早生優(yōu)質(zhì)茶樹品種資源篩選及RAPD分子標記分析

早生優(yōu)質(zhì)茶樹品種資源篩選及RAPD分子標記分析

對12份茶樹種質(zhì)資源材料進行RAPD分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以將它們分為4組,其中日本引進茶種的有性后代4個株系JP1～JP4與福鼎、烏牛早、浙農(nóng)139的遺傳距離接近。對12份種質(zhì)材料的營養(yǎng)芽物候期和生化成分進行比較鑒定,篩選出發(fā)芽早且茶多酚、氨基酸、咖啡堿含量較高的株系JP-1、JP-3、J-2及J-3,可以作為進一步開發(fā)研究早生、優(yōu)質(zhì)茶樹品種的育種材料;J-1、J-2和JP-4咖啡因含量較低,是培育低咖啡因茶樹品種的良好素材;S-1和S-2是培育高兒茶素品種的良好材料。

完成機構(gòu)：[1]聊城大學食品科學與工程系,山東聊城252059 [2]浙江大學茶學系,浙江杭州310029

花椰菜種質(zhì)資源的創(chuàng)新是怎樣的？

（一）廣泛引進國外花椰菜雜交品種自交分離創(chuàng)新種質(zhì)資源

鑒于目前國內(nèi)花椰菜種質(zhì)資源貧乏的現(xiàn)狀，直接從國外引進優(yōu)良一代雜種，通過自交分離、純化，從中篩選出優(yōu)良的種質(zhì)資源，是最經(jīng)濟、有效的獲得新種質(zhì)的方法。目前國內(nèi)花椰菜育種單位利用該方法已分離了大批新的種質(zhì)資源和自交系，并利用這些種質(zhì)資源選育出許多優(yōu)良的花椰菜新品種，如白峰、津雪88、云山1號、豐花60、廈花6號等目前生產(chǎn)上推廣的絕大多數(shù)品種。

（二）種內(nèi)雜交創(chuàng)造新類型

甘藍類蔬菜的不同亞種或變種間很容易雜交，因此可以通過種內(nèi)雜交方法，創(chuàng)造優(yōu)異的種質(zhì)資源甚至創(chuàng)造新的物種。孫德嶺等（2002）采用花椰菜（白菜花）與青花菜、花椰菜與紫花菜、紫花菜與青花菜之間雜交。其后代花球的單球重大大提高，接近于花椰菜，色澤介于父本和母本之間，而維生素C的含量接近青花菜，比花椰菜提高22%～60.6%，全糖含量比青花菜增加9.8%～33.1%（表11-1），口味甜脆，品質(zhì)和口感都優(yōu)于其父本和母本，通過進一步選育有望選育出新的花椰菜類型，為花椰菜家族增加新的成員。

表11-1 花椰菜新類型全糖、維生素C含量

（三）生物技術與花椰菜種質(zhì)資源創(chuàng)新

常規(guī)育種在花椰菜種質(zhì)資源創(chuàng)新方面起了很大的作用，但通常存在能穩(wěn)定遺傳的有益基因狹窄或缺乏；多數(shù)有益基因是由許多微效基因控制，且該類基因選擇較困難以及基因型差異難以確定等問題。隨著生物技術的發(fā)展，在傳統(tǒng)育種工作的基礎上，可以提高育種的針對性，克服常規(guī)育種中一些難于解決的問題，進一步拓寬有益種質(zhì)資源的創(chuàng)新和利用。目前已經(jīng)有越來越多的研究者注重應用生物技術進行種質(zhì)資源的創(chuàng)新。

1.細胞工程與花椰菜種質(zhì)資源創(chuàng)新

（1）花藥培養(yǎng)和游離小孢子培養(yǎng)技術 20世紀60年代初，Guha和Maheshwari開創(chuàng)了花藥培養(yǎng)誘導單倍體的方法。此后花藥培養(yǎng)成為誘導單倍體的重要途徑之一，并且在作物育種中得到應用。在花椰菜上，王懷名（1992）對嫩莖花椰菜花藥和花粉培養(yǎng)中的胚胎發(fā)生進行了研究，觀察了花藥中花粉粒發(fā)育成胚狀體的過程和再生植株染色體倍性。張小玲（2002）等研究認為，磁場預處理可明顯提高花藥培養(yǎng)愈傷組織的誘導率。陳國菊（2004年）以5個花椰菜品種為材料進行花藥培養(yǎng)，獲得再生植株，并得到了種子。

由于花藥培養(yǎng)的方法不能排除再生植株來自體細胞的可能性，多年來使花藥培養(yǎng)獲得再生植株的研究進展緩慢。而采用游離小孢子培養(yǎng)的方法可以很好地解決這一難題，因此，游離小孢子培養(yǎng)的方法獲得再生植株越來越受到重視。目前該技術已陸續(xù)在蕓薹屬的大白菜、不結(jié)球白菜、結(jié)球甘藍、芥藍、抱子甘藍、羽衣甘藍、大頭菜、葉芥、蕪菁甘藍和花椰菜等蔬菜上獲得成功。北京農(nóng)林科學院蔬菜研究工程中心、河南農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所、天津科潤蔬菜研究所等單位先后開展了花椰菜游離小孢子培養(yǎng)工作，初步建立了花椰菜游離小孢子培養(yǎng)技術體系，在一些品種中獲得了花椰菜DH株系，培育出花椰菜優(yōu)良新品種。

