豬鏈球菌的分離與鑒定

豬鏈球菌的分離與鑒定

作者：朱鳳才 楊華富 胡曉杼 汪華 王廣和 宋亞軍 楊瑞馥

2000年4月，陜西省岐山縣種豬繁育場仔豬流行關節(jié)炎和敗血癥。無菌采取患關節(jié)炎豬的關節(jié)液和患敗血癥豬的肝、肺、脾及腸系膜淋巴結各8份病料，并對這16份病料進行病原菌分離試驗、血清學鑒定、致病力試驗、保護力試驗、細菌回收試驗、藥敏試驗。結果表明：該病原菌為2型豬鏈球菌，引起關節(jié)炎的豬鏈球菌較引起敗血癥的豬鏈球菌致病力弱；該菌對頭孢菌素、青霉素高度敏感。

關鍵詞：豬鏈球菌 分離與鑒定

論文完成日期：2000年6月15日

目 錄

摘要………………………………………………1

前言………………………………………………2

1.試驗材料……………………………………….2

2.方法…………………………………………….2

2.1病原分離……………………………………..2

2.2分離菌株的鑒定……………………………..2

2.3致病力及保護力試驗………………………..3

2.4藥敏試驗……………………………………..3

3.結果…………………………………………….4

3.1分離菌的培養(yǎng)特性及形態(tài)特征….………….4

3.2生化試驗結果………………………………..5

3.3血清學鑒定結果……………………………..5

3.4致病力試驗及保護力試驗結果……………..5

3.5細菌回收試驗結果…………………………..5

3.6藥敏試驗結果………………………………..5

4分析與討論…………………………………….6

參考文獻…………………………………………7

豬鏈球菌的分離與鑒定

摘 要

2000年4月，陜西省岐山縣種豬繁育場仔豬流行關節(jié)炎和敗血癥。無菌采取患關節(jié)炎豬的關節(jié)液和患敗血癥豬的肝、肺、脾及腸系膜淋巴結各8份病料，并對這16份病料進行病原菌分離試驗、血清學鑒定、致病力試驗、保護力試驗、細菌回收試驗、藥敏試驗。結果表明：該病原菌為2型豬鏈球菌，引起關節(jié)炎的豬鏈球菌較引起敗血癥的豬鏈球菌致病力弱；該菌對頭孢菌素、青霉素高度敏感。

關鍵詞：豬鏈球菌 分離鑒定

前 言

豬鏈球菌（Streptococcosis suis）是豬的一種重要疾病，養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達國家如美、英、荷及愛爾蘭等常有本病發(fā)生。我國于1958年就有豬鏈球菌病的報道，1976年我國南方幾省曾一度廣泛流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大危害。

豬鏈球菌截止到目前已發(fā)現(xiàn)的莢膜型已超過30種[1]。我國于1995年首例鑒定證實2型豬鏈球菌在我國的存在[2]。豬鏈球菌可致2—6周齡仔豬敗血癥、腦膜炎、關節(jié)炎及支氣管肺炎等[3-7]。病豬和帶菌豬是本病的重要傳染源，病豬的鼻液、尿液、血液、肌肉、內(nèi)臟和關節(jié)內(nèi)均可檢出病原體。未經(jīng)無害處理的病死豬肉、內(nèi)臟及廢棄物是散播本病的重要原因，呼吸道是本病的主要傳播途徑。本病一年四季均可發(fā)生，但以4—10月份發(fā)生較多。本病常為地方性流行性，多呈敗血性。短期波及全群，如不進行防治，則發(fā)病率、病死率很高，慢性常為地方性散發(fā)性傳染。

2000年4月，岐山縣種豬繁育場仔豬流行關節(jié)炎及敗血癥，多為2—6周齡仔豬。無菌采取關節(jié)炎病豬的關節(jié)液及敗血癥病豬的肝、脾、肺及腸系膜淋巴結，經(jīng)實驗室分離鑒定，證實為2型豬鏈球菌?，F(xiàn)將分離鑒定結果報告如下。

1． 實驗材料

1．1病料 無菌采取岐山縣種豬繁育場患關節(jié)炎病豬的關節(jié)液8份，編號為1—8號，無菌采取患敗血癥豬的肝、肺、脾及腸系膜淋巴結8份，編號為9—16號。

1．2試劑 試驗所用的各種糖均購自上?；瘜W試劑二廠，批號自95—98年不等。

1．3培養(yǎng)基 綿羊鮮血平板、匹克氏增菌液、10ml/L豬血清肉湯及各種糖培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備[8]。

