我們或許才剛剛開始打開對巨大的基因組非編碼區(qū)域的研究,基于crispr的兩項新技術(shù)或許就能夠幫我們開啟研究的新篇章。我們(原文筆者)能夠很好地理解基因組中編碼蛋白組分背后的規(guī)則,同時通過對dna序列的觀察我們也能夠找出從事編碼作用的基因的開始以及終止位置。
對于基因組中殘留的98%的基因組而言,卻又是一番不同的故事了
刊登在science雜志上的一篇研究報告中
研究者jesse engreitz指出
變化多端
目前兩個研究小組都利用了crispr進(jìn)行了相關(guān)篩查來干擾非編碼的dna,但兩個研究小組卻是利用不同的方法來進(jìn)行了相關(guān)研究
另外一組研究者engreitz等人則利用了crispr的干擾系統(tǒng)
,即利用失活形式的cas9同krab蛋白相互融合從而沉默靶向序列的表達(dá),這些靶向序列圍繞在myc和gata1附近,這兩個基因是重要的轉(zhuǎn)錄因子。engreitz說道,這種系統(tǒng)能夠幫助我們隊非編碼區(qū)域的調(diào)節(jié)性影響進(jìn)行定量的評估,同時其還能夠為我們展示如何能夠控制一個既定的基因。每個研究小組都利用了一種功能性的“讀數(shù)器”以及深度的測序技術(shù)觀察了哪種導(dǎo)向rnas能夠影響目標(biāo)基因的表達(dá)
,同時還能夠幫助繪制出導(dǎo)向rnas所影響的調(diào)節(jié)子的圖譜。兩個研究團(tuán)隊的研究結(jié)果都闡明了利用crispr工具追蹤非編碼基因組調(diào)節(jié)機制的重要性。研究者engreitz等人闡明了7個myc和3個gata1增強子的重要性,而張峰研究團(tuán)隊則篩選出了多個增強子以及僅結(jié)合cul3的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。在“自然棲息地”對序列進(jìn)行研究
類似于傳統(tǒng)的報道分子實驗
,即科學(xué)家們感興趣的在質(zhì)粒中將序列同報道自偶聯(lián)進(jìn)行研究;這些混合的crispr篩選技術(shù)有著明顯的不同,其能夠直接探查序列,也就是說在最原始的位點進(jìn)行序列的研究解讀。研究者sanjana強調(diào)道,這些篩選技術(shù)能夠從內(nèi)源性的角度來對序列進(jìn)行研究,同時報道子實驗也是非常有幫助的,但其缺少了3d構(gòu)象和局部的染色質(zhì)環(huán)境,在這里這些調(diào)節(jié)性序列或許就會經(jīng)歷正常的一些相互作用研究者表示
但engreitz及其同事表示非常樂觀,他們希望能夠利用基于crispr的技術(shù)來闡明非編碼基因組背后所隱藏的秘密
。目前在非編碼基因組上研究的最大挑戰(zhàn)就是,盡管非編碼基因組非常龐大,但其中所包含的單一功能性元件卻是非常小的,未來研究者希望開發(fā)新的研究方法在保證非編碼基因組較高分辨率的情況下對更大的基因組區(qū)域進(jìn)行探索。研究者指出,隨著他們繪制出多個圖譜以及其相關(guān)性
,他們相信能夠幫助預(yù)測關(guān)于非編碼基因組的一些信息;利用導(dǎo)向rnas文庫引入crispr或者抑制子或許就能夠幫助研究者闡明大塊區(qū)域的非編碼dna對不同基因的作用以及效應(yīng),而屆時科學(xué)家們或許才剛剛打開對基因調(diào)節(jié)的系統(tǒng)性圖譜研究的第一步。“上帝的手術(shù)刀”對海洋生物做了啥
?你好
基因編輯什么意思
基因編輯
?
