<sup id="kwqog"></sup>
<strike id="kwqog"></strike>
<kbd id="kwqog"></kbd>
<ul id="kwqog"><tbody id="kwqog"></tbody></ul><ul id="kwqog"><pre id="kwqog"></pre></ul>
  • <ul id="kwqog"><tbody id="kwqog"></tbody></ul>
  • 登錄
    首頁 >> 健康生活

    如何利用基因魔剪—crispr技術(shù)來進(jìn)行非編碼基因組功能的研究呢

    夕陽紅 2024-05-10 21:57:17

    如何利用基因魔剪—crispr技術(shù)來進(jìn)行非編碼基因組功能的研究呢?

    我們或許才剛剛開始打開對巨大的基因組非編碼區(qū)域的研究,基于crispr的兩項新技術(shù)或許就能夠幫我們開啟研究的新篇章。我們(原文筆者)能夠很好地理解基因組中編碼蛋白組分背后的規(guī)則,同時通過對dna序列的觀察我們也能夠找出從事編碼作用的基因的開始以及終止位置。

    對于基因組中殘留的98%的基因組而言,卻又是一番不同的故事了

    ,如今我們對于dna暗物質(zhì)的理解都是來自于對非編碼dna單個片段的研究和理解,而真正指導(dǎo)非編碼基因組發(fā)揮作用的規(guī)則目前研究者并不清楚
    。博德研究所的創(chuàng)始主任eric lander說道
    ,90%的影響人類疾病的遺傳突變都位于非編碼區(qū)域,但如今我們并沒有有效的方法去闡明到底是哪些調(diào)節(jié)子在影響著這些基因的表達(dá)

    刊登在science雜志上的一篇研究報告中

    ,來自博德研究所的兩個研究團(tuán)隊通過研究利用crispr基因編輯技術(shù)揭示了非編碼基因工作的機制
    。利用兩種互補的方法,研究人員以crispr作為工具系統(tǒng)性地同時調(diào)查了數(shù)千個非編碼的dna序列
    ,研究人員(來自lander實驗室和來自zhang feng實驗室的研究者)在研究中鑒別出了多個非常有意思的遺傳調(diào)節(jié)子
    ,其中就包括那些遠(yuǎn)離所控制基因位點的數(shù)以百萬計的堿基。

    研究者jesse engreitz指出

    ,我們希望能夠在每個細(xì)胞周期中對控制每個基因表達(dá)的非編碼元件進(jìn)行編錄
    ,這在生物學(xué)研究上是一個非常大的問題,而且這也是一個限速的步驟
    ,即將和基礎(chǔ)分子機制相關(guān)的許多遺傳特性同人類疾病相聯(lián)系

    變化多端

    目前兩個研究小組都利用了crispr進(jìn)行了相關(guān)篩查來干擾非編碼的dna,但兩個研究小組卻是利用不同的方法來進(jìn)行了相關(guān)研究

    。研究者張峰(zhang feng)利用cas9來對非編碼dna的重疊延伸片段進(jìn)行精準(zhǔn)的切割
    ,在這種情況下,圍繞在三個基因nf1
    , nf2和cul3周圍區(qū)域的功能就會喪失,而這與某些形式的黑色素瘤耐藥性產(chǎn)生直接相關(guān)
    。研究者解釋道
    ,這種方法就能夠幫助我們誘導(dǎo)一系列多樣性突變的產(chǎn)生,而且我們也不必推測既定的序列為何會被干擾

    另外一組研究者engreitz等人則利用了crispr的干擾系統(tǒng)

    ,即利用失活形式的cas9同krab蛋白相互融合從而沉默靶向序列的表達(dá),這些靶向序列圍繞在myc和gata1附近
    ,這兩個基因是重要的轉(zhuǎn)錄因子
    。engreitz說道
    ,這種系統(tǒng)能夠幫助我們隊非編碼區(qū)域的調(diào)節(jié)性影響進(jìn)行定量的評估,同時其還能夠為我們展示如何能夠控制一個既定的基因

    每個研究小組都利用了一種功能性的“讀數(shù)器”以及深度的測序技術(shù)觀察了哪種導(dǎo)向rnas能夠影響目標(biāo)基因的表達(dá)