通過游離小孢子培養(yǎng)可快速、有效地獲得DH純系。DH株系具有穩(wěn)定的遺傳特性，并能從親本獲得隨機排列的配子，由于游離小孢子培養(yǎng)能快速純合雜合親本，因此對由多基因控制的特異性狀的篩選能一步到位，明顯提高了選擇幾率，加快育種進程。耿建峰等（2002）利用游離小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生的兩個自交不親和系配制出具有早熟、耐熱、花球潔白、品質(zhì)好和抗病性強等綜合性狀優(yōu)良的花椰菜DH雜交種“豫雪60”，孫德嶺（2002）對引進的國內(nèi)外育種資源材料461份，利用游離小孢子培養(yǎng)和常規(guī)技術相結(jié)合進行種質(zhì)資源的創(chuàng)新和對DH株系材料進行評價及鑒定，選育出“津品50”。

游離小孢子培養(yǎng)技術也被應用于蕓薹屬遠緣及種間雜交育種中。石淑穩(wěn)等（1993）分別從甘藍型油菜與諸葛菜的屬間雜種，甘藍型油菜與白菜型油菜、甘藍型油菜和芥菜型油菜的種間雜種獲得游離小孢子胚和再生植株，為蕓薹屬植物遠緣及種間雜交育種建立了種質(zhì)資源創(chuàng)新的途徑。

（2）原生質(zhì)體融合技術 原生質(zhì)體融合也稱體細胞融合，是兩種原生質(zhì)體的雜交，它不是雌雄配子間的結(jié)合，而是具有完整遺傳物質(zhì)的體細胞之間的融合，它可打破種間、屬間存在的性隔離和雜交不親和性，從而廣泛地聚合各種優(yōu)良的基因，使變異幅度顯著增大，創(chuàng)造新的種質(zhì)資源。因而此項技術越來越受到遺傳育種學家的重視。自Carlson等在1972年獲得第一株煙草體細胞雜種植株以來，該技術體系不斷完善和發(fā)展，在許多物種上細胞融合獲得成功。20世紀80年代中期已報道有15個種內(nèi)組合，38個種間組合，13個屬間組合獲得體細胞雜種植株，到90年代，通過體細胞雜交技術又添加了再生植株的種內(nèi)雜種14個，種間雜種62個，屬間雜種47個，并有2個科間組合的胞質(zhì)雜種分化獲得再生植株。在十字花科蕓薹屬中已獲得融合雜種植株有：擬南芥油菜、甘藍油菜、甘藍+白菜型油菜、白菜型油菜+花椰菜。

原生質(zhì)體融合技術與常規(guī)有性雜交的差別在于：體細胞雜交中沒有減數(shù)分裂，有兩個二倍體的細胞原生質(zhì)體融合產(chǎn)生出四倍體的雜種植株，而用同樣的親本有性雜交則只產(chǎn)生二倍體雜種。

原生質(zhì)體融合可以獲得細胞質(zhì)雜種，為培育細胞質(zhì)雄性不育、抗除草劑等花椰菜品種提供了一條育種新途徑。目前，通過有性雜交、回交轉(zhuǎn)育的花椰菜細胞質(zhì)雄性不育類型主要是Ogura胞質(zhì)雄性不育類型和Polima胞質(zhì)雄性不育類型。而利用常規(guī)育種轉(zhuǎn)育年限一般需要6～11年，利用原生質(zhì)體融合技術轉(zhuǎn)移細胞質(zhì)雄性不育基因可以克服有性回交轉(zhuǎn)育所帶來的年限長或雜交不親和等問題，為花椰菜雜種優(yōu)勢的有效利用開辟了新的途徑?；葜久鳎?005）進行了利用原生質(zhì)體融合技術向花椰菜轉(zhuǎn)移Ogura蘿卜胞質(zhì)雄性不育的研究，獲得了花椰菜與Ogura蘿卜胞質(zhì)甘藍型油菜種間體細胞雜種植株。由此可見，原生質(zhì)體融合技術已經(jīng)應用于花椰菜不育性的研究領域，已獲得了大量的雄性不育轉(zhuǎn)育植株，是一條培育雄性不育新種質(zhì)行之有效的途徑。

通過原生質(zhì)體融合可以克服遠緣雜交不親和性，轉(zhuǎn)移野生品種的抗逆性。花椰菜生產(chǎn)中常常遭受病蟲害的威脅，而現(xiàn)有育種材料中存在的抗病、抗逆基因，由于長期的人工培育定向選擇已日益狹窄，遠不能滿足進一步提高品種對病害及逆境多抗性的需要。增強對野生材料優(yōu)異抗性基因的利用，是進一步創(chuàng)新育種基礎材料的有效途徑。蔬菜野生類型在長期自然選擇下形成了高度的抗病性，通過與野生類型進行遠緣雜交，可以大幅度提高現(xiàn)有品種的抗病性和抗逆性，但是遠緣雜種通常表現(xiàn)不親和性，嚴重限制了其在品種改良中的應用。利用原生質(zhì)體融合技術得到的不對稱雜種可以克服遠緣雜交不親和性轉(zhuǎn)移野生種抗性。姚星偉（2005）利用原生質(zhì)體非對稱融合技術向花椰菜中轉(zhuǎn)移野生種抗逆性狀（供體Brassica spinescens具有光合效率高，抗白銹病、蚜蟲、黑斑病和耐鹽等優(yōu)良特性），試驗共獲得17株雜種，其抗逆性在進一步鑒定中?？梢钥闯?，育種工作者越來越重視野生資源的發(fā)掘利用，生物技術中的細胞工程與分子生物學手段相結(jié)合是現(xiàn)階段利用野生資源的有效途徑。

