)狀與研究進(jìn)展, 微生物學(xué)雜志,2010 (2):91-94
7. 王世偉

，姜麗娟

，李旭業(yè)，外源DNA經(jīng)花粉管通道法導(dǎo)入玉米及后代分子驗(yàn)證研究進(jìn)展

，高師理科學(xué)刊

，2010，30（2）：76-80
8.王世偉

，李旭業(yè)

，張偉偉.優(yōu)化感受態(tài)細(xì)胞制備方法提高轉(zhuǎn)化效率的研究.齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009

，25（2）:86-90
9.王世偉

，張偉偉，劉軍等.基因與細(xì)胞工程大實(shí)驗(yàn)教學(xué)體系的建立與實(shí)踐.高師理科學(xué)刊

，2008（5）:118-120
10.王世偉

，馬璽，平文祥等.微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇研究進(jìn)展.微生物學(xué)通報(bào)

，2007

，34（3）:561-565
11.王世偉，董原

，李鐵等.一種適合抗癌藥紫杉醇產(chǎn)生菌AFLP分析的DNA提取方法.高師理科學(xué)刊. 2006

，26（1）:561-565
12．王世偉，王福全

，馬璽等.杉醇產(chǎn)生菌及其工程菌株之間的AFLP遺傳差異分析.生物技術(shù). 2004

，15（3）:15-17
13．齊小輝，馬璽，趙凱

，王世偉等.線粒體DNA及其應(yīng)用. 生物技術(shù)通訊. 2004

，14（5）413-415
14．馬玉超，趙凱

，王世偉等.產(chǎn)紫杉醇(Taxo1)內(nèi)生真菌的生物多樣性.菌物研究. 2003

，1（1）: 28-32
15．張鵬，王世偉

，解玉紅等.紫杉醇產(chǎn)生菌的細(xì)胞總核酸提取. 生物技術(shù). 2003

，13（2）:21-23
16．王世偉，齊小輝

，劉軍等. (2003) AFLP技術(shù)在微生物分類鑒定

、基因標(biāo)定及遺傳多樣性方面的應(yīng)用. 生物技術(shù).13（5）:42-43

遺傳作圖的DNA分子標(biāo)記

DNA 分子標(biāo)記大多是以DNA片段電泳譜帶形式表現(xiàn)的。依其遺傳特性可分為顯性和共顯性標(biāo)記2種

；依多態(tài)性檢測手段可分為以Southern雜交技術(shù)為核心的分子標(biāo)記和以PCR技術(shù)為核心的分子標(biāo)記

；根據(jù)在基因組中出現(xiàn)的頻率，又可分為低拷貝序列和重復(fù)序列標(biāo)記

。
限制性片段多態(tài)性
RFILP是第—種用于研究的DNA標(biāo)記

。限制性核酸內(nèi)切酶是一種在特定序列上切割DNA分子的酶，用它處理一個(gè)DNA分子時(shí)

，即產(chǎn)生限制片段

。這種序列特異性意味著用一種限制酶處理一種DNA分子總會產(chǎn)生同樣的片段。但對于基因組DNA來說

，并不總是這樣

。這是因?yàn)橛行┫拗莆稽c(diǎn)具多態(tài)性，以兩種等位形式存在

。一種等位形式有正確的限制位點(diǎn)序列

，能被酶切開；另一等位形式的序列有改變

，從而該限制位點(diǎn)不能被識別

。后者的結(jié)果是在核酸內(nèi)切酶處理后，兩個(gè)相鄰的限制片段仍然連接在一起

，從而導(dǎo)致了長度多態(tài)性（如圖1）

。這就是一個(gè)RFLP的例子。如同用基因作為標(biāo)記一樣

，RFLP在基因組圖譜上的位置可以通過追蹤其等位基因的遺傳而得到

。人類基因組中大約有100000個(gè)RFLP，但是理所應(yīng)當(dāng)?shù)拿總€(gè)RFLP只能有兩種等位形式（有或沒有這個(gè)位點(diǎn)）

，這就限制了RFLP在人類基因作圖上的應(yīng)用價(jià)值，因?yàn)橐粋€(gè)家庭的所有成員很可能都是某一個(gè)RFLP的純合子。（簡單來說