    ,同時還能夠幫助繪制出導(dǎo)向rnas所影響的調(diào)節(jié)子的圖譜。兩個研究團(tuán)隊的研究結(jié)果都闡明了利用crispr工具追蹤非編碼基因組調(diào)節(jié)機制的重要性
    。研究者engreitz等人闡明了7個myc和3個gata1增強子的重要性
    ,而張峰研究團(tuán)隊則篩選出了多個增強子以及僅結(jié)合cul3的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。

    在“自然棲息地”對序列進(jìn)行研究

    類似于傳統(tǒng)的報道分子實驗

    ,即科學(xué)家們感興趣的在質(zhì)粒中將序列同報道自偶聯(lián)進(jìn)行研究
    ;這些混合的crispr篩選技術(shù)有著明顯的不同,其能夠直接探查序列
    ,也就是說在最原始的位點進(jìn)行序列的研究解讀
    。研究者sanjana強調(diào)道,這些篩選技術(shù)能夠從內(nèi)源性的角度來對序列進(jìn)行研究
    ,同時報道子實驗也是非常有幫助的
    ,但其缺少了3d構(gòu)象和局部的染色質(zhì)環(huán)境,在這里這些調(diào)節(jié)性序列或許就會經(jīng)歷正常的一些相互作用

    研究者表示

    ,舉個例子說,我們或許能夠在基因啟動子和非編碼位點之間觀察到長期的循環(huán)結(jié)構(gòu)
    ,但如果我們僅僅觀察這些調(diào)節(jié)性原件的話或許就會錯過一些感興趣的3d相互作用
    。engreitz指出,目前存在一種限制
    ,不管是crispr方法還是別的方法
    ,在當(dāng)前的形式下,發(fā)現(xiàn)基因組固有的冗余程度或許并不足以破碎一種增強子來理解基因被控制機制
    ,或許我們需要對多個增強子進(jìn)行打斷來研究

    但engreitz及其同事表示非常樂觀,他們希望能夠利用基于crispr的技術(shù)來闡明非編碼基因組背后所隱藏的秘密

    。目前在非編碼基因組上研究的最大挑戰(zhàn)就是
    ,盡管非編碼基因組非常龐大,但其中所包含的單一功能性元件卻是非常小的
    ,未來研究者希望開發(fā)新的研究方法在保證非編碼基因組較高分辨率的情況下對更大的基因組區(qū)域進(jìn)行探索

    研究者指出,隨著他們繪制出多個圖譜以及其相關(guān)性

    ,他們相信能夠幫助預(yù)測關(guān)于非編碼基因組的一些信息
    ;利用導(dǎo)向rnas文庫引入crispr或者抑制子或許就能夠幫助研究者闡明大塊區(qū)域的非編碼dna對不同基因的作用以及效應(yīng),而屆時科學(xué)家們或許才剛剛打開對基因調(diào)節(jié)的系統(tǒng)性圖譜研究的第一步。

    上帝的手術(shù)刀中基因的秘密有哪些科學(xué)家做出了貢獻(xiàn)

    “上帝的手術(shù)刀”對海洋生物做了啥


    今年的諾貝爾化學(xué)獎頒發(fā)給了兩位女科學(xué)家——埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)和詹妮弗·杜德納(Jennifer A. Doudna)
    ,以表彰她們開發(fā)了被譽為“上帝的手術(shù)刀”“基因魔剪”的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)。

    今年的諾貝爾化學(xué)獎得主
    CRISPR即成簇的規(guī)律性間隔排列的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat )
    。Cas是CRISPR關(guān)聯(lián)基因(CRISPR associated gene)的縮寫

    CRISPR最初由日本科學(xué)家在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn),后來被證明廣泛存在于約45%的細(xì)菌和約90%的古細(xì)菌中
    ,是其抵御噬菌體入侵的重要武器

    當(dāng)噬菌體第一次侵染細(xì)菌時,細(xì)菌的Cas1和Cas2蛋白會將噬菌體的一小段DNA片段整合到自己的重復(fù)序列區(qū)中
    ,成為一個新的間隔序列
    。待同一種噬菌體再次來襲時,病毒DNA被間隔序列轉(zhuǎn)錄的guide RNA識別
    ,并激活Cas核酸酶
    ,切斷噬菌體的DNA雙鏈,從而守護(hù)自身安全
    。利用此原理
    ,科學(xué)家們可以實現(xiàn)對研究對象某一特定序列的靶向敲除、敲入等