利用原生質(zhì)體融合技術可以轉(zhuǎn)移某些品種優(yōu)良品質(zhì)性狀，為改良花椰菜的營養(yǎng)品質(zhì)提供新的途徑。蔬菜的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)一直是人們所追求的目標。P.S.Jourdan（1989）利用花椰菜與具有除草劑抗性的Brassica napus進行原生質(zhì)體融合試驗，獲得了具有高抗除草劑特性的雜種植株。B.Navratilove等（1997）以花椰菜和抗根瘤病的Armoracia rusticana為試驗材料，利用原生質(zhì)體融合技術，獲得了花椰菜與Armoracia rusticana體細胞雜種植株。Hu（2002）用Brassica napus和具有亞油酸和軟脂酸含量高的Orychophragmus violaceus進行體細胞融合試驗，通過原生質(zhì)體融合試驗得到的雜種植株不但亞油酸和軟脂酸含量升高，而且芥子酸的含量明顯下降，顯著改善品種品質(zhì)。

2.分子標記技術與花椰菜種質(zhì)資源創(chuàng)新

利用易于鑒定的遺傳標記輔助選擇是提高選擇效率和降低育種盲目性的重要手段。近20年迅速發(fā)展起來的分子標記技術給作物育種提供了新的途徑。運用DNA分子標記可以進行早期選擇，提高選擇的準確度和育種效率，有助于縮短育種周期。

（1）利用分子標記技術篩選自交不親和系 自交不親和性是高等植物為實現(xiàn)異花授粉受精和遺傳重組而形成的一種重要的遺傳特性，國內(nèi)外學者對自交不親和性的遺傳機制做了大量研究。據(jù)Lewis（1979）報道，已在74個科的被子植物中發(fā)現(xiàn)了自交不親和性。國內(nèi)利用分子標記技術篩選自交不親和系的研究也有所報道，黃聰麗（2001）應用RAPD分析方法，得到了與花椰菜自交不親和性相關的差異片段。宋麗娜（2005年）運用RAPD和ISSR分子標記技術，分離到鑒別自交不親和性的連鎖標記。

（2）利用分子標記技術鑒定抗病種質(zhì)資源 張峰（1999）利用AFLP技術在一對花椰菜抗、感黑腐病的近等基因系中篩選到4個與抗黑腐病基因緊密連鎖的標記。劉松（2002）用天津科潤蔬菜研究所抗黑腐病近等位基因系C712和C731作為材料，篩選出與花椰菜抗黑腐病基因RXC連鎖的RAPD標記OP224/1600，將其轉(zhuǎn)化成更加穩(wěn)定的SCAR標記，可快速準確篩選抗病材料。古瑜（2007年）以花椰菜抗病和感病近等基因系為實驗材料，對花椰菜抗病和感病近等基因系基因組進行了ISSR分析，得到3個與抗病基因有關的分子標記ISSR11000、ISSR21500和ISSR18700，可進一步應用于分子標記輔助育種。此外，利用cDNA-AFLP技術對致病菌脅迫的花椰菜抗黑腐病系進行差異表達分析，初步得到一個與抗黑腐病相關的基因片段，并證實該片段是受誘導的與誘導系統(tǒng)抗性（ISR）信號傳導有關的基因片段。此外，利用同源序列候選基因法和NBS profiling方法，在抗病系中得到2個抗病基因同源序列RGA330-7和NBS5-100，序列分析表明這兩個片段可能與花椰菜抗黑腐病基因有關。進一步將兩個RGA推測的蛋白序列與7個已知植物抗病基因的蛋白序列進行比較，構(gòu)建了分子進化樹。聚類結(jié)果表明，本研究得到的兩個RGA片段應屬于non-TIR-NBS-LRR型。最后，利用表觀遺傳學的分析方法，對致病菌脅迫前后基因組中胞嘧啶甲基化水平和甲基化模式的變異進行分析，從基因表達調(diào)控的角度探討了抗黑腐病的分子機制。

（3）利用分子標記技術檢測遺傳變異 突變既可以發(fā)生在整個基因組，也可以發(fā)生于特定的基因或基因簇、結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因，以及單個核苷酸等。突變既可以自發(fā)也可以人工誘變在不用誘變劑處理的培養(yǎng)植物細胞中，突變體頻率一般為10-5～10-8，用誘變劑處理，可增至10-3，但誘變劑常會引起育性降低等副作用。Leroy（2000，2001）等利用花椰菜下胚軸進行組織培養(yǎng)，用ISSR方法檢測了愈傷組織形成過程、胞增殖過程以及成苗后的再生植株等各階段的植株間多態(tài)性，認為組織培養(yǎng)誘導的再生植株具有遺傳多態(tài)性，證明組織培養(yǎng)可誘發(fā)與篩選遺傳變異。

（4）利用分子標記技術篩選花椰菜雄性不育種質(zhì)資源 植物雄性不育是一種不能產(chǎn)生有活力花粉的遺傳現(xiàn)象，在植物界中廣泛存在，目前已在43科162個屬320個種的617個品種或種間雜種中發(fā)現(xiàn)了雄性不育現(xiàn)象，它在作物雜種優(yōu)勢利用上具有重要價值。

Chunguo Wang（2006）以花椰菜雄性不育品種NKC-A和恢復系NKC-B為材料，利用引物P6+/P6-進行PCR擴增，發(fā)現(xiàn)了一條300bp的差異片段，此片段可以作為鑒別雄性不育系的分子標記。王春國（2005）利用同源序列的候選基因法，通過檢索NCBI核酸以及蛋白數(shù)據(jù)庫，獲得花椰菜kndx612細胞質(zhì)雄性不育相關的基因或開放讀碼框，初步結(jié)果顯示試驗所用不育花椰菜胞質(zhì)亦可能為Ogura型，為進一步從分子水平研究和利用花椰菜雄性不育基因提供了條件。