基因編輯已經(jīng)開始應(yīng)用于基礎(chǔ)理論研究和生產(chǎn)應(yīng)用中
動物基因的靶向修飾
基因編輯和牛體外胚胎培養(yǎng)等繁殖技術(shù)結(jié)合
基因編輯技術(shù)形式有:
1
同源重組(Homologous recombination)是最早用來編輯細(xì)胞基因組的技術(shù)方法
2
基因編輯的關(guān)鍵是在基因組內(nèi)特定位點創(chuàng)建DSB
基因編輯技術(shù)的應(yīng)用:
基因編輯和牛體外胚胎培養(yǎng)等繁殖技術(shù)結(jié)合
單細(xì)胞基因表達(dá)分析已經(jīng)解決了人類發(fā)育的轉(zhuǎn)錄路線圖
以上內(nèi)容參考:百度百科—基因編輯技術(shù) 1. 文庫構(gòu)建:針對某個物種,每個基因設(shè)計3個或以上的sgRNA 本文地址:http://www.mcys1996.com/jiankang/252529.html.
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患卵巢結(jié)核可以吃魚肉嗎
CRISPR
-Cas9進(jìn)一步增加了基因編輯在動物基因靶向修飾的應(yīng)用范圍。CRISPR-Cas9允許通過細(xì)胞質(zhì)直接注射從而實現(xiàn)對哺乳動物受精卵多個靶標(biāo)的一次性同時敲除(KO)基于CRISPR/Case9全基因組敲除文庫篩選功能基因
2. 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo):包裝GeCKO慢病毒文庫
3. 表型篩選:將全基因組敲除細(xì)胞庫分成兩份,其中一份作為實驗組施加篩選壓力
4. 候選基因的分析:將實驗組和對照組的細(xì)胞分別抽提基因組
根據(jù)篩選目的的不同,分為陽性篩選和陰性篩選。陽性篩選是對已成功整合sgRNA的細(xì)胞文庫施加一定的篩選壓力,僅使少數(shù)目的表型的細(xì)胞能夠存活,達(dá)到富集關(guān)鍵基因的目的。陰性篩選與之相反,存活的細(xì)胞并不是目的表型細(xì)胞,需要比較不同時間點sgRNA的豐度找出差異sgRNA來確定關(guān)鍵基因
個人理解:陽性
那么什么情況下是positive selection?我們知道,這兩者是反的,所以假如我們想篩選細(xì)胞生長的抑制基因(和必需基因相反),這種情況就屬于positive selection(和negative selection相反)。如果敲除了抑制基因,顯然細(xì)胞可以正常增值,抑制基因?qū)?yīng)的sgRNA也能不斷富集,這兩個方向是相同的。
如果富集sgRNA靶向的基因就是目的候選基因,則為positive selection,否則為negative selection。
①篩選炭疽毒素使細(xì)胞中毒所必需的宿主基因
由于毒素的強選擇性壓力,大多數(shù)細(xì)胞都會死亡,只有少量的細(xì)胞存活和增殖,這些存活的細(xì)胞內(nèi)富集了大量sgRNA,而這些sgRNA靶向的基因是被敲除的,這些基因就是使細(xì)胞中毒所必需的宿主基因,正是由于這些目的基因被敲除,細(xì)胞才得以存活。
Zhou等(2014)利用敲除文庫篩選,在初步確定的291個基因中成功鑒定出炭疽和白喉毒素致細(xì)胞中毒所必需的宿主基因,并通過功能驗證得到了證實。
②篩選藥物敏感基因
細(xì)胞若含有藥物敏感基因?qū)⑹タ顾幮浴H羟贸嗣舾谢?div id="m50uktp" class="box-center"> ,則可以存活
①鑒定細(xì)胞生長必需的基因
一個時間段內(nèi)的連續(xù)生長,減少的細(xì)胞中往往攜帶靶向細(xì)胞增殖所必需基因的sgRNA。這些基因可以通過比較每個sgRNA的相對頻率來找到。陰性篩選的一個重要應(yīng)用是鑒定癌細(xì)胞生長所必需的基因,而這些基因可能成為治療癌癥的新靶標(biāo)。
2014年,Shalem等首次利用GeCKO文庫鑒定出人黑色素瘤細(xì)胞和多能干細(xì)胞存活的關(guān)鍵基因,研究結(jié)果與RNAi篩選結(jié)果高度一致。
②篩選藥物抗性基因
若敲除了抗藥性基因,細(xì)胞在藥物壓力下不能存活,存活的細(xì)胞內(nèi)并沒有敲除目的基因,最終富集的sgRNA不是目的sgRNA,需要通過與對照組比較sgRNA消耗情況(或不同時間點的sgRNA豐度)來確定目的基因。
1. 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控,去除低質(zhì)量的reads,使用clean reads data進(jìn)行后續(xù)分析。
2.比對分析:將測序數(shù)據(jù)中拼接reads與sgRNA 文庫序列比對,并對sgRNA 文庫中完全匹配的sgRNA 數(shù)目、丟失sgRNA、基尼指數(shù)等進(jìn)行統(tǒng)計。