    CRISPR/Cas9
    CRISPR/Cas9系統(tǒng)可分為三類
    ,其中CRISPR/Cas9結(jié)構(gòu)和操作更簡潔,由guide RNA引導(dǎo)Cas9核酸內(nèi)切酶進(jìn)行靶向基因編輯
    ,自2013年首次運用到真核生物基因編輯以來
    ,發(fā)展迅速,曾于2013年
    、2015年兩次被Science雜志評為當(dāng)年十大科學(xué)突破
    ,且今年終于不負(fù)眾望,摘得諾獎桂冠

    目前關(guān)于CRISPR基因編輯技術(shù)的報道多集中于人類醫(yī)學(xué)(處于實驗室研究階段)和線蟲
    、擬南芥、果蠅
    、斑馬魚
    、小鼠等模式生物。那么
    ,這把“上帝的手術(shù)刀”在海洋生物中的應(yīng)用取得了哪些進(jìn)展呢


    構(gòu)建海洋模式生物與疾病模型
    將CRISPR基因編輯技術(shù)運用于海洋生物的最早報道可追溯至2014年。這一年
    ,Sasaki、Stolfi等人均以海洋模式生物——玻璃海鞘(Ciona intestinalis)為研究對象,利用CRISPR技術(shù)先后實現(xiàn)了Hox基因定位和ebf基因定點突變


    Hox基因是一種動物基因組內(nèi)高度保守的發(fā)育調(diào)控基因
    ,在動物體軸形成過程中起重要的作用。ebf基因可在胚胎發(fā)育過程中決定細(xì)胞命運
    。這兩種基因突變的玻璃海鞘模型可用于探究脊索動物身體形成的分子機制

    2016年,Nymark等將CRISPR技術(shù)運用到了海洋藻類中, 成功敲除了三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的CpSRP54基因

    CRISPR技術(shù)為海洋生物模型構(gòu)建提供了新的視角
    ,加快了科學(xué)家們探秘海洋生物起源與進(jìn)化的步伐。

    培育海洋經(jīng)濟新品種
    海產(chǎn)魚蝦貝蟹是我們飲食中重要的蛋白質(zhì)來源
    ,而良種的培育能促進(jìn)海水養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展
    。利用基因編輯技術(shù)在新品種培育中具有諸多優(yōu)勢,如育種周期短
    、靶向性強
    、比轉(zhuǎn)基因技術(shù)安全性高等,有著廣闊的應(yīng)用前景

    2019年
    ,Kim等將肌生成抑制素(PoMSTN)基因相關(guān)基因編輯組件通過顯微注射導(dǎo)入牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎中,經(jīng)過篩選
    ,得到了雜合雙等位基因突變體
    ,表現(xiàn)為身體增厚,肉質(zhì)更加肥滿


    與野生型(左)相比
    ,PoMSTN基因雜合突變的牙鲆(右)的肥滿度增加(圖片來自Kim等,2019)

    今年
    ,來自河北大學(xué)的研究者們利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)的類胡蘿卜素異構(gòu)加氧酶(EcNinaB-X1)基因
    ,發(fā)現(xiàn)突變體在受到副溶血性弧菌或嗜水弧菌的攻擊時存活率明顯高于野生型;又敲除了另一個類胡蘿卜素加氧酶基因EcBCO2
    ,突變體具有更高的抗病性
    。這些研究發(fā)現(xiàn)為培育抗病抗逆對蝦新品種提供了新思路。

    解析海洋生物基因功能
    解密基因的功能是解讀生命這部“天書”的先決條件,基因編輯技術(shù)為科學(xué)家們提供了一個解密的絕妙手段
    。2014 年
    ,Nakanishi等人將CRISPR 技術(shù)首次運用于甲殼動物,失活了大型溞(Daphnia magna)的pax6 基因
    ,證明了該基因在眼發(fā)育中的關(guān)鍵作用。2019年
    ,Liu等人成功敲除海膽的聚酮化合物合酶1基因(Psk1)
    ,突變個體從表現(xiàn)為白化