（5）花椰菜遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及在育種中的應用 遺傳連鎖圖譜是指以染色體重組交換率為相對長度單位，以遺傳標記為主體構(gòu)成的染色體線狀連鎖圖譜，分子標記遺傳連鎖圖表示各標記所對應的DNA片段在染色體上的相對位置，是分子標記運用于作物遺傳育種的基礎，構(gòu)建分子標記連鎖圖的理論基礎是染色體的交換和重組。自1986年以來，主要農(nóng)作物都已建立了以RFLP為主的分子遺傳圖譜，分子標記連鎖圖，是進行基因定位、基因克隆、輔助選擇進行作物設計育種的技術平臺。在遺傳學理論、功能基因組學以及遺傳育種等領域已顯示出了十分重要的作用。

Li（2001年）等利用SRAP、AFLP技術對86個羽衣甘藍×花椰菜的RI作圖，此圖由130個SRAP標記和120個AFLP技術構(gòu)成，這些標記非常平均地分布在9個連鎖群，覆蓋2165cM。古瑜（2007年）利用AFLP和NBS profiling兩種方法，以花椰菜品種間雜交F2代為作圖群體，構(gòu)建了第一張花椰菜遺傳連鎖圖譜。該圖譜包括9個連鎖群，連鎖群的總長度為668.4cM，相鄰標記間的平均圖距為2.9cM，在所包含的234個AFLP標記和21個NBS標記中NBS標記分布于8個連鎖群且在基因組中成簇排列。該圖譜通過提供可能的抗性基因位點，對進一步得到抗性基因很有幫助。同時研究RGA在整個花椰菜基因組中的分布與組成，也為了解抗性基因的分布與演化提供參考。進一步可用于分子標記輔助育種。

（6）花椰菜不同花色種質(zhì)資源的創(chuàng)新 近年來，利用基因工程技術已經(jīng)獲得了許多傳統(tǒng)園藝技術難以獲得的新品種，如紫色、白色以及紫白相嵌的3種不同顏色的矮牽?；?。而這些技術通常要求對相關基因有所了解，以獲得目的基因的cDNA，然后將這些外源基因?qū)肽繕酥参镏?，達到改變花色、花型等目的。Crisp等利用遺傳上一致的白色花球品種和綠色品種雜交，從雜交后代遺傳表現(xiàn)提出一種模型：Wiwi基因控制白色對黃色是顯性，非獨立共顯性基因gr1gr2表現(xiàn)為綠色。Dickson報道了在埃及引進的花椰菜品種PI 183214，即便完全暴露于陽光下，花球也是純白色的。并認為是由2或3對顯性基因控制的。Singh等報道了由兩對基因控制的可以遮蓋住花球的葉片，以防止陽光照射引起的花球變色。李凌等（2000）對花椰菜黃花和白花的近等基因系進行了研究，篩選到了一個白花株系的特異帶，通過Northern點雜交初步鑒定其為白花株系所特有，同時利用Smart cDNA-AFLP銀染技術對花椰菜黃花近等基因系的mRNA進行了分析，其中2對引物的3條帶在2個表達基因文庫之間存在多態(tài)性，其中一條與白花品系共分離；篩選到一條白花株系的差異片段，本研究為克隆與花色相關基因奠定了基礎。

3.轉(zhuǎn)基因技術與花椰菜種質(zhì)資源創(chuàng)新

轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展對加速創(chuàng)新花椰菜種質(zhì)資源具有重要意義。目前，已育成一大批雄性不育、抗病、抗蟲、品質(zhì)優(yōu)良的花椰菜新品種，并產(chǎn)生了很大的社會和經(jīng)濟效益。

（1）花椰菜雄性不育種質(zhì)資源創(chuàng)新 近年，花椰菜雄性不育研究取得了進展，已從中找出一些與不育相關的基因或者嵌合體。這對進一步闡明花椰菜雄性不育發(fā)生的分子機理，指導新不育系的培育打下了基礎。Bhalla（1998）把與花粉相關的基因Bcp1整合到質(zhì)粒PBI101中，通過根瘤農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)入花椰菜子葉中，獲得了50%花粉不育的花椰菜不育新種質(zhì)。

（2）花椰菜抗病蟲種質(zhì)資源創(chuàng)新 在花椰菜抗病基因的克隆和轉(zhuǎn)移方面也有報道，張桂華等（2001）以花椰菜栽培品種“春秋”為試驗材料，在攜帶CaMV Bari-1基因Ⅵ的根瘤農(nóng)桿菌菌種GV3101的介導下，獲得了經(jīng)篩選轉(zhuǎn)化的花椰菜轉(zhuǎn)基因幼苗，為培育抗花椰菜花葉病毒型品種提供可能。

花椰菜轉(zhuǎn)基因抗蟲研究中最常用的外源基因有兩種：內(nèi)毒素（Bt）基因和豇豆胰蛋白酶抑制劑（CpTI）基因，這兩種基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入花椰菜中，為利用轉(zhuǎn)基因技術創(chuàng)新花椰菜種質(zhì)資源提供了寶貴經(jīng)驗。

華學軍（1992）、蔡榮旗（2000）、徐淑平（2002）、周煥斌（2003）等都利用農(nóng)桿菌介導將Bt基因轉(zhuǎn)入花椰菜中，成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株。