，它不能區(qū)分純合子和雜合子）

。
隨機(jī)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性標(biāo)記
（Random Amplified Polymorphic DNA ，RAPD)RAPD技術(shù)是由Williams等首先創(chuàng)立的一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)

，利用單一的10個(gè)堿基寡核苷酸作為引物

，對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA序列多態(tài)性

。
擴(kuò)增片段長度多態(tài)性
（Amplified Fragment Length Polymorphism

，AFLP)AFLP是Zeabeau 等（1993）發(fā)明的一項(xiàng)技術(shù)，它既有RFLP的可靠性

，又有RAPD的方便性

。其基本原理是通過PCR 擴(kuò)增基因組DNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物的變性聚丙烯酰胺電泳顯示擴(kuò)增片段長度多態(tài)性

，其中引物=接頭+酶切位點(diǎn)+2～3個(gè)核苷酸

。
AFLP技術(shù)分析流程：⑴DNA 模板制備；⑵提取樣本DNA 經(jīng)濃度和質(zhì)量檢測后

，一般采用雙酶（EcoRI和MSEI或PstI或TaqI）酶切

，在基因組DNA上產(chǎn)生低頻和高頻切口；⑶選擇性擴(kuò)增酶切片段

。酶切后

，限制性片段在T4連接酶作用下與特定接頭連接，形成帶有接頭的特異性片段

；⑷PCR前擴(kuò)增

，一般用帶一個(gè)選擇性引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，反應(yīng)條件與常規(guī)PCR反應(yīng)基本一致

；⑸利用放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記PCR 引物

；⑹在Taq聚合酶作用下完成94 ℃變性30s ，65 ℃淬火30s

，72 ℃延伸60s

，PCR擴(kuò)增36個(gè)循環(huán)；⑺PCR產(chǎn)物在含尿素聚丙烯酰胺上電泳

；⑻將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)移到吸附濾紙上

，經(jīng)干膠儀進(jìn)行干膠處理；⑼在X光片上感光

，數(shù)日后沖洗膠片并進(jìn)行結(jié)果分析

。
AFLP反應(yīng)起始一般高溫復(fù)性（一般65 ℃），因此只有那些與3’端嚴(yán)格配對的片段才能得到擴(kuò)增

，選擇性很強(qiáng)

。實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定

，重復(fù)性好，呈典型的孟德爾式遺傳

，每個(gè)AFLP可以獲得50～100條譜帶信息

，多態(tài)性強(qiáng)。
微衛(wèi)星
（Microsatellite）微衛(wèi)星是指以幾個(gè)（1～6 bp) 核苷酸為單位

，多次串聯(lián)重復(fù)序列

，也稱之為簡單重復(fù)序列（single sequence repeats ，SSR）

、短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats

，STR）或簡單序列長度多態(tài)性（single sequence length polymorphism ，SSL P）

。廣泛分布于真核生物基因組中

，大約每隔10～50bp就有一個(gè)微衛(wèi)星，由于重復(fù)次數(shù)和重復(fù)程度的不完全而造成每一個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性

。
單核苷酸多態(tài)性
（Single Nucleotide Polymorphism

，SNP）基因組中存在單個(gè)的點(diǎn)突變，且數(shù)量極大

，有些也對產(chǎn)生RFLP

，但許多并個(gè)能。這是囪為它們所處的序列不能被限制件內(nèi)切核酸酶所識別

。在人類基因組中

，據(jù)認(rèn)為有200000個(gè)以上的SNP(single nucleotidc polymorphism）位干基因內(nèi)．而且有更多的SNP位于非基因的DNA中。
每個(gè)SNP只有兩個(gè)等位基因