    野生型(左)與Pks1基因敲除的白化海膽(右)(從3個月至成年)

    需要承認(rèn),基因編輯技術(shù)在海洋生物的應(yīng)用仍處于初級階段
    ,受到海洋生物材料本身問題(如顯微注射后的受精卵孵化率有待提高
    、海洋生物細(xì)胞系數(shù)目較少等)、CRISPR系統(tǒng)脫靶問題等方面的制約
    。但毫無疑問
    ,海洋生物基因編輯領(lǐng)域的前途是光明的,我們有理由相信科研工作者們會不斷創(chuàng)新
    ,成功解決上述問題
    ,取得海洋生物基因編輯領(lǐng)域的一個又一個成就!

    參考文獻(xiàn)
    Doudna J A, Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9[J]. Science, 2014, 346(6213): 1258096.
    Kim J, Cho J Y, Kim J W, et al. CRISPR/Cas9-mediated myostatin disruption enhances muscle mass in the olive flounder Paralichthys olivaceus[J]. Aquaculture, 2019, 512: 734336.
    Liu D, Awazu A, Sakuma T, et al. Establishment of knockout adult sea urchins by using a CRISPR‐Cas9 system[J]. Development, Growth & Differentiation, 2019, 61(6): 378-388.

    對基因編輯的理解

    你好

    ,很高興為你解答:



    基因編輯什么意思
    基因編輯

    ,又稱基因組編輯或基因組工程,是一種新興的比較精確的能對生物體基因組特定目標(biāo)基因進(jìn)行修飾的一種基因工程技術(shù)
    ?div id="d48novz" class="flower left">
    ;蚓庉嫾夹g(shù)指能夠讓人類對目標(biāo)基因進(jìn)行定點“編輯”,實現(xiàn)對特定DNA片段的修飾


    基因編輯依賴于經(jīng)過基因工程改造的核酸酶
    ,也稱“分子剪刀”,在基因組中特定位置產(chǎn)生位點特異性雙鏈斷裂(DSB)
    ,誘導(dǎo)生物體通過非同源末端連接(NHEJ)或同源重組(HR)來修復(fù)DSB
    ,因為這個修復(fù)過程容易出錯,從而導(dǎo)致靶向突變



    ?

    基因編輯已經(jīng)開始應(yīng)用于基礎(chǔ)理論研究和生產(chǎn)應(yīng)用中

    ,這些研究和應(yīng)用,有助于生命科學(xué)的許多領(lǐng)域
    ,從研究植物和動物的基因功能到人類的基因治療
    。下面主要介紹基因編輯在動植物上的應(yīng)用。



    動物基因的靶向修飾

    基因編輯和牛體外胚胎培養(yǎng)等繁殖技術(shù)結(jié)合

    ,允許使用合成的高度特異性的內(nèi)切核酸酶直接在受精卵母細(xì)胞中進(jìn)行基因組編輯
    。 CRISPR -Cas9進(jìn)一步增加了基因編輯在動物基因靶向修飾的應(yīng)用范圍。CRISPR-Cas9允許通過細(xì)胞質(zhì)直接注射(CDI)從而實現(xiàn)對哺乳動物受精卵多個靶標(biāo)的一次性同時敲除(KO)


    單細(xì)胞基因表達(dá)分析已經(jīng)解決了人類發(fā)育的轉(zhuǎn)錄路線圖
    ,從中發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵候選基因用于功能研究。使用全基因組轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)指導(dǎo)實驗
    ,基于CRISPR的基因組編輯工具使得干擾或刪除關(guān)鍵基因以闡明其功能成為可能


    植物基因的靶向修飾

    植物基因的靶向修飾是基因編輯應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域。首先可以通過修飾內(nèi)源基因來幫助設(shè)計所需的植物性狀
    。例如
    ,可以通過基因編輯將重要的性狀基因添加到主要農(nóng)作物的特定位點
    ,通過物理連接確保它們在育種過程中的共分離,這又稱為“性狀堆積”
    。其次
    ,可以產(chǎn)生耐除草劑作物。比如
    ,使用ZFN輔助的基因打靶,將兩種除草劑抗性基因(煙草乙酰乳酸合成酶SuRA和SuRB)引入作物
    。再次
    ,可以用來防治各種病害如香蕉的條紋病毒。

