蛋白激酶A對NHE3的急性調(diào)節(jié)需多蛋白信號(hào)復(fù)合體參與

蛋白激酶A對NHE3的急性調(diào)節(jié)需多蛋白信號(hào)復(fù)合體參與

美國馬里蘭大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Edward J.Weinman博士及其同事就蛋白激酶A對NHE3的急性調(diào)節(jié)過程進(jìn)行了研究。

有關(guān)成纖維細(xì)胞的生物化學(xué)和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，在Na+/H+交換蛋白3（NHE3）活性的抑制過程和cAMP介導(dǎo)的磷酸化作用中，需要含PDZ基序的Na+/H+交換蛋白調(diào)節(jié)因子家族（NHERF和NHERF2）中一個(gè)成員的參與。

NHERF通過支架蛋白ezrin與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相互作用，以識(shí)別漿膜上的一種多蛋白信號(hào)復(fù)合體。最新的實(shí)驗(yàn)研究均集中于該模型的各個(gè)要素上。

首先，應(yīng)用特異性的抗體研究發(fā)現(xiàn)，NHERF定位于腎近端小管，而且與ezrin和NHE3位于同一部位。NHERF2見于腎小球、腎血管系統(tǒng)和集合管細(xì)胞，與ROMK位置相同。這種腎單位內(nèi)的不同分布表明NHERF和NHERF2具有不同的生理學(xué)作用。

其次，成纖維細(xì)胞中NHE3蛋白激酶A調(diào)節(jié)的信號(hào)復(fù)合體模型已延伸到上皮細(xì)胞。這一結(jié)果是通過建立顯性-陰性負(fù)鼠腎細(xì)胞系得出的。該細(xì)胞系表達(dá)ezrin結(jié)合結(jié)構(gòu)域缺陷的NHERF截短體。初步研究表明這些細(xì)胞具有正常的基底側(cè)Na+/H+交換蛋白活性，但對cAMP的抑制反應(yīng)較為遲鈍。

第三，生物化學(xué)、生物物理學(xué)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)已表明，NHERF自身以頭對頭構(gòu)型相結(jié)合，因而存在這樣的可能性，即該二聚體可改變活化型NHERF的可用性。

NHERF蛋白在腎臟中的潛在作用通過近年的研究已逐漸擴(kuò)大，它們涉及了許多其它轉(zhuǎn)運(yùn)體、受體和信號(hào)蛋白的膜定位、聚集、分選和調(diào)節(jié)作用。

研究人員認(rèn)為，NHERF和相關(guān)含PDZ基序的蛋白在腎臟轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)節(jié)過程中可能發(fā)揮著適配器的作用。

