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    支原體培養(yǎng)及藥敏結(jié)果怎么看,藥敏試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟

    佚名 2024-06-04 12:43:57

    、支原體培養(yǎng)及藥敏結(jié)果怎么看

    支原體培養(yǎng)結(jié)果上面會(huì)有具體的數(shù)值的。如果陽(yáng)性

    ,那就是培養(yǎng)出來(lái)了
    ,說(shuō)明有支原體感染。一般會(huì)同時(shí)做藥敏試驗(yàn)
    ,藥敏試驗(yàn)中標(biāo)志敏感的那些抗生素是可以用來(lái)治療支原體感染的。

    陽(yáng)性

    ,見(jiàn)于支原體感染
    ,可見(jiàn)于非淋球菌性尿道炎?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">!‘惓=Y(jié)果: 尿黃
    、尿道口微紅
    、尿頻
    、尿不盡、尿道痛
    ,燒灼感
    、尿滴瀝。需要檢查的人群: 疑似有支原體感染的病人
    。?支原體致病性較弱,一般不侵入血液,但可通過(guò)黏附作用與宿主細(xì)胞結(jié)合
    ,從細(xì)胞膜獲取脂質(zhì)和膽固醇
    ,使細(xì)胞膜損傷。溶脲脲原體可分解尿素放出大量的氨
    ,對(duì)細(xì)胞有毒害。

    在涂有細(xì)菌的瓊脂平板上

    ,抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴(kuò)散
    ,其濃度呈梯度遞減,因此在紙片周圍一定距離內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制
    。過(guò)夜培養(yǎng)后形成一個(gè)抑菌圈,抑菌圈越大
    ,說(shuō)明該菌對(duì)此藥敏感性越大
    ,反之越小
    ,若無(wú)抑菌圈
    ,則說(shuō)明該菌對(duì)此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度
    、劃線細(xì)菌濃度有直接關(guān)系。

    、藥敏試驗(yàn)有哪些步驟

    實(shí)驗(yàn)材料

    普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:可去生化試劑店購(gòu)買

    ,做不同細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)可選擇不同的培養(yǎng)基,如做大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)可選擇普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂或麥糠凱培養(yǎng)基
    。做沙門氏菌可選擇血清培養(yǎng)基

    藥敏試紙:購(gòu)買或自制(詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備)

    細(xì)菌:待做藥敏試驗(yàn)的細(xì)菌

    儀器:接種環(huán)、酒精燈

    、打孔器
    、牛津杯、移液器
    、滴頭

    實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

    2.1 藥敏片的準(zhǔn)備:購(gòu)買或自制

    2.1.1 制備方法:取新華1號(hào)定性濾紙

    ,用打孔機(jī)打成6毫米直徑的圓形小紙片
    。取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中
    ,瓶口以單層牛皮紙包扎。經(jīng)15磅15-20分鐘高壓消毒后
    ,放在37℃溫箱或烘箱中數(shù)天
    ,使完全干燥。

    2.1.2 抗菌藥紙片制作:在上述含有50片紙片的青霉素瓶?jī)?nèi)加入藥液0.25毫升,并翻動(dòng)紙片

    ,使各紙片充分浸透藥液,翻動(dòng)紙片時(shí)不能將紙片搗爛
    。同時(shí)在瓶口上記錄藥物名稱
    ,放37℃溫箱內(nèi)過(guò)夜,干燥后即密蓋
    ,如有條件可真空干燥。切勿受潮
    ,置陰暗干燥處存放
    ,有效期3-6個(gè)月。

    2.2 藥液的制備(用于商品藥的試驗(yàn)):按商品藥的使用治療量的比例配制藥液

    ;如商品藥百病消按其說(shuō)明量治療量0.01%飲水
    ,可按這個(gè)比例配制藥液,可取10毫克加入10毫升的水中混勻
    。此稀釋液即為用于做藥敏試驗(yàn)的藥液。