    此外
    ,基因編輯技術(shù)還被應(yīng)用于改良農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量
    ,比如改良豆油品質(zhì)和增加馬鈴薯的儲存潛力。

    基因編輯技術(shù)形式有哪些

    基因編輯技術(shù)形式有:

    1

    、同源重組

    同源重組(Homologous recombination)是最早用來編輯細(xì)胞基因組的技術(shù)方法

    。同源重組是在DNA的兩條相似(同源)鏈之間遺傳信息的交換(重組)。

    2

    、核酸酶

    基因編輯的關(guān)鍵是在基因組內(nèi)特定位點創(chuàng)建DSB

    。常用的限制酶在切割DNA方面是有效的,但它們通常在多個位點進(jìn)行識別和切割
    ,特異性較差
    。為了克服這一問題并創(chuàng)建特定位點的DSB。

    基因編輯技術(shù)的應(yīng)用:

    基因編輯和牛體外胚胎培養(yǎng)等繁殖技術(shù)結(jié)合

    ,允許使用合成的高度特異性的內(nèi)切核酸酶直接在受精卵母細(xì)胞中進(jìn)行基因組編輯

    CRISPR
    -Cas9進(jìn)一步增加了基因編輯在動物基因靶向修飾的應(yīng)用范圍。CRISPR-Cas9允許通過細(xì)胞質(zhì)直接注射從而實現(xiàn)對哺乳動物受精卵多個靶標(biāo)的一次性同時敲除(KO)

    單細(xì)胞基因表達(dá)分析已經(jīng)解決了人類發(fā)育的轉(zhuǎn)錄路線圖

    ,從中發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵候選基因用于功能研究。使用全基因組轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)指導(dǎo)實驗
    ,基于CRISPR的基因組編輯工具使得干擾或刪除關(guān)鍵基因以闡明其功能成為可能

    以上內(nèi)容參考:百度百科—基因編輯技術(shù)

    基于CRISPR/Case9全基因組敲除文庫篩選功能基因

    1. 文庫構(gòu)建:針對某個物種,每個基因設(shè)計3個或以上的sgRNA

    ,高通量合成sgRNA
    ,然后把合成的sgRNA克隆到慢病毒載體中。

    2. 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo):包裝GeCKO慢病毒文庫
    ,并以低MOI(一般標(biāo)準(zhǔn)<0.3)感染靶細(xì)胞
    ,保證一個病毒顆粒感染一個細(xì)胞,篩選同時表達(dá)sgRNA和Cas9的細(xì)胞
    ;每個細(xì)胞都只會敲除自身攜帶的sgRNA對應(yīng)的一個基因
    ,細(xì)胞文庫中包含的細(xì)胞的數(shù)量一般為細(xì)胞文庫中全部sgRNA數(shù)量的100-1000倍


    3. 表型篩選:將全基因組敲除細(xì)胞庫分成兩份,其中一份作為實驗組施加篩選壓力
    ,如:病毒侵染
    ,藥物治療等;另一份作為對照組
    。根據(jù)耐藥性
    、增殖能力、存活能力等表型篩選細(xì)胞


    4. 候選基因的分析:將實驗組和對照組的細(xì)胞分別抽提基因組
    ,PCR擴增sgRNA片段,高通量測序
    ,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析


    根據(jù)篩選目的的不同,分為陽性篩選和陰性篩選
    。陽性篩選是對已成功整合sgRNA的細(xì)胞文庫施加一定的篩選壓力
    ,僅使少數(shù)目的表型的細(xì)胞能夠存活,達(dá)到富集關(guān)鍵基因的目的
    。陰性篩選與之相反
    ,存活的細(xì)胞并不是目的表型細(xì)胞,需要比較不同時間點sgRNA的豐度找出差異sgRNA來確定關(guān)鍵基因
    ,陰性篩選可以鑒定出引起細(xì)胞某些功能缺失的基因
    ,如篩選時間較長,可以篩選到細(xì)胞生存所必需的基因