1．4血清學試驗 豬鏈球菌診斷血清與平板凝集抗原均購自中國獸藥鑒察所，批號為990705。

1．5藥敏紙片 購自浙江省軍區(qū)后勤部，批號20000312。

1．6試驗動物 健康小白鼠（30—35g）50只，購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心。

2． 方法

2．1病原分離

將所采病料分別涂片，革蘭氏染色鏡檢，然后，分別接種鮮血瓊脂平板。37℃需氧培養(yǎng)24h后，挑取可疑菌落接種于匹克氏增菌液，37℃培養(yǎng)24h后，革蘭氏染色，顯微鏡檢查，再接種血清肉湯，純化后放置4℃，冷藏備用。

2．2分離菌株的鑒定

2．2．1生化試驗

隨機抽取上述分離菌血清肉湯培養(yǎng)物3#、8#、13#、15#，分別接種于蔗糖、山梨醇、棉實糖、葡萄糖、甘露糖、蕈糖、乳糖、菊糖、水楊苷、馬尿酸鈉培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h后，觀察其對糖的利用情況。

2．2．2血清學鑒定

將3#、8#、13#、15#菌經(jīng)緩沖肉湯培養(yǎng)8h，通過3000r/min離心10min，PBS洗滌2次，用Ph7.2的0.01mol/L PBS制成1*1010~2*1010細菌懸液。取1滴上述細菌懸液與適當?shù)目寡逶跐崈舨Ｆ匣靹?，立即觀察凝集現(xiàn)象。同時，設立細菌懸液對照及血清對照。

2．3致病力及保護力試驗

2．3．1菌落形成單位的測定 按常規(guī)方法進行[9]

2．3．2致病力試驗

無菌吸取上述血清肉湯培養(yǎng)物（含菌量5.0*108CFU/ml）以0.1ml/只、0.2ml/只、0.3ml/只、0.4ml/只、0.5ml/只分別腹腔注射小白鼠2只，觀察其死亡時間和數(shù)量，測定其最小致死量。再將上述血清肉湯培養(yǎng)物腹腔注射小白鼠，小白鼠共14只，分7組。第一組，每只小白鼠注射3#菌0.2ml，第二組每只注射8#菌0.2ml，第三組每只注射3#、8#菌各0.1ml，第四組每只注射13#菌0.2ml，第五組每只注射15#菌0.2ml，第六組每只注射13#、15#菌各0.1ml，第七組每只注射無菌血清肉湯1.0ml。以上各組分別飼養(yǎng)觀察其死亡時間及數(shù)量。

2．3．3保護力試驗

將3#、8#、13#、15#血清肉湯培養(yǎng)物分別接種于18cm鮮血平板。37℃培養(yǎng)24h后，收菌，用麥氏比濁管比濁，適當稀釋，然后用0.3%甲醛滅活；37℃作用24h；作無菌檢驗。然后分別腹部皮下接種小白鼠2只，0.4ml/只。10天后，再分別人工感染，0.2ml/只。

2．3．4細菌回收試驗

對致病力試驗出現(xiàn)癥狀及死亡小白鼠剖檢，并采集病料，進行分離。

2．4藥敏試驗

采用紙片擴散法，用無菌棉簽蘸取分離菌的血清肉湯培養(yǎng)物，均勻涂布于9cm鮮血平板；待稍干后，用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼在培養(yǎng)基表面，4℃2h使藥物擴散，然后置37℃培養(yǎng)20—24h，觀察結果。結果按抑菌圈直徑大小和各抗菌藥的具體標準，評定為高度敏感、中度敏感或耐藥。結果評定參照表1。

表1各種抗菌藥物的抑菌圈與敏感標準

抗菌藥物名稱

抑菌圈直徑（mm）

耐藥

中度敏感

高度敏感

青霉素

土霉素

潔霉素

鏈霉素

慶大霉素

卡那霉素

頭孢菌素

10~12

10~14

10~14

10~14

13~14

13~14

10~15

>13

>15

>15

>15

>15

>15

>15

3．結果

3．1分離細菌的培養(yǎng)特性及形態(tài)特征

3．1．1培養(yǎng)特性

37℃培養(yǎng)24h后，所采的12份病料在鮮血瓊脂平板上形成表面光滑、隆起的灰綠色小菌落，外層有明顯的β溶血環(huán)。該菌在匹克氏增菌液中底部有沉淀，在血清肉湯中先均勻渾濁，后在試管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。