，所以這些標(biāo)記在人類繪制遺傳圖譜方面又與RFLP同樣的缺點(diǎn)：對于一個(gè)SNP

，很可能—個(gè)家族的所有成員都是純合子。SNP的優(yōu)點(diǎn)是它數(shù)目龐大

，而且對SNP分型所用的方法不需凝膠電泳

。這非常重要，因?yàn)橐炎C明凝膠電泳很難實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化

，所以使用它的檢測方法相對緩慢而且費(fèi)力

。由于SNP以寡核苷酸雜交分析（oligonucleotide hybidization analysis）為基礎(chǔ)，故其檢測更快速

。寡核苷酸是在試管中合成的通常小于50個(gè)核苷酸的短單鏈DNA分子

。在適當(dāng)?shù)臈l件下，一個(gè)寡核苷酸與另一個(gè)DNA分子僅在可形成完全的堿基配對結(jié)構(gòu)時(shí)才能雜交

。如果有一個(gè)錯(cuò)配

，寡核昔酸上就有一個(gè)位置不能形成堿基對。則不能雜交（圖1）

。因此寡核苷酸雜交能區(qū)分一個(gè)SNP的兩個(gè)等位基因

。篩選策略包括：
DNA芯片（DNA chip）技術(shù)
DNA芯片是一塊面積為2cm平方或更小的硅片

，以高密度排列方式攜帶有許多不同的寡核苷酸。待測DNA用熒光標(biāo)記后加到芯片的表面

。用熒光顯微鏡觀察雜交情況

，顯示熒光信號的位置即表示該處的寡核苷酸與待測DNA發(fā)生了雜交。因此一個(gè)實(shí)驗(yàn)中可以量化許多SNP

。
動(dòng)態(tài)等位基因特異的雜交（dynamic allele-specific hybridization,DASH) 在這種技術(shù)中，雜交在溶液中進(jìn)行

，比如在96孔微量滴定板的一個(gè)孔中進(jìn)行G熒光標(biāo)記只能與雙鏈DNA結(jié)合

，因此只有發(fā)生了雜交才能檢測到信號。開始

，雜交在允許有錯(cuò)配的條件下進(jìn)行

。在這個(gè)階段，無論待測DNA含有哪一種SNP等位基因

，寡核苷酸都能與之雜交

。由于錯(cuò)配的雜交產(chǎn)物不如完全雜交產(chǎn)物穩(wěn)定，故在較低溫度解鏈．因此可以通過升高溫度來區(qū)分等位基因

。這樣就可以從使雜交依賴性熒光信號消失的溫度來判定待測DNA中存在哪一種等位基因

。

利用RAPD可以鑒定兩個(gè)物種嗎
？又是怎樣鑒定的？

可以

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA( RAPD) （ random amplified polymorphic DNA ）和任意引物 PCR(AP-PCR) （ arbitrary primer PCR ）

RAPD （ random amplified polymorphic DNA ）是 1990 年美國杜邦公司科學(xué)家 J. G. K. Williams 和加利福尼亞生物研究所 J. Welsh 領(lǐng)導(dǎo)的兩個(gè)小組幾乎同時(shí)發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)

。 Williams 稱之為 RAPD （ random amplified polymorphic DNA ）

， Welsh 稱之為 AP-PCR （ arbitrary primer PCR ）。 RAPD 技術(shù)建立在 PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上

，它是以任意序列的寡核苷酸單鏈 ( 通常為 10 個(gè)堿基

， AP-PCR 則為 20 ～ 30 個(gè)堿基 ) 為引物，對所研究的基因組 DNA 進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增

。 RAPD 所用的一系列引物的 DNA 序列各不相同

，但對于任一引物，它同基因組 DNA 序列有特定的結(jié)合位點(diǎn)

。這些特定的結(jié)合位點(diǎn)在基因組某些區(qū)域內(nèi)的分布如符合 PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件

，即在一定范圍內(nèi)模板 DNA 上有與引物互補(bǔ)的反相重復(fù)序列時(shí)，就可擴(kuò)增出此范圍的 DNA 片段

。在不同物種基因組 DNA 中

，這種反相重復(fù)序列的數(shù)目和間隔的長短不同，就可導(dǎo)致這些特定的結(jié)合位點(diǎn)分布發(fā)生相應(yīng)的變化

，而使 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物增加

、減少或發(fā)生分子量的變化

。通過對 PCR 產(chǎn)物的檢測和比較，即可識別這些物種基因組 DNA 的多態(tài)片段

。

與常規(guī) PCR 相比

， RAPD 主要有以下特點(diǎn)： ① 無需專門設(shè)計(jì) RAPD 擴(kuò)增反應(yīng)的引物，也無需預(yù)知被研究的生物基因組核苷酸順序

，引物是隨機(jī)合成或是任意選定的

。引物長度一般為 9 ～ 10 個(gè)寡核苷酸。 ② 每個(gè) RAPD 反應(yīng)中

，僅加單個(gè)引物

，通過引物和模板 DNA 鏈隨機(jī)配對實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，擴(kuò)增沒有特異性