    個人理解:陽性
    、陰性篩選或者正向、負(fù)向篩選聽起來容易混淆
    ,其實在英文中就2個詞
    ,positive selection和negative selection,無論怎么選擇
    ,最后都是看sgRNA的計數(shù)情況
    ,然后根據(jù)實驗?zāi)康拇_定候選基因。如果最后選出的細(xì)胞內(nèi)富集的sgRNA所靶向的基因就是我們要的目的基因
    ,那么這種選擇我們稱其為positive selection
    。相反,如果最后富集的sgRNA并不是我們實驗想要的
    ,我們通過比較不同時間點的sgRNA變化進(jìn)而推斷候選基因
    ,這樣的選擇稱之為negative selection。舉個例子
    ,我們要篩選細(xì)胞生長的必需基因
    ,如果把這個基因敲除了(這個基因由其對應(yīng)的sgRNA作為標(biāo)記
    ,每個細(xì)胞內(nèi)都敲除了一個基因),那么細(xì)胞肯定不能存活了
    ,對應(yīng)的sgRNA肯定也不會富集
    。所以存活的細(xì)胞意味著沒有敲除必需基因,隨著細(xì)胞的增值
    ,整合到其基因組上的sgRNA大量富集
    ,我們最終測到了這些sgRNA,但其靶向的基因敲除了并不影響細(xì)胞生長
    ,所以這些基因不是目的基因
    。因此我們比較不同時間點sgRNA的消耗情況,那些sgRNA明顯減少的
    ,其靶向的基因才是必需基因。

    那么什么情況下是positive selection
    ?我們知道
    ,這兩者是反的,所以假如我們想篩選細(xì)胞生長的抑制基因(和必需基因相反)
    ,這種情況就屬于positive selection(和negative selection相反)
    。如果敲除了抑制基因,顯然細(xì)胞可以正常增值
    ,抑制基因?qū)?yīng)的sgRNA也能不斷富集
    ,這兩個方向是相同的。

    如果富集sgRNA靶向的基因就是目的候選基因
    ,則為positive selection
    ,否則為negative selection。

    ①篩選炭疽毒素使細(xì)胞中毒所必需的宿主基因

    由于毒素的強選擇性壓力
    ,大多數(shù)細(xì)胞都會死亡
    ,只有少量的細(xì)胞存活和增殖,這些存活的細(xì)胞內(nèi)富集了大量sgRNA
    ,而這些sgRNA靶向的基因是被敲除的
    ,這些基因就是使細(xì)胞中毒所必需的宿主基因,正是由于這些目的基因被敲除
    ,細(xì)胞才得以存活


    Zhou等(2014)利用敲除文庫篩選,在初步確定的291個基因中成功鑒定出炭疽和白喉毒素致細(xì)胞中毒所必需的宿主基因
    ,并通過功能驗證得到了證實


    ②篩選藥物敏感基因

    細(xì)胞若含有藥物敏感基因?qū)⑹タ顾幮浴H羟贸嗣舾谢?div id="m50uktp" class="box-center"> ,則可以存活
    ,最終富集的sgRNA正是實驗?zāi)康男枰膕gRNA


    ①鑒定細(xì)胞生長必需的基因

    一個時間段內(nèi)的連續(xù)生長,減少的細(xì)胞中往往攜帶靶向細(xì)胞增殖所必需基因的sgRNA
    。這些基因可以通過比較每個sgRNA的相對頻率來找到
    。陰性篩選的一個重要應(yīng)用是鑒定癌細(xì)胞生長所必需的基因,而這些基因可能成為治療癌癥的新靶標(biāo)


    2014年
    ,Shalem等首次利用GeCKO文庫鑒定出人黑色素瘤細(xì)胞和多能干細(xì)胞存活的關(guān)鍵基因,研究結(jié)果與RNAi篩選結(jié)果高度一致


    ②篩選藥物抗性基因

    若敲除了抗藥性基因
    ,細(xì)胞在藥物壓力下不能存活,存活的細(xì)胞內(nèi)并沒有敲除目的基因
    ,最終富集的sgRNA不是目的sgRNA
    ,需要通過與對照組比較sgRNA消耗情況(或不同時間點的sgRNA豐度)來確定目的基因。