G0期細(xì)胞的重新增殖【Gβ類似蛋白－WDR26對細(xì)胞增殖的影響】

　　摘　要：WD40重復(fù)序列蛋白是一類結(jié)構(gòu)保守、功能復(fù)雜的蛋白。關(guān)于此類蛋白和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究顯示，該家族成員很可能通過調(diào)控胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而影響細(xì)胞基本生命活動(dòng)。在此前的研究中，我們報(bào)道了一個(gè)新基因WD40 repeatprotein 26的克隆。其初步研究結(jié)果顯示W(wǎng)DR26蛋白與MAPK信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控相關(guān)。在最近的研究中，我們構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCMV－WDR26表達(dá)載體的HeLa細(xì)胞系，結(jié)果顯示W(wǎng)DR26蛋白在HeLa細(xì)胞系中的過度表達(dá)，能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂，加快細(xì)胞的倍增速度。因此，WDR26很可能具有通過MAPK信號(hào)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的功能。
　　關(guān)鍵詞：WDR26蛋白；MAPK信號(hào)途徑；細(xì)胞增殖
　　中圖分類號(hào)：Q753
　　文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
　　文章編號(hào)：1007-7847(2006)02－0123－05
　　WD40重復(fù)序列蛋白(WDR)家族的成員廣泛地存在于真核生物中，其中研究最為深入的是G蛋白的β亞基(Cβ)。此類蛋白以4～16個(gè)保守的WD重復(fù)序列為家族結(jié)構(gòu)標(biāo)志。一個(gè)典型的WD重復(fù)序列由大約40個(gè)氨基酸組成，包括氨基端的GH、羧基端的WD和以Trp-Aspmotif為核心的中間序列。結(jié)構(gòu)分析說明，該家族成員具有保守的序列及空間結(jié)構(gòu)，WD40蛋白質(zhì)家族之所以廣受關(guān)注，不僅因?yàn)橐俗⒛康谋Ｊ匦钥臻g結(jié)構(gòu)，而且因?yàn)檫@一龐大家族所具有的異乎尋常的功能多樣性――其成員在真核生物中廣泛存在，影響著細(xì)胞生命活動(dòng)的方方面面。參與信號(hào)傳導(dǎo)過程的WDR蛋白，除了研究得最為詳盡的Gβ外，還有磷酸化酶亞基、蛋白激酶C的錨定蛋白以及多個(gè)信號(hào)途徑的調(diào)控因子，如hPIP2等。在RNA合成過程中，一些WDR蛋白是snRNP顆粒的組成部分。而作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的WDR蛋白則包括TATA-box結(jié)合復(fù)合體的TFIID亞單位。此外該家族成員還涉及從細(xì)胞骨架構(gòu)建、紡錘體組裝、小泡形成和運(yùn)輸，到細(xì)胞分裂的調(diào)控及霉菌中硫代謝的調(diào)控等細(xì)胞生命活動(dòng)。
　　在此之前，我們報(bào)道過關(guān)于WDR家族一個(gè)新成員WD40 repeat protein 26(WDR26)的初步研究工作。其結(jié)果顯示W(wǎng)DR26蛋白具有高度進(jìn)化保守性。該蛋白包含5個(gè)WD40重復(fù)序列，與該家族成員――PAK抑制蛋白hPIP1具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)。表達(dá)分析說明WDR26在成體和胚胎期的多數(shù)組織中都有表達(dá)，因此很可能與多類細(xì)胞的基本生命活動(dòng)相關(guān)。而進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄激活活性分析顯示，該蛋白能夠抑制有絲分裂活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)途徑的效應(yīng)因子――SRE和Elk－1的轉(zhuǎn)錄活性，很有可能對MAPK信號(hào)途徑起到負(fù)調(diào)控作用。
　　MAPK信號(hào)途徑是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程的重要組成部分。目前的研究表明，MAPK將G蛋白耦聯(lián)的受體等膜轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白與其細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵調(diào)控靶蛋白聯(lián)系起來，從而介導(dǎo)胞外的多種信號(hào)，如胰島素信號(hào)、表皮生長因子等，并將這些信號(hào)級(jí)聯(lián)放大后傳遞給相應(yīng)的下游因子，通過激活包括SRE、ELK-1、c-Jun、c-fos、MEF2、ATF2，等在內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子，最終開啟細(xì)胞特定功能基因的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞的生存及對外界的適應(yīng)能力。在對細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)中，MAPK表現(xiàn)出正負(fù)兩方面的調(diào)節(jié)活性。ERKl／2可通過氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ(一個(gè)嘧啶合成限速酶)的磷酸化作用來刺激DNA的合成。此外，ERK很有可能通過一些MAP―KAPK，如細(xì)胞周期抑制性激酶MYTl，來促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。同時(shí)也可以通過激活蛋白激酶p90Rsk使減數(shù)分裂細(xì)胞停留在分裂Ⅱ中期。ERK還可以通過激活A(yù)Pl活性，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞周期蛋白D1，從而間接刺激細(xì)胞增殖。