    實(shí)驗(yàn)操作方法

    3.1 藥敏片法

    3.1.1 在“超凈臺(tái)”中

    ,用經(jīng)(酒精燈)火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物
    ,以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式
    ;用滅菌接種環(huán)取適量細(xì)菌分別在平皿邊緣相對(duì)四點(diǎn)涂菌,以每點(diǎn)開(kāi)始劃線涂菌至平皿的1/2
    。然后
    ,找到第二點(diǎn)劃線至平皿的1/2,依次劃線
    ,直至細(xì)菌均勻密布于平皿
    。(另:可挑取待試細(xì)菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液
    ,用滅菌棉拭子將待檢細(xì)菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面
    。要求涂布均勻致密,直接懸液法要把菌液濃度用生理鹽水或PBS調(diào)到0.5個(gè)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)再涂布均勻
    。)

    3.1.2 將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停

    ,取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼
    ,可用鑷子輕按幾下藥敏片
    。為了使能準(zhǔn)確的觀察結(jié)果
    ,要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上;一般可在平皿中央貼一片
    ,外周可等距離貼若干片(外周一般可貼七片)
    ,每種藥敏片的名稱要記住。

    3.1.3 將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后

    ,觀察效果

    3.2 牛津杯法

    3.2.1 在“超凈臺(tái)”中,用經(jīng)(酒精燈)火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物

    ,以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上
    。具體方式;用滅菌接種環(huán)取適量細(xì)菌分別在平皿邊緣相對(duì)四點(diǎn)涂菌
    ,以每點(diǎn)開(kāi)始劃線涂菌至平皿的1/2
    。然后
    ,找到第二點(diǎn)劃線至平皿的1/2
    ,依次劃線,直至細(xì)菌均勻密布于平皿
    。(另:可挑取待試細(xì)菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液
    ,用滅菌棉拭子將待檢細(xì)菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密
    。)

    3.2.2 以無(wú)菌操作將滅菌的不銹鋼小管(內(nèi)徑6nm、外徑8nm

    、高10nm的圓形小管,管的兩端要光滑
    ,也可用玻璃管
    、瓷管),放置在培養(yǎng)基上
    ,輕輕加壓,使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙
    ,并在小管處標(biāo)記各種藥物名稱
    。每個(gè)平板可放4-6支小管。待分鐘后
    ,分別向各小管中滴加一定數(shù)量的各種藥液
    ,勿使其外溢。置37℃培養(yǎng)8-18小時(shí)
    ,觀察結(jié)果。

    3.2.3 將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后,觀察效果

    3.3 打孔法:

    該法較簡(jiǎn)單

    ,成本低,易操作
    ,比較適用于商品藥物的檢測(cè)

    3.3.1 在“超凈臺(tái)”中

    ,用經(jīng)(酒精燈)火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物
    ,以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式
    ;用滅菌接種環(huán)取適量細(xì)菌分別在平皿邊緣相對(duì)四點(diǎn)涂菌
    ,以每點(diǎn)開(kāi)始劃線涂菌至平皿的1/2。然后
    ,找到第二點(diǎn)劃線至平皿的1/2,依次劃線
    ,直至細(xì)菌均勻密布于平皿
    。(另:可挑取待試細(xì)菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液,用滅菌棉拭子將待檢細(xì)菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面
    。要求涂布均勻致密
    。)

    3.3.2 以無(wú)菌操作將滅菌的不銹鋼小管(外徑為4毫米

    、孔徑與孔距均為3毫米
    ,管的兩端要光滑,也可用玻璃管
    、瓷管)
    ,放置在培養(yǎng)基上打孔,將孔中的培養(yǎng)基用針頭挑出
    ,并以火焰封底,使培養(yǎng)基能充分的與平皿融合(以防藥液滲漏
    ,影響結(jié)果)