    1. 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控
    ,去除低質(zhì)量的reads
    ,使用clean reads data進(jìn)行后續(xù)分析。

    2.比對分析:將測序數(shù)據(jù)中拼接reads與sgRNA 文庫序列比對
    ,并對sgRNA 文庫中完全匹配的sgRNA 數(shù)目
    、丟失sgRNA、基尼指數(shù)等進(jìn)行統(tǒng)計


    ?Reads: Total number reads in the fastq file. (Recommended: 100~300 times the number of sgRNAs)

    ? Mapped: Reads that can be mapped to gRNA library

    ? Percentage: The percentage of mapped reads (Recommended: at least 60%)

    ? TotalsgRNAs: The number of sgRNAs in the library

    ? ZeroCounts: The number of sgRNA with 0 read counts(Recommended: no more than 1%)

    ? GiniIndex: The Gini Index of the read count distribution. Gini index can be used to measure the evenness of the read counts, and a smaller value means a more even distribution of the read counts. (Recommended: around 0.1 for plasmid or initial state samples, and around 0.2-0.3 for negative selection samples )

    3.sgRNA 及基因的read counts 統(tǒng)計

    CRISPR全基因組篩選的主要內(nèi)容便是統(tǒng)計sgRNA在不同樣本間的消耗和富集情況
    ,進(jìn)而推斷候選基因。

    4.主成分分析和樣品相關(guān)性聚類分析

    有助于考察樣本間的相似性和差異
    ,評估實驗設(shè)計的合理性以及對后續(xù)數(shù)據(jù)分析起到一定指導(dǎo)作用
    。對于有重復(fù)的實驗來說,樣本同一處理不同重復(fù)應(yīng)該盡可能聚在一起
    ,若存在個別重復(fù)樣本明顯偏離
    ,可以考慮剔除該樣本。樣品聚類還可用于判斷數(shù)據(jù)處理中是否剔除了批次效應(yīng)


    5.候選基因篩選

    MAGeCK-RRA算法根據(jù)測序結(jié)果中sgRNA的富集情況產(chǎn)生對應(yīng)基因位點的RRA得分
    ,RRA得分代表基因的必要性,RRA得分越小表明其重要性越高
    。MAGeCK返回RRA lo value(neg|score
    、pos|score)檢驗統(tǒng)計顯著性,并據(jù)此對基因進(jìn)行了排序
    ,按照實驗?zāi)康牡牟煌?div id="4qifd00" class="flower right">
    ,候選基因篩選可分為正向篩選和負(fù)向篩選,篩選指標(biāo)一般參考lfc(log2 fold change)和FDR(adjusted-pvalue),比如:根據(jù)lfc<-2且FDR<0.05進(jìn)行負(fù)向篩選
    ,lfc>2且FDR<0.05進(jìn)行正向篩選


    6.GSEA富集分析

    對CRISPR篩選得到的候選基因進(jìn)行富集分析以了解基因的更多功能,同時也可以對CRISPR篩選結(jié)果進(jìn)行驗證
    ,以便對潛在候選基因開展進(jìn)一步研究


    參考文獻(xiàn):

    [1]劉燕飛. 基于CRISPR/Cas9技術(shù)的HeLa細(xì)胞全基因組敲除文庫的建立及初步應(yīng)用[D].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2020.

    [2]Shalem,Ophir, et al. “Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells.”Science, vol. 343, no. 6166, 2014, pp. 84–87.

    [3]Zhou, Yuexin, et al. “High-Throughput Screening of a CRISPR/Cas9 Library for Functional Genomics in Human Cells.” Nature, vol. 509, no. 7501, 2014, pp. 487–491.

    [4]Kweon, Jiyeon, and Yongsub Kim. “High-Throughput Genetic Screens Using CRISPR-Cas9 System.” Archives of Pharmacal Research, vol. 41, no. 9, 2018, pp. 875–884.

    [5]Li, Wei, et al. “Quality Control, Modeling, and Visualization of CRISPR Screens with MAGeCK-VISPR.” Genome Biology, vol. 16, no. 1, 2015, pp. 281–281.

    [6]Wang, Binbin, et al. “Integrative Analysis of Pooled CRISPR Genetic Screens Using MAGeCKFlute.” Nature Protocols, vol. 14, no. 3, 2019, pp. 756–780.