　　基于WD40家族的保守性結(jié)構(gòu)特征，其家族成員(如C蛋白β亞基，hPIPl)的重要生物學(xué)功能，以及此前研究結(jié)果所揭示W(wǎng)DR26的基本特性以及它與MAPK信號(hào)途徑的潛在關(guān)系，我們相信該蛋白在細(xì)胞的基本生命活動(dòng)中起著重要的調(diào)控作用。因此，在本文中我們進(jìn)一步分析WDR26對于細(xì)胞增殖過程的影響。
　　
　　1　材料和方法
　　1．1　細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞生長計(jì)數(shù)與流式細(xì)胞儀分析
　　生物安全柜及CO2培養(yǎng)箱(37℃／5％ CO2)均購自Forma公司。含氨芐青霉素(100mg／L)(BBl)和鏈霉素(100mg／L)(BBl)以及10％胎牛血清(杭州四季青公司)的DMEM培養(yǎng)基(GIBICBRL)，PBS(GIBIC BRL)，胰酶(0．05％)(GIBICBRL)，G418(Clontech)等分別用去離子水配制并按相應(yīng)要求滅菌或?yàn)V菌。細(xì)胞復(fù)蘇、接種、傳代、凍存均按常規(guī)操作進(jìn)行。
　　將HeLa細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基(無抗生素，無胎牛血清)的10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜。使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行pCMV-WDR26以及對照質(zhì)粒pCMV(均為10μg)的轉(zhuǎn)染。將100μL2．5mol／LCaCl2與25μg質(zhì)粒DNA在室溫下混合；用移液器將等體積的2×HEPES鹽溶液吹打起泡后，將以上2×鈣-DNA溶液逐滴加入，靜置1min；將磷酸鈣－DNA懸液轉(zhuǎn)移至上述單層細(xì)胞的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。除去培養(yǎng)基，用1×PBS洗細(xì)胞兩次，更換含氨芐青霉素和鏈霉素以及10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并使用300、200、100mg／L的梯度濃度進(jìn)行G418的篩選，3d更換一次培養(yǎng)基。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCMV-WDR26的HeLa細(xì)胞，使用含100mg／L濃度G418的DMEM培養(yǎng)基維持，實(shí)驗(yàn)時(shí)接種于24孔板(每孔1×104個(gè)細(xì)胞)，分別于接種后48、72、96、120h將細(xì)胞用胰酶消化，并按1：10或者1：100稀釋后進(jìn)行細(xì)胞數(shù)目計(jì)數(shù)。使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞計(jì)數(shù)板，每次計(jì)算10個(gè)方格的細(xì)胞總數(shù)×1000二細(xì)胞數(shù)目／mL。每次計(jì)數(shù)取3個(gè)樣品，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值，繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間。
　　按照上述方法接種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCMV-WDR26的HeLa細(xì)胞系于6孔板，每孔1×106個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后將細(xì)胞用胰酶消化法收獲，并離心后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。
　　1．2 抗原簇的位點(diǎn)分析與抗體的制備及純化
　　WDR26抗原簇位點(diǎn)分析使用DNAstar軟件進(jìn)行。將0．8mg抗原肽溶于0．5mL生理鹽水中，先與弗氏佐劑(購自Sigma公司)在注射器中推成乳劑(1：1)，在第1d和第3d分別對新西蘭大白兔(購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院)進(jìn)行背部皮下免疫注射，分散10～20個(gè)點(diǎn)；在第28d再將溶于0．5mL生理鹽水中的0．8g抗原肽與非完全弗氏佐劑(購自Sigma公司)在注射器中推成乳劑(1：1)，第3次進(jìn)行背部肌肉多點(diǎn)注射，第30天取血。兔血放在4℃冰箱中靜置過夜，以3 000r／min離心10本文為全文原貌 未安裝PDF瀏覽器用戶請先下載安裝 原版全文min，取血清分裝保存于－80℃下。通過印記親和吸附法純化抗體。
　　1．3 Western Blotting
　　收獲一個(gè)10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿(細(xì)胞密度80％)中的細(xì)胞，使用MRCgene公司的試劑盒一次性制備蛋白質(zhì)、DNA和RNA(操作步驟按公司說明進(jìn)行)。蛋白質(zhì)濃度測定按照Bradford方法進(jìn)行。
　　按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備10％SDS―聚丙烯酰胺凝膠，取10μL(50／xg)蛋白樣品溶液，用等體積的2μSDS凝膠加樣緩沖液稀釋，95℃水浴3min，以使蛋白質(zhì)變性，按順序用微量注射器點(diǎn)樣，接通電源，恒壓96V電泳，溴酚藍(lán)跑過積層膠后，恒定電壓150V。直到溴酚藍(lán)遷移到距膠的底部1cm處時(shí)，即停止電泳。
　　PVDF膜(購自Millipore公司)依次用甲醇預(yù)處理15s，去離子水浸潤5min，轉(zhuǎn)膜緩沖液浸潤5～10min。使用半干電轉(zhuǎn)法(北京六一儀器廠，DYCP-40C)把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜上，穩(wěn)流80mA(2．5 mA／cm2)，電轉(zhuǎn)1．5～2．0h．凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，膜經(jīng)1×麗春紅染色，以確認(rèn)轉(zhuǎn)膜效果。在膜上作好標(biāo)記后，用TBST漂洗數(shù)次，除去麗春紅。