CpTI基因?qū)儆贐owman-birk型絲氨酸蛋白酶抑制劑，能抑制包括鱗翅目、鞘翅目、直翅目等多種害蟲中腸中胰蛋白酶的活性，具有廣譜抗蟲性。呂玲玲（2004）通過根瘤農(nóng)桿菌介導，將豇豆胰蛋白酶抑制劑（CpTI）基因整合到花椰菜植株的基因組中，對鱗翅目蟲害青蟲的生長發(fā)育有一定的抑制作用。徐淑平（2002）用根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法將Bt基因和豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI）導入花椰菜，獲得了轉(zhuǎn)基因花椰菜植株。Ding（1998）等利用農(nóng)桿菌介導，從當?shù)馗适碇蟹蛛x得到的抗蟲基因TI轉(zhuǎn)入花椰菜中，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株比對照植株抗蟲效果明顯。

（3）與花椰菜花球性狀有關的突變基因的研究進展 Bowman（1993）等首先在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了花球突變體cauliflower。隨后Kempin SA（1995）等從擬南芥中分離得到兩個與花的分生組織活性有關的CAULIFLOWER和APETALA1基因，研究表明：其功能為轉(zhuǎn)錄因子。同時對花椰菜栽培種中該基因的同源基因研究發(fā)現(xiàn)：花椰菜中其同源基因是無功能的。這暗示了花椰菜肉質(zhì)花序形態(tài)的形成機理與該基因密切相關。Purugganan（2000）等研究了野生型和栽培型花椰菜中CAL基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)野生型和栽培型CAL基因存在差異，栽培型花椰菜中該基因的第五個外顯子有一個等位基因位點發(fā)生了突變。Lee B.Smith（2000）以BoCAL和BoAP1兩個隱性等位基因在特殊位點上的分離為切入點，研究了花椰菜花球的起源和進化過程，得到花球發(fā)育的遺傳模式，認為：BoCAL-a等位基因與離散花序的形態(tài)之間存在很強的相關性。以上的結(jié)果都表明：CAL基因的突變抑制花分生組織發(fā)育，這是花椰菜花球形成的遺傳基礎。趙升等（2003）、曹文廣（2003）、李小方（2000）通過把甘藍BoCAL基因轉(zhuǎn)入花椰菜中，轉(zhuǎn)基因花椰菜不能形成花球，證實外源基因BoCAL能夠部分補償花椰菜BobCAL基因功能的喪失，部分恢復花椰菜的花球表型。因此可以通過控制BoCAL基因的突變程度和基因的表達水平，調(diào)節(jié)花球的發(fā)生時間和發(fā)育速度，從而為培育結(jié)球緊實度高的花椰菜新品種提供新的途徑。

在生產(chǎn)實際中，花球采收后，其內(nèi)源激素和營養(yǎng)成分的變化造成內(nèi)在品質(zhì)逐漸降低，嚴重的影響產(chǎn)品的商品性和食用的營養(yǎng)價值?；ㄇ虻乃ダ鲜紫瘸霈F(xiàn)在萼片的葉綠素喪失。乙烯的合成與葉綠素的喪失以及隨后的黃化成因果關系。ACC氧化酶（ACO）是乙烯合成的一個限速酶，并且ACO基因的表達調(diào)控著乙烯的生成速率。從基因上對ACO基因的表達進行調(diào)控，可延緩乙烯的生成，這已經(jīng)在許多作物上獲得成功。陳銀華（2005年）根據(jù)親緣關系較近的幾種作物ACC氧化酶氨基酸序列，設計一對簡并引物，從花椰菜基因組中獲得長1202bp的候選片段，并獲得花椰菜抗衰老的新材料。