    本文地址:http://www.mcys1996.com/jiankang/252529.html.

    聲明: 我們致力于保護(hù)作者版權(quán),注重分享

    ,被刊用文章因無法核實真實出處
    ,未能及時與作者取得聯(lián)系,或有版權(quán)異議的
    ,請聯(lián)系管理員
    ,我們會立即處理,本站部分文字與圖片資源來自于網(wǎng)絡(luò)
    ,轉(zhuǎn)載是出于傳遞更多信息之目的,若有來源標(biāo)注錯誤或侵犯了您的合法權(quán)益
    ,請立即通知我們(管理員郵箱:douchuanxin@foxmail.com),情況屬實
    ,我們會第一時間予以刪除
    ,并同時向您表示歉意,謝謝!

    上一篇:

    下一篇:

    相關(guān)文章
    單身貴族易群體性焦慮(單身貴族該怎么做)
     調(diào)查顯示80%的25至40歲的單身男人和女人“是快樂的”,專家提醒“剩男剩女”不快樂的背后隱藏了煩躁
    、焦慮
    ,甚至抑郁等消極情緒,而剛剛過去的情人節(jié)
    ,成為單身們焦慮的高發(fā)期
    芹菜與黃瓜同食好嗎
    芹菜與黃瓜同食好嗎芹菜不宜與黃瓜一同食用
    ,這是因為黃瓜中含有維生素C分解酶,這種物質(zhì)會導(dǎo)致芹菜的營養(yǎng)價值降低
    老人健康飲食的10大要點
    食要早早就是到了飯點得吃飯
    。另外,從中醫(yī)的角度講
    ,上午7點~9點是胃經(jīng)當(dāng)令的時候
    ,所以早飯最好安排在這個時間。中醫(yī)還說“胃不和則臥不安”
    ,因此晚飯也盡量早吃
    白帶常規(guī)能檢查出什么,白帶常規(guī)檢查的注意事項
    一、白帶常規(guī)能檢查出什么問題檢查目的:白帶是陰道黏膜滲出物
    、宮頸管及子宮內(nèi)膜腺體分泌物等混合組成
    ,其形成與雌激素的作用有關(guān)。用于檢查陰道內(nèi)有無滴蟲
    、念珠菌
    無氧運動是什么,有哪些好處(無氧運動的有什么好處)
    無氧運動是什么,有哪些好處無氧運動是運動的一種方式,我們比較常見的就是有氧運動
    ,有氧運動要比較無氧運動更有利于健康
    寶寶睡覺時驚厥的癥狀,如何預(yù)防小兒驚厥
    、寶寶睡覺時驚厥的癥狀有哪些癥狀一:嬰兒在剛?cè)胨瘯r或即將醒時滿頭大汗
    。專家提醒:可以說大多數(shù)嬰兒夜間出汗都是正常的。但如果大汗淋漓,并伴有其他不適的表現(xiàn)
    ,就要注意觀察
    榆錢怎么吃,春天嘗鮮就吃榆錢
    春季嘗鮮吃榆錢雖然榆錢寓意著富余
    ,但對50多歲的不少人來說卻是帶點痛苦的記憶
    。在生活困難時期,野菜
    、樹皮
    、樹葉……能吃的不能吃的,為了活命都嘗試過
    。到了我們這一代
    癌痛到底是陣痛還是持續(xù)痛?如何才能緩解
    ?一文科普
    ,不妨看看!
    癌痛指的是癌性疼痛
    ,是由于患上各種癌癥
    ,引起了神經(jīng)受壓等問題,從而使患者產(chǎn)生的疼痛現(xiàn)象
    。有很多人認(rèn)為,癌痛屬于陣發(fā)性的疼痛
    ,只要適當(dāng)服用藥物就能夠起到快速止痛的作用
    。但有不少人認(rèn)為,癌痛屬于劇烈且持續(xù)性的疼痛
    。那么
    ,癌痛到底是陣痛還是持續(xù)性
    2023-08-13
    !.png" alt="癌痛到底是陣痛還是持續(xù)痛
    ?如何才能緩解?一文科普
    ,不妨看看
    !" onerror="nofind(this)" >