　　實(shí)驗(yàn)前用TBST(含1％脫脂奶粉)將膜在4℃下封閉過夜(緩慢搖動(dòng))。用TBST的稀釋一抗(WDR26特異性多克隆抗體，1：10／His－Tag單克隆抗體，1：1 000，Novageu)將以上制備的膜在室溫下孵育2h。膜用TBST漂洗3次，每次20min。用TBST稀釋的二抗(HRP耦聯(lián)的羊抗兔IgG單克隆抗體／HRP耦聯(lián)的羊抗鼠IgG單克隆抗體，Santa Cruz Biotechnology)按1：1500稀釋后，將膜孵育1h；TBST漂洗3次，每次20min；TBS漂洗30min。用新配制的按1：50稀釋的DAB(Amresco，E885)顯色20min(按照產(chǎn)品說明進(jìn)行)，得到較好的信號(hào)-背景對比效果后用TBS中止反應(yīng)。
　　2　結(jié)果與討論
　　2．1 抗原簇的位點(diǎn)分析與抗體的制備
　　WDR26抗原簇位點(diǎn)分析使用DNAstar軟件進(jìn)行，結(jié)果如圖1．其中親水性較高、與家族基因的同源度較小的一段表面肽段(120aa－140aa)被選用作為抗原。我們利用化學(xué)合成的多肽為抗原，制備了WDR26的多克隆抗體，并利用抗原吸附的方法對血清進(jìn)行了純化。
　　
　　2．2 pCMV-WDR26穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的鑒定
　　為了對WDR26進(jìn)行進(jìn)一步研究，我們用該抗體對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCMV-WDR26的HeLa細(xì)胞系進(jìn)行了鑒定。將從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCMV-WDR26的HeLa細(xì)胞系及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCMV的對照細(xì)胞系中提取的總蛋白轉(zhuǎn)印到PDFV膜上，再分別用純化后的WDR26特異性抗體和anti-Flag單克隆抗體對其進(jìn)行Westernblot分析(圖2)。結(jié)果說明該純化抗體表現(xiàn)出較好的特異性，從而證明了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCMV-WDR26的細(xì)胞系已經(jīng)成功建立。在pCMV-WDR26穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中，WDR26的表達(dá)明顯強(qiáng)于對照細(xì)胞系中WDR26的表達(dá)。這說明HeLa細(xì)胞中存在內(nèi)源性WDR26蛋白，而我們轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒則增強(qiáng)了這一蛋白的表達(dá)。
　　
　　2．3 WDR26對細(xì)胞生長的影響
　　如前所述，MAPK信號(hào)途徑在細(xì)胞的生長過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用?？紤]到WDR26對該信號(hào)途徑潛在的抑制作用，我們希望知道它對于細(xì)胞生長是否也有一定的影響。我們分別建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCMV-WDR26的HeLa細(xì)胞系，并建立pCMV的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞系作為對照。通過對這兩個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行生長計(jì)數(shù)并繪制出細(xì)胞生長曲線(圖3)，24h之后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCMV-WDR26的HeLa細(xì)胞系的數(shù)目就已經(jīng)達(dá)到對照組的兩倍，并且這樣的生長速度一直持續(xù)到120h之后。這一結(jié)果說明WDR26的過度表達(dá)加快了HeLa細(xì)胞的倍增速度，使其倍增時(shí)間有一定程度的縮短。進(jìn)一步的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果也表明過量表達(dá)WDR26蛋白使停留在分裂相的HeLa細(xì)胞數(shù)目增多(圖4)，這說明WDR26具有促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用。
　　
　　
　　綜上所述，我們初步認(rèn)為WDR26蛋白對細(xì)胞的增殖有一定的促進(jìn)作用。MAPK信號(hào)途徑對細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)依賴于一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。雖然多數(shù)研究結(jié)果表明該途徑的激活可以促進(jìn)細(xì)胞生長，但對于細(xì)胞生存，MAPK具有正負(fù)兩方面的調(diào)控活性，例如Ras，ERK的激活因子被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而WDR26蛋白――具有Gβ的類似結(jié)構(gòu)，以及對MAPK信號(hào)途徑潛在的負(fù)調(diào)控作用――能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂，加速細(xì)胞的增殖過程。那么，WDR26與MAPK信號(hào)途徑的關(guān)系，該蛋白與Gβ在信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控中的相互關(guān)系都值得進(jìn)一步地深入探討。
　　致謝：感謝湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉筠教授實(shí)驗(yàn)室提供流式細(xì)胞儀!本文為全文原貌 未安裝PDF瀏覽器用戶請先下載安裝 原版全文