[羊草分子生物學研究進展] 分子生物學教材

　　摘　要：羊草是一種優(yōu)質(zhì)牧草。對發(fā)展我國優(yōu)質(zhì)草地畜牧業(yè)具有重要意義，以往研究對羊草生物學以及生理生態(tài)學進行了比較深入的探討，但對于羊草分子生物學的研究起步較晚，進展也比較緩慢，近年來，隨著分子生物學研究手段和技術的進步，以及羊草遺傳改良的需要，人們在羊草遺傳多樣性、愈傷組織培養(yǎng)、酶蛋白分析以及基因克隆與轉(zhuǎn)化等研究領域陸續(xù)開展了一些有益的嘗試，并取得了重要的研究成果，結(jié)合科研工作的需要，對羊草分子生物學的最新進展進行了概述，并就亟需解決的問題進行了分析，提出了該領域今后的發(fā)展方向。
　　關鍵詞：羊草；分子生物學；遺傳多樣性；組織培養(yǎng)；基因克隆
　　中圖分類號：S543.901　文獻標識碼：A　文章編號：1007-7847(2007)04-0289-06
　　
　　羊草(Leymus chinensis)是多年生禾本科賴草屬草本植物，由于其環(huán)境適應性較強。具有耐寒、耐旱、耐鹽堿等優(yōu)點而成為松嫩平原的優(yōu)勢物種，同時羊草也是一種重要的牧草資源，蛋白質(zhì)含量高，適口性好，耐踐踏，在發(fā)展草原畜牧業(yè)方面具有重大的經(jīng)濟和社會效益，但羊草種子發(fā)芽率低、種子萌發(fā)最適pH值為8.0～8.5，加上過變放牧和草地鹽堿化日益加重等原因，我國現(xiàn)存系統(tǒng)管理重點實驗室項目(K09M6)羊草草地約有90％以上發(fā)生了不同程度的退化，因此，研究羊草的遺傳分化、抗逆機理、栽培育種以及轉(zhuǎn)基因等對于改善生態(tài)環(huán)境和草場建設具有重要意義，隨著分子生物學對各個學科的交叉滲透，使羊草的研究從細胞水平進一步深入到分子水平，羊草屬于異交植物，物種趨向于在種群中具有較高水平的變異性，僅在松嫩草原中西部靠近內(nèi)蒙古高原東部草原上的羊草種群就數(shù)以千計，這為研究羊草種群的遺傳多樣性提供了對象，培養(yǎng)愈傷組織是進行羊草轉(zhuǎn)基因研究的前期工作，但誘導率低的問題尚未得到解決，筆者結(jié)合自己的科研工作，對羊草分子生物學領域的研究成果加以綜述，旨為羊草抗逆分子機理研究提供參考資料。
　　
　　1　羊草遺傳多樣性研究
　　
　　由于羊草生態(tài)適應性強、分布范圍廣、生境類型多樣，在長期的適應和進化過程中，羊草種群之間在形態(tài)、生理、生態(tài)以及遺傳特征方面均產(chǎn)生了趨異，RAPD(randomly amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態(tài)DNA)技術可以在對被檢對象無任何分子生物學資料的情況下對其基因組進行分析，而且具有費用較低、方便易行、模板DNA用量少、不需要同位素，在安全性和實驗操作上具有比AFLP(amplified fragment length polymorphism，擴增酶切片段多態(tài)性)、SSR(simple sequence rc-peat，微衛(wèi)星重復序列)等分子標記更加簡便易行等優(yōu)點，從而使其成為目前研究羊草遺傳多樣性的最重要的手段之一，該技術主要是利用各種群羊草的總基因組DNA作為模版，篩選能夠擴增出具有明顯差異性條帶的隨機引物，以至少兩次重復均出現(xiàn)的結(jié)果做0，1矩陣圖，即有條帶記為1，無條帶記為0，計算總片段數(shù)及多態(tài)位點百分率、各種群間遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，利用分析軟件進行聚類分析從而得到其遺傳結(jié)構(gòu)樹狀圖，
　　羊草RAPD分析可以用于研究羊草的種群關系以及遺傳分化的影響因子，崔繼哲等應用RAPD技術證明相似生境或同一地域的種群在一些位點上表現(xiàn)出相似或相同的變化，劉惠芬等運用RAPD技術對內(nèi)蒙古典型草原不同生境8個羊草種群進行分析，聚類結(jié)果顯示生境相似的種群能夠聚在一起，而地理距離最近的種群不一定歸為一類，說明小范圍內(nèi)羊草種群間的遺傳分化與地理距離不存在相關性，而與其生境間的相似度相關，影響遺傳相似性的不是單一因子而是各種因子的綜合作用，較小地理范圍內(nèi)羊草種群間的遺傳分化主要是由環(huán)境的異質(zhì)性所引起的，筆者曾以采自中國大安堿地生態(tài)試驗站(N45°36′，E123°53′)的羊草種子單株播種栽培，以每株羊草幼苗的地上部為材料進行RAPD分析，30個實驗樣品的平均遺傳距離為0.1909，共可分為4個類群(待發(fā)表)，通過RAPD分析，還可以進一步將羊草遺傳分化多樣性的原因具體化，汪恩華等””利用分子標記與形態(tài)標記以21個有效隨機引物中對9份羊草材料進行RAPD分析，對隨機抽取的17份禾草種質(zhì)進行了種質(zhì)評估的比較研究，結(jié)果表明，羊草種質(zhì)的小穗數(shù)、種子千粒重、葉色、有性繁殖量和結(jié)實率5個形態(tài)學指標與遺傳多樣性指標存在一定的相關性，應用RAPD技術對不同生境羊草在水分脅迫下游離脯氨酸含量的變化做聚類圖比較分析，證實水分是影響羊草種群間遺傳變異和生態(tài)型分化的一個最主要的因子，雖然水因子是影響羊草分化的一個主導因子，但是在實際研究工作中也認識到羊草變異和分化是多種生態(tài)因子綜合起作用的結(jié)果(如溫度、海拔、經(jīng)緯度、土壤類型等)，而且各因子之間又是相互影響，在不同的生境中限制因子又是變換的，這就造成不同地理種群的羊草遺傳分化過程的復雜性，由此可見，目前以羊草為實驗材料的RAPD分析雖有許多報道。但是由于羊草本身具有較高的種群變異性。組成羊草群落的植物總計有357種，加之尚缺乏一種統(tǒng)一的標準分型方法，因此RAPD技術就成為研究羊草分類及來源的主要工具，在物種鑒定及遺傳分化研究中發(fā)揮著重要作用。