。 ③ 退火溫度較低

，一般為 36℃ ，這能保證短核苷酸引物與模板的穩(wěn)定配對

，同時(shí)也允許了適當(dāng)?shù)腻e(cuò)誤配對

，以擴(kuò)大引物在基因組 DNA 中配對的隨機(jī)性。 ④ 較之常規(guī) PCR

， RAPD 反應(yīng)易于程序化

。利用一套隨機(jī)引物，得到大量 DNA 分子標(biāo)記

，可以借助計(jì)算機(jī)進(jìn)行系統(tǒng)分析

。

該方法已被廣泛用于遺傳指紋作圖、基因定位

、系統(tǒng)進(jìn)化以及動(dòng)植物

、微生物物種及中藥材的鑒定等各個(gè)領(lǐng)域。在生藥鑒定方面

，該方法在人參及其偽品

、甘草、黃連

、冬蟲夏草及其偽品

、貝母等藥材的鑒定中有應(yīng)用。

/static/upload/image/2023/1120/domain_profile.cfm id='檉柳科的研究成果'>檉柳科的研究成果

中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所完成的《檉柳科植物研究》項(xiàng)目通過了專家鑒定

?div id="4qifd00" class="flower right">

？蒲腥藛T在檉柳科植物的屬、種劃分

，系統(tǒng)與演化研究等方面取得突破性進(jìn)展

，闡明了檉柳科屬植物的分布格局與環(huán)境的關(guān)系，建成世界上第一個(gè)檉柳科植物種質(zhì)資源庫

。他們還提出檉柳科植物保護(hù)策略

，成功克隆出3個(gè)具有獨(dú)立自主知識產(chǎn)權(quán)的抗旱基因

，為新疆的生態(tài)建設(shè)提供了檉柳苗木及檉柳栽培育苗技術(shù)。
專家認(rèn)為

，其研究成果對檉柳科植物生物多樣性保護(hù)

、可持續(xù)利用、干旱區(qū)退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)與重建及科學(xué)管理具有重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義

。其研究思路與方法對干旱區(qū)其他植物資源研究與保護(hù)利用也有借鑒作用

。
以中國科學(xué)院新疆生地所尹林克研究員為項(xiàng)目組長的“檉柳科植物研究及生物多樣性保護(hù)”成果通過新疆自治區(qū)科技廳組織的專家鑒定。
該項(xiàng)目由四個(gè)相關(guān)課題組成：國家自然科學(xué)面上基金項(xiàng)目“中國檉柳科植物的及生物多樣性保護(hù)”

；中國科學(xué)院“西部之光”人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目“檉柳科植物的系統(tǒng)演化與應(yīng)用研究”

；中國科學(xué)院生物區(qū)系特別支持費(fèi)項(xiàng)目“檉柳科系統(tǒng)學(xué)研究及中國檉柳科分類學(xué)修訂”；中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所領(lǐng)域前沿項(xiàng)目“檉柳抗?jié)B透脅迫的分子機(jī)理研究”

。
該項(xiàng)目針對檉柳科植物的系統(tǒng)學(xué)研究及生物多樣性保護(hù)，做了大量的理論與應(yīng)用研究

。首次采用多學(xué)科相互印證和?div id="m50uktp" class="box-center"> ？茖傧到y(tǒng)研究相結(jié)合的方法，解決了檉柳科系統(tǒng)學(xué)研究中長期存在的科學(xué)爭議

，在屬

、種的劃分，系統(tǒng)與演化研究等方面取得了突破性進(jìn)展

。闡明了檉柳屬植物的分布格局與環(huán)境的關(guān)系

，首次利用RAPD分子標(biāo)記的方法分析了剛毛檉柳9個(gè)居群遺傳變異式樣及空間分布格局，提出基因流的隔離是造成遺傳分化的驅(qū)動(dòng)力

。
建成了世界上第一個(gè)檉柳科植物種質(zhì)資源庫

，是世界上收集檉柳科植物種數(shù)最多的專類園；首次構(gòu)建了白花檉柳的抑制性消減雜交文庫

；成功克隆出三個(gè)具有獨(dú)立自主知識產(chǎn)權(quán)的抗旱基因

。首次基于檉柳科植物的分布、基因交流能力