?Reads: Total number reads in the fastq file. (Recommended: 100~300 times the number of sgRNAs)
? Mapped: Reads that can be mapped to gRNA library
? Percentage: The percentage of mapped reads (Recommended: at least 60%)
? TotalsgRNAs: The number of sgRNAs in the library
? ZeroCounts: The number of sgRNA with 0 read counts(Recommended: no more than 1%)
? GiniIndex: The Gini Index of the read count distribution. Gini index can be used to measure the evenness of the read counts, and a smaller value means a more even distribution of the read counts. (Recommended: around 0.1 for plasmid or initial state samples, and around 0.2-0.3 for negative selection samples )
3.sgRNA 及基因的read counts 統(tǒng)計
CRISPR全基因組篩選的主要內(nèi)容便是統(tǒng)計sgRNA在不同樣本間的消耗和富集情況,進(jìn)而推斷候選基因。
4.主成分分析和樣品相關(guān)性聚類分析
有助于考察樣本間的相似性和差異,評估實驗設(shè)計的合理性以及對后續(xù)數(shù)據(jù)分析起到一定指導(dǎo)作用。對于有重復(fù)的實驗來說,樣本同一處理不同重復(fù)應(yīng)該盡可能聚在一起,若存在個別重復(fù)樣本明顯偏離,可以考慮剔除該樣本。樣品聚類還可用于判斷數(shù)據(jù)處理中是否剔除了批次效應(yīng)。
5.候選基因篩選
MAGeCK-RRA算法根據(jù)測序結(jié)果中sgRNA的富集情況產(chǎn)生對應(yīng)基因位點的RRA得分,RRA得分代表基因的必要性,RRA得分越小表明其重要性越高。MAGeCK返回RRA lo value(neg|score、pos|score)檢驗統(tǒng)計顯著性,并據(jù)此對基因進(jìn)行了排序,按照實驗?zāi)康牡牟煌?div id="4qifd00" class="flower right">
6.GSEA富集分析
對CRISPR篩選得到的候選基因進(jìn)行富集分析以了解基因的更多功能,同時也可以對CRISPR篩選結(jié)果進(jìn)行驗證
參考文獻(xiàn):
[1]劉燕飛. 基于CRISPR/Cas9技術(shù)的HeLa細(xì)胞全基因組敲除文庫的建立及初步應(yīng)用[D].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2020.
[2]Shalem,Ophir, et al. “Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells.”Science, vol. 343, no. 6166, 2014, pp. 84–87.
[3]Zhou, Yuexin, et al. “High-Throughput Screening of a CRISPR/Cas9 Library for Functional Genomics in Human Cells.” Nature, vol. 509, no. 7501, 2014, pp. 487–491.
[4]Kweon, Jiyeon, and Yongsub Kim. “High-Throughput Genetic Screens Using CRISPR-Cas9 System.” Archives of Pharmacal Research, vol. 41, no. 9, 2018, pp. 875–884.
[5]Li, Wei, et al. “Quality Control, Modeling, and Visualization of CRISPR Screens with MAGeCK-VISPR.” Genome Biology, vol. 16, no. 1, 2015, pp. 281–281.
[6]Wang, Binbin, et al. “Integrative Analysis of Pooled CRISPR Genetic Screens Using MAGeCKFlute.” Nature Protocols, vol. 14, no. 3, 2019, pp. 756–780.