　　除了RAPD技術以外，等位酶技術也可用于羊草遺傳多樣性分析，等位酶是指由一個位點的不同等位基因編碼的同種酶的不同類型，其功能相同但氨基酸序列不同，崔繼哲等通過該技術，綜合分析了松嫩平原11個羊草種群的遺傳多樣性及遺傳分化指標，深入剖析了灰綠型和黃綠型兩種葉色類型羊草種群之間的遺傳差異，證明種群間的遺傳距離與地理距離之間沒有相關，崔繼哲等還采用淀粉凝膠電泳技術，應用等位酶分析方法測定了松嫩平原南部微生境下羊草灰綠色和黃綠色兩種生態(tài)型9個種群的遺傳多樣性和遺傳分化程度，證明羊草種、種群和生態(tài)型水平都維持較高的遺傳多樣性，兩種生態(tài)型之間有明顯的遺傳多樣性差異及遺傳分化，另外，對不同生境、不同分類種群的遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)羊草種群遺傳變異度很高，但是無論如何歸屬，松嫩草原上的羊草種群遺傳分化程度很低，推測可能與羊草為異花授粉、不同類型混生及種群間基因流強度大有關，劉杰等曾用SSR作為探針構(gòu)建了羊草的遺傳指紋圖譜，為羊草種質(zhì)資源評價、種間及種內(nèi)親源關系分析、生物多樣性研究提供了有效手段，利用AFLP方法對我國不同地區(qū)分布的羊草材料進行的DNA多態(tài)性分析結(jié)果也表明了羊草基因組DNA具有比較豐富的多態(tài)性。
　　
　　2 羊草愈傷組織培養(yǎng)及利用
　　
　　植物組織細胞培養(yǎng)(plant tissue and cell cul-ture)是通過運用植物組織細胞培養(yǎng)技術實現(xiàn)植物育種獲得新品種的一條快捷途徑，既可以通過 花粉培養(yǎng)、未授粉子房以及胚株培養(yǎng)等誘導形成單倍體植物，也可以通過植物愈傷組織培養(yǎng)中普遍存在的染色體變異實現(xiàn)植物突變育種，另外，通過植物組織培養(yǎng)技術進行的植物細胞融合(尤其是原生質(zhì)體融合)、胚胎培養(yǎng)以及植物體外受精技術可獲得遠緣雜交種，通過植物組織培養(yǎng)中的莖尖培養(yǎng)能夠產(chǎn)生無病毒原種，因而可用于植物脫毒，解決生產(chǎn)實踐中植物病毒危害問題，組織培養(yǎng)是植物細胞工程學、遺傳學、植物生理學、生物化學與分子生物學研究的重要基礎，不僅用于快速繁殖。還用于單倍體育種、種質(zhì)保存、生理學研究和基因轉(zhuǎn)化等領域。
　　早在上世紀80年代，高天舜就利用羊草根莖作為外植體進行愈傷組織的誘導和植株再生材料，目的是為了改良羊草的遺傳性狀，試圖通過組織培養(yǎng)途徑獲得羊草新類型，該研究采用當年生羊草根莖幼嫩部分的節(jié)間基部切段以及隔年生老根莖和當年生根莖的芍間中部、頂部切段作為外植體，消毒處理后接種于3種MS培養(yǎng)基中，先進行暗培養(yǎng)。待長出愈傷組織后轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，誘導率平均在20％左右，分化率最高也只有24.2％，羊草幼穗和成熟種子也可作為誘導愈傷組織的外植體，劉公社等，以幼穗作為外植體，恒溫25℃條件下誘導愈傷組織，在加有1mg/L2，4-D MS培養(yǎng)基上繼代2次后，轉(zhuǎn)移到含1.0mg/L KT和0.5mg/NAA的MS培養(yǎng)基上分化培養(yǎng)得到再生芽，并在無激素的基本培養(yǎng)基上獲得了生根的試管苗，移栽到溫室后可正常生長，盡管從羊草葉片、幼穗和成熟胚在同樣培養(yǎng)條件下均能誘導出愈傷組織，但只有幼穗愈傷組織能夠繼續(xù)分化出再生植株，但分化率因基因型和外源激素的不同而不同，以成熟羊草種子為外植體誘導愈傷組織具有操作簡便、污染程度低、材料選擇直觀化的優(yōu)點，且誘導率和幼苗分化率較高、幼苗健壯、生長勢好，崔秋華等采用3種培養(yǎng)基(MS、B5和8114)，3種2，4-D的濃度水平(1、2、4 mg/L)培養(yǎng)羊草幼嫩根莖和種子，結(jié)果表明，以種子作為外植體可獲得較高的愈傷組織誘導率(29.05％)，但目前對于最適激素濃度沒有統(tǒng)一結(jié)論，其范圍從1～4mg/L不等，對愈傷組織的誘導效果也未達到令人滿意的水平，仍需要深入研究。
　　在對羊草愈傷組織的應用方面，可以以羊草種子誘導出的愈傷組織為材料，用含有NaCl的培養(yǎng)基和含有NaHCO3與Na2CO3的混合鹽培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，測定羊草愈傷組織的耐鹽性，結(jié)果表明羊草愈傷組織對NaCl最大耐受強度為180mmol/L；對NaHC03與Na2CO3的混合鹽的最大耐受強度為4mmol/L中性鹽(NaCl)與堿性鹽(NaHCO3與Na2CO3)對羊草愈傷組織的脅迫機制明顯不同，國內(nèi)外對于愈傷組織的培養(yǎng)大多應用于轉(zhuǎn)基因，但在羊草方面進行的該項研究卻很少，劉公社將攜帶PAT基因的質(zhì)粒通過基因槍法轉(zhuǎn)化羊草愈傷組織。然后在篩選培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，篩選抗性愈傷組織并轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，得到再生苗，然后接種到含有篩選劑的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)后得到轉(zhuǎn)基因羊草小苗，該研究已獲得耐除草劑的羊草新品種專利，曲同寶等用基因槍將BADH基因轉(zhuǎn)入由羊草成熟胚誘導出的胚性愈傷組織中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)過PCR檢測證明外源基因已整合到羊草基因組中并得以表達，雖然轉(zhuǎn)入羊草的基因都可被檢測到已整合人羊草基因組中，而且也得到表達，但是對于轉(zhuǎn)基因羊草對周圍生態(tài)環(huán)境的影響還未見相關報道，篩選突變體是羊草愈傷組織的另一用途，陳暉等用組織培養(yǎng)方法篩選獲得羊草抗羥脯氨酸(HYP)變異系HR20-8，該變異系細胞內(nèi)游離氨基酸和蛋白質(zhì)組分氨基酸含量均發(fā)生了較大的變化，與供體對照比較，分別提高2.35倍和1.40倍，其中，游離脯氨酸和蛋白質(zhì)組分脯氨酸分別提高6.6倍和3.0倍，且脯氨酸合成途徑必需的r-谷氨酸激酶的活性提高了2.5倍。