cAMP-PKA信號(hào)通路如何介導(dǎo)對基因表達(dá)的調(diào)控?

cAMP--PKA信號(hào)通路對真核細(xì)胞基因的表達(dá)的調(diào)控

這類反應(yīng)屬于慢反應(yīng)

主要過程:激素，G蛋白偶聯(lián)受體，G蛋白腺苷酸環(huán)化酶，cAMP，cAMP依賴的蛋白激酶A (PKA)PKA，催化亞基釋放進(jìn)入細(xì)胞核，使得基因調(diào)控蛋白(CREB) 磷酸化，磷酸化的基因調(diào)控蛋白與核內(nèi)結(jié)合蛋白特異結(jié)合形成復(fù)合物，復(fù)合物與靶基因調(diào)控序列結(jié)合，激活靶基因的表達(dá)

異源三聚體G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)

木霉的G蛋白由3個(gè)a-亞基、1個(gè)β-亞基和1個(gè)γ亞基組成（Schmoll，2008）。在異源三聚體G蛋白信號(hào)通路中，信號(hào)配體結(jié)合受體后，向細(xì)胞質(zhì)中釋放游離的G蛋白，GTP將結(jié)合與Ga亞基交換下來的GDP，而后Ga脫離βγ復(fù)合體，這樣Ga和Gβγ可以分別調(diào)控下游受體。真菌中G蛋白調(diào)控兩條信號(hào)通路：cAMP依賴的PKA途徑和促分裂素原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）途徑（圖4.2）。深綠木霉發(fā)現(xiàn)了4個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體，其中1個(gè)是孢子形成必不可少的（Brunner et al.，2008）。

深綠木霉G蛋白a亞基tga1基因缺失突變體強(qiáng)烈地產(chǎn)生孢子，菌絲生長受到抑制；在tga1基因過表達(dá)菌株中孢子形成被抑制，菌絲生長加速（Rocha-Ramirez et al.，2002）。深綠木霉tga3基因缺失突變體強(qiáng)烈地產(chǎn)生孢子，并且可以在黑暗中產(chǎn)生孢子（Zeilinger et al.，2005）。在tga1和tga3基因缺失突變體中cAMP含量降低，然而，添加cAMP不能恢復(fù)tga3突變體的野生型表型。這說明Tga3 經(jīng)cAMP依賴的通路介導(dǎo)了孢子的形成。然而，綠木霉tgaA和tgaB（tga1同源基因）基因敲除突變體的孢子形成表型與野生型一致（Seibel et al.，2009）。

圖4.2 深綠木霉G蛋白信號(hào)通路示意

注：GPCR：G蛋白偶聯(lián)受體；Tga1，Tga3：G蛋白a亞基亞組分Ⅰ和Ⅲ；Tmk1：促分裂素原活化蛋白激酶

（Omann et al.，2010）

tga1基因缺失突變體中幾丁質(zhì)酶基因 nag1（Nacetyl-glucosaminidase-encoding）和ech42（endochitinase 42-encoding）表達(dá)顯著下降，胞外幾丁質(zhì)酶活顯著降低，抗真菌物質(zhì)6-戊基-a-吡喃酮（6-pentyl-a-pyrone）分泌顯著減少（Reithner et al.，2005），然而，抗菌肽含量升高（Stoppacher et al.，2007）。tga3 基因缺失突變體中幾丁質(zhì)酶基因nag1和ech42表達(dá)升高，胞內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性增加，但是分泌到胞外的幾丁質(zhì)酶降低（Zeilinger et al.，2005）。

在研究里氏木霉光依賴的纖維素酶調(diào)控時(shí)發(fā)現(xiàn)：異源三聚體G蛋白信號(hào)通路參與了調(diào)控過程。cAMP信號(hào)通路參與了纖維素酶基因表達(dá)的調(diào)控和對光的響應(yīng)，而Tga3 同源蛋白GNA3參與了cAMP信號(hào)通路，所以GNA3最有可能同時(shí)具備調(diào)控纖維素基因表達(dá)和光響應(yīng)功能（Sestak et al.，1993；Tisch et al.，2009），基因gna3轉(zhuǎn)錄顯著地受光調(diào)控。在工程菌中持續(xù)地表達(dá)GNA3可以顯著上調(diào)光依賴型纖維素酶cbh1（cellobiohydrolase 1，纖維二糖水解酶）基因轉(zhuǎn)錄。然而在G蛋白a-亞基調(diào)控的纖維素酶表達(dá)過程中還需要一個(gè)誘導(dǎo)物（Schmoll et al.，2009）。在里氏木霉中光依賴型GNA3 調(diào)控纖維素酶表達(dá)，同時(shí)提高胞外幾丁質(zhì)酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶（N-acetylglucosaminidase）、β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-glucanase）脂肪酶（lipase）和磷酸酶（phosphatase）活性，在深綠木霉中光依賴型GNA3調(diào)控peptaibols抗菌肽的合成。敲除gna3基因后peptaibols抗菌肽產(chǎn)生和孢子形成受到完全抑制（Komon-Zelazowska et al.，2007）。因此，GNA3介導(dǎo)的信號(hào)通路在peptaibols抗菌肽合成中起到比光更重要的作用。