    3.3.3 加樣:按不同藥液加樣,樣品加至滿而不溢為止

    3.3.4 將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后

    ,觀察效果

    、藥敏試驗(yàn)的影響因素

    培養(yǎng)基

    細(xì)菌藥敏試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基種類較多

    ,多數(shù)情況下,采用WHO組織統(tǒng)一要求的M—H培養(yǎng)基
    ,這種培養(yǎng)基中含有的低胸腺嘧啶是與磺胺類藥物競(jìng)爭(zhēng)的物質(zhì)
    ,因此進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)效果較好
    。此外
    ,還有適量的Ca、Mg
    ,在培養(yǎng)基中起到觸媒的作用
    。但是,有些細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)基中的成分有特殊的要求
    ,特殊的菌要用特殊的培養(yǎng)基才能進(jìn)行藥敏試驗(yàn)
    。例如,流感嗜血桿菌的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基用HTM瓊脂
    ;淋球菌的藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基用加5%羊血的巧克力M—H瓊脂
    ;肺炎鏈球菌的藥敏實(shí)驗(yàn)用M—H瓊脂加5%的脫纖維羊血培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中還有適量的Ca
    、Mg,在培養(yǎng)基中起到溶酶的作用
    ,其含量的變化
    ,可影響氨基糖苷類和四環(huán)素對(duì)銅綠假單胞菌的試驗(yàn)結(jié)果,含量過(guò)高
    ,抑菌圈會(huì)變小
    ,含量過(guò)低,抑菌圈會(huì)大得不可接受

    細(xì)菌藥敏試驗(yàn)的培養(yǎng)基厚度大約為4mm,若培養(yǎng)基厚度大于4mm

    ,會(huì)使細(xì)菌出現(xiàn)耐藥;若小于4mm
    ,本應(yīng)耐藥的易出現(xiàn)敏感
    。所以,試驗(yàn)時(shí)一定不要把藥敏紙片放在中央部位
    ,而應(yīng)均勻地排布在平皿周圍的培養(yǎng)基上。制作藥敏試驗(yàn)的培養(yǎng)基用水
    ,主要是Ca
    、Mg
    、A1等礦物質(zhì)離子,也在很大程度上影響著藥敏試驗(yàn)的結(jié)果

    試紙片

    試紙片材質(zhì)的好壞

    ,對(duì)藥物穩(wěn)定性和活性有很大影響
    。加工藥敏試紙片的試紙一般是使用加厚型的濾紙
    ,雜質(zhì)少,對(duì)藥物保存無(wú)太大影響
    。然而
    ,臨床中很多用的是普通紙,被水浸潤(rùn)后會(huì)呈堿性
    ,并且含有大量無(wú)機(jī)離子
    ,因此使用普通紙加工的試紙片藥物有較大的影響
    。藥敏紙片的pH值一般要求為中性
    ,這樣才適合藥的活度。藥敏紙片的厚度要求大約1mm
    ,這樣才有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)和藥物的擴(kuò)散速度
    。藥敏紙片的直徑在6.00~6.35mm之間,紙片的厚度和直徑大小都會(huì)影響藥敏試驗(yàn)的結(jié)果

    含藥紙片的片間差和質(zhì)量好壞是做藥敏試驗(yàn)的關(guān)鍵。一些藥敏紙片買來(lái)時(shí)就有抑菌環(huán)偏大或偏小的問(wèn)題

    ,紙片之間又存在很大的片間差
    。因此,紙片在用前必須檢驗(yàn)其片間差和準(zhǔn)確度
    ,只有都達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求后才能使用
    。同時(shí)要注意紙片的保存,因?yàn)橛械募埰?div id="m50uktp" class="box-center"> ,如青霉素類,在保存中因?yàn)槭艹睗癍h(huán)境的影響容易降低其藥物的活性
    。因此
    ,紙片應(yīng)放低溫下(-10℃)保存,同時(shí)要避免潮濕
    ,以保持抗菌藥物的活性
    。盛紙片小瓶自低溫處取出應(yīng)在室溫平衡至少10min后再打開(kāi),避免冷凝水影響藥效