　　
　　3 羊草酶蛋白類研究
　　
　　蛋白質(zhì)是生物體生命中的第一重要物質(zhì)，是生理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，同時能夠調(diào)控相關基因的表達，植物對抗非生物脅迫必然有蛋白質(zhì)的參與，比如耐冷蛋白、熱休克蛋白、水通道蛋白、赤霉素信號傳導蛋白等，從羊草中檢測這些蛋白的含量以及克隆表達該蛋白的基因?qū)τ谘芯垦虿菽湍娣肿訖C理和改善羊草品質(zhì)都具有重要意義。
　　目前對于羊草酶蛋白的研究還遠遠不夠，主要有細胞色素氧化酶、過氧化物酶、脂酶同工酶等，其應用也僅局限于闡明羊草的遺傳分化，通過聚類分析可以研究羊草種群在不同地理及生態(tài)環(huán)境中羊草在分子水平上細胞色素氧化酶同工酶存在著種內(nèi)分化，羊草在同工酶水平上的分化受多個環(huán)境因子的綜合影響，而且與羊草耐寒性能存在一定的內(nèi)在聯(lián)系，張麗萍等對采自同一天然草地上葉片呈黃綠色、灰綠色兩種類型羊草的根、莖、葉的過氧化物同工酶、脂酶同工酶進行了分析比較，結(jié)果表明，兩種葉色羊草，其相同組織的過氧化物同工酶譜及脂酶同工酶譜基本一致，兩種羊草葉片呈現(xiàn)不同顏色只屬不同生態(tài)型，
　　磁場處理不僅可以促進羊草的生長。而且還能提高羊草的抗鹽堿性，磁場使羊草過氧化物酶(POD)活性提高，并且誘發(fā)了一條新的同工酶帶，張衛(wèi)東等認為羊草自交不孕的原因是自交不親和性障礙。并利用禾本科植物自交不親和性有關的硫氧還蛋白(thsioredoxin)^基因設計的引物在羊草DNA中檢測到預期片段，說明硫氧還蛋白h基因可能與羊草的自交不親和性有關，該基因現(xiàn)已被克隆并能夠從GenBank中查到其序列。
　　研究羊草草原土壤酶的活性可以判斷土壤的肥力，土壤肥力水平接近則土壤酶的活性相似，土壤蛋白酶、脲酶、多酚氧化酶的活性與土壤有機碳、全氮呈顯著相關關系，可以反映土壤肥力水平高低，是評價土壤退化的重要指標。
　　
　　4 羊草耐逆基因的分離與克隆
　　
　　羊草具有耐寒、耐旱、耐鹽堿的特性，并且蛋白質(zhì)含量較高，說明羊草在面對非生物脅迫時高效表達能夠適應、緩解或?qū)瓜鄳婢硹l件的物質(zhì)，尤其是調(diào)控這些物質(zhì)表達的酶類基因，據(jù)報道，羊草種子個體萌發(fā)期最大忍受pH范圍是9.14-9.53，對于NaCl可耐受的最大強度為600mmol/L，對于Na2C03可耐受的最大強度為175mmol/L，為了弄清這種適應機制的復雜性，通過大規(guī)模的cDNA克隆或者表達序列標簽(EST)的測序分離相關基因是非常重要的，Jin等采集自然生長的植物葉組織經(jīng)過Na2CO3脅迫處理構(gòu)建了cDNA文庫，并對其EST進行測序?qū)Ρ确治?，推斷在羊草葉和根中各有39和31個非生物脅迫相關基因，這些EST資源將有助于對植物耐鹽堿分子基礎的深入研究和理解。
　　甜菜堿是在生物體內(nèi)起著滲透保護作用最主要的細胞相溶性物質(zhì)，編碼決定該物質(zhì)合成的關鍵酶一甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因已經(jīng)先后從多種生物體內(nèi)得到克隆，并在多種植物中進行了遺傳轉(zhuǎn)化。已獲得了抗鹽、抗寒、耐旱能力得到較大程度提高的轉(zhuǎn)基因植株，某些植物體內(nèi)的甜菜堿含量和BADH活性隨著土壤鹽堿化程度的加重而增加，因此推測甜菜堿可能與羊草耐鹽堿性有關，目前羊草中的部分BADH基因片段也已經(jīng)被成功克隆。
　　
　　5　問題與展望
　　
　　分子生物學技術自其應用以來，以其不可逆轉(zhuǎn)的滲透能力和交叉能力與各個學科齊頭并進、相輔相成、共同發(fā)展，許多生物現(xiàn)象的機理機制都要最終依賴分子生物學手段予以闡明，以往對羊草生物學以及生理生態(tài)學進行了比較深入的探討，但對于羊草分子生物學的研究起步較晚。進展也比較緩慢，近年來，隨著分子生物學研究手段和技術的進步，以及羊草遺傳改良的需要。人們在羊草遺傳多樣性、愈傷組織培養(yǎng)、酶蛋白分析以及基因克隆與轉(zhuǎn)化等研究領域陸續(xù)開展了一些有益的嘗試，并取得了許多重要研究成果，今后應在分子水平上，如對羊草自交不親和性，非生物脅迫耐受機理，種子休眠機理，關鍵酶基因的分離克隆與轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因羊草對周圍環(huán)境的潛在影響等諸多方面加以深入探討與研究，必將為羊草資源的保護和合理利用提供充分的理論基礎。
　　
　　作者簡介：孔祥軍(1980―)，男[滿]，河北承德人，博士研究生，主要從事植物抗逆分子機理研究；梁正偉(1962―)，男，吉林長春人，博士，研究員，博士生導師，通訊作者，主要從事植物逆境生理生態(tài)與分子生物學研究。

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