里氏木霉的G蛋白a-亞基GNA1介導(dǎo)了光調(diào)控的纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄，然而這一通路與GNA3不同。里氏木霉gna1缺失突變體中cbh1基因不轉(zhuǎn)錄，但是可以檢測到纖維素酶活性，在某些條件下cbh1可以在黑暗中大量表達(dá)（Seibel et al.，2009）。然而，即使作為組成性表達(dá)活性的G蛋白亞基GNA1 也無法在抑制性碳源甘油和葡萄糖存在時(shí)單獨(dú)誘導(dǎo)纖維素酶基因表達(dá)，或者解除碳的分解代謝產(chǎn)物的阻遏作用。因此，GNA1介導(dǎo)了光依賴型纖維素酶基因表達(dá)調(diào)控，而不是必要的誘導(dǎo)作用。深綠木霉中的gna1同源基因tga1抑制孢子生成，在tga1沉默的轉(zhuǎn)化株中孢子組成型地形成，然而過表達(dá)tga1基因的轉(zhuǎn)化株或組成型表達(dá)tga1的等位基因都不能使木霉在光照下產(chǎn)生孢子（Rocha-Ramirez et al.，2002）。這些對孢子形成的影響機(jī)制在里氏木霉中沒有被發(fā)現(xiàn)（Seibel et al.，2009）。里氏木霉 ENVOY 參與了 G 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，ENVOY 可以回補(bǔ) gna1 缺失造成的影響（Tisch et al.，2011b）。

真菌中G蛋白偶聯(lián)的受體（G-protein-coupled receptors，GPCRs）（Lafon et al.，2006）分為9類：Ⅰ和Ⅱ是信息素（pheromone）受體（與啤酒酵母S.cerevisiae Ste2p和Ste3p同源）；Ⅲ和Ⅳ可能是碳源和cAMP感受器；Ⅴ包含裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe Stm1 p-like 氮源感受器；Ⅵ位于細(xì)胞質(zhì)中，包含絲狀真菌GPCRs特有的RGS結(jié)構(gòu)域；Ⅶ是鼠生長激素釋放因子；Ⅷ是類固醇受體mPR；元件Ⅸ包含真菌視蛋白。通過信息生物學(xué)分析在里氏木霉中發(fā)現(xiàn)超過50個(gè)GPCRs?；谛畔⑸飳W(xué)分析，深綠木霉中克隆得到了4個(gè)GPCR編碼基因。Gpr1是第四類GPCRs，即cAMP受體相似蛋白（cAMP receptor-like proteins，CRL proteins），含有7次跨膜結(jié)構(gòu)，在深綠木霉?fàn)I養(yǎng)生長和孢子形成中起到重要作用（Brunner et al.，2008）。通過RNAi獲得的gpr1基因沉默菌株完全喪失了重寄生功能，外源cAMP可以恢復(fù)這種功能缺陷（Omann et al.，2009），這種現(xiàn)象類似于深綠木霉tga3基因缺失突變體的表型。

鈣調(diào)蛋白首先在綠木霉中被發(fā)現(xiàn)（Muthukumar et al.，1984）。使用鈣調(diào)蛋白抑制劑三氟拉嗪（trifluoperazine）和奎那克林（quinacrine）、鈣拮抗元素La2+、鈣螯合劑EGTA及Ca2+離子載體A23187進(jìn)行處理后，發(fā)現(xiàn)Ca2+/鈣調(diào)蛋白信號(hào)途徑對里氏木霉的生長及光誘導(dǎo)的孢子形成非常重要（Harman et al.，2002）。綠木霉的分生孢子產(chǎn)生過程依賴于鈣素平衡（Krystofova et al.，1995）。這個(gè)信號(hào)途徑似乎需要一個(gè)Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴型的蛋白激酶參與，該激酶能磷酸化一個(gè)20kDa的蛋白質(zhì)（Mach et al.，1998）。在尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）中發(fā)現(xiàn)該20kDa蛋白與轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白同源，這就表明鈣調(diào)蛋白信號(hào)途徑與G蛋白調(diào)控途徑緊密相關(guān)（Hoshino et al.，1992）。

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