    細(xì)菌

    由于各種菌對(duì)藥物的敏感性不同

    ,產(chǎn)生的抑菌環(huán)大小不同,如果菌種不純
    ,試驗(yàn)中所產(chǎn)生的抑菌環(huán)大小與該菌種在純培養(yǎng)狀態(tài)下產(chǎn)生的抑菌環(huán)大小存在較大的差異
    ,影響判斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此需要對(duì)各種致病菌提純后
    ,分別進(jìn)行不同的藥敏試驗(yàn)
    。藥敏試驗(yàn)時(shí),需要將提純后的菌種配制成一定濃度的菌液
    。WHO組織制定的標(biāo)準(zhǔn)是要求菌液濃度在1.5億/ml 左右
    。若菌液濃度過(guò)高
    ,該菌會(huì)對(duì)所有藥物產(chǎn)生耐藥
    ;反之,菌液濃度過(guò)低
    ,該菌會(huì)對(duì)所有藥物均敏感
    。最精確的方法是使用分光光度計(jì)測(cè)定新鮮培養(yǎng)物菌懸液的吸光度,來(lái)確定菌液濃度
    。國(guó)家細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)的三級(jí)甲等醫(yī)院
    ,其微生物實(shí)驗(yàn)室大多數(shù)用此法來(lái)確定藥敏試驗(yàn)的菌液濃度

    藥敏試驗(yàn)中要將菌液均勻地涂在培養(yǎng)基上

    ,使細(xì)菌均勻分布,這樣才能使試驗(yàn)結(jié)果不會(huì)出現(xiàn)較大的偏差
    。涂菌后15min才能貼藥敏紙片
    。由于涂菌后,細(xì)菌要有一段時(shí)間的適應(yīng)過(guò)程
    ,但是時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng),否則會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥
    。貼藥敏紙片時(shí)
    ,每取一種藥敏紙片必須燒一下鑷子口,避免藥敏紙片之間相互混淆
    ,以提高藥敏的準(zhǔn)確性
    。藥物殺滅細(xì)菌存在一定的量比,藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基上細(xì)菌層越厚抑菌圈就越小
    ,反之抑菌圈就越大
    。根據(jù)一種藥物抑菌圈的有無(wú)或者大小
    ,只能判斷出該藥對(duì)細(xì)菌有沒(méi)有效果
    ,但其敏感性的高低需要通過(guò)科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)來(lái)確定。藥物的敏感程度需要根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果
    ,并結(jié)合以上因素做綜合分析
    ,才能得出科學(xué)的結(jié)論,而片面地根據(jù)藥敏圈的大小來(lái)決定敏感與否
    ,結(jié)果不夠準(zhǔn)確。

    、藥敏試驗(yàn)的分類

    紙片擴(kuò)散法

    該法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測(cè)試菌的瓊脂表面上

    ,紙片中的藥物在瓊脂中擴(kuò)散,隨著擴(kuò)散距離的增加
    ,抗菌藥物的濃度呈對(duì)數(shù)減少
    ,從而在紙片的周圍形成濃度梯度。同時(shí)
    ,紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的菌株不能生長(zhǎng),而抑菌范圍外的菌株則可以生長(zhǎng)
    ,從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈
    ,不同的抑菌藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴(kuò)散速度的影響而可能不同,抑菌圈的大小可以反映測(cè)試菌對(duì)藥物的敏感程度
    ,并與該藥物對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)

    稀釋法

    稀釋法藥敏試驗(yàn)可用于定量測(cè)試抗菌藥物對(duì)某一細(xì)菌的體外活性,分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法

    。實(shí)驗(yàn)時(shí),抗菌藥物的濃度通常經(jīng)過(guò)倍比(lg2)稀釋
    ,能抑制待測(cè)菌肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低藥物濃度成為最小抑菌濃度(MIC)
    ,一個(gè)特定抗菌藥物的測(cè)試濃度范圍應(yīng)該包含能夠檢測(cè)細(xì)菌的解釋性折點(diǎn)(敏感、中介和耐藥)的濃度
    ,同時(shí)也應(yīng)該包含質(zhì)控參考菌株的MIC

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