3．1．2染色特性

關節(jié)液、鮮血瓊脂、匹克氏增菌液及血清肉湯培養(yǎng)物涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查為革蘭氏陽性，在關節(jié)液、鮮血瓊脂培養(yǎng)物中多呈單個、雙球或短鏈狀排列，在匹克氏增菌液及血清肉湯培養(yǎng)物中多呈長鏈狀。

3．2生化試驗結果（見表2）

表2分離菌生化試驗結果

鑒定 蔗糖 山梨 棉實 葡萄 甘露 蕈糖 乳糖 菊糖 水楊 馬尿

項目 醇 糖 糖 糖 苷 酸鈉

3#+--++++++-

8#+--++++++-

13#+--++++++-

15#+--++++++-

判定標準：“+”表示大多數(shù)（90%—100%）菌株為陽性；“-”表示大多數(shù)（90%—100%）菌株為陰性。

表2表明分離的3#、8#、13#、15#菌的生化反應結果均符合豬鏈球菌的生化特性，說明分離的菌均為豬鏈球菌。

3．3血清學鑒定結果

將3#、8#、13#、15#細菌懸液與1/2及2型抗血清混合，立即可見明顯的凝集現(xiàn)象，但不與1型及其他型抗血清出現(xiàn)凝集。直接挑取細菌菌落與血清混勻，也能得到一致結果。陰性對照均未見凝集現(xiàn)象。

3．4致病力試驗結果及保護力試驗結果

3．4．1致病力試驗結果

第一組、第二組小白鼠注射血清肉湯培養(yǎng)物48h內(nèi)均未見死亡，第三組48h內(nèi)有一只死亡，第四組、第五組、第六組在注射血清肉湯培養(yǎng)物18h內(nèi)全部死亡。死亡后，小白鼠皮膚發(fā)紺，剖檢肝、脾、肺、心出血，呈敗血癥。第七組健活。由于第一、二、三組死亡數(shù)量非常少，所以，再用相同劑量分別背部皮下接種小白鼠各2只，48h后處死，剖檢發(fā)現(xiàn)注射部位有直徑0.9~1.1cm的膿腫，濃汁呈黃綠色。

3．4．2保護力試驗結果 免疫的小白鼠再經(jīng)攻毒后均未發(fā)病。

3．5細菌回收試驗結果

將上述死亡及發(fā)病的小白鼠剖檢采集病料，進行細菌分離、生化試驗及血清學鑒定，能得到原分離菌。

3．6藥敏試驗結果（見表3）

表3藥敏試驗結果

菌號

抑菌環(huán)直徑（mm）

頭孢菌素 青霉素 潔霉素 卡那霉素 土霉素 鏈霉素 慶大霉素

3#19151413877

8#18161313867

13#19161413778

15#19151314888

平均值18.7515.513.513.257.757.07.5

表3表明，結果敏感的藥物依次是：頭孢菌素、青霉素；中度敏感的依次是：潔霉素和卡那霉素；而對土霉素、鏈霉素、慶大霉素具有抗藥性。

4．分析與討論

4．1豬鏈球菌（Streptoccus suts）是危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要病原菌。80年代初，加拿大由豬鏈球菌引起的疾病開始增加。那時僅檢出9種夾膜血清型，其中2型是最常見的。

4．2豬鏈球菌病在臨床上有敗血型、腦膜腦炎型、關節(jié)炎型支氣管炎型等。過去屢有敗血型豬鏈球菌的報道，而關于集約化養(yǎng)豬場關節(jié)炎型鏈球菌病的報道較少。本次試驗從患關節(jié)炎豬的關節(jié)液中成功的分離出了豬鏈球菌。另外，岐山種豬場，約有60%的仔豬流行關節(jié)炎，嚴重者可發(fā)生敗血癥而死亡，給種豬場造成巨大的經(jīng)濟損失。所以，研究本病可為生產(chǎn)中防制本病提供理論依據(jù)。

4．3病豬和帶菌豬是本病的重要傳染源。病豬的鼻液、尿液、肌肉、內(nèi)臟和關節(jié)內(nèi)均帶有病原體，所以，我們建議，首先應加強對健康豬的免疫。另一方面，在發(fā)病后，加強病豬和健康豬的隔離，根據(jù)實驗室所做的藥敏試驗結果，配合藥物治療，建議用頭孢菌素、青霉素、潔霉素等藥物治療。岐山縣種豬繁育場采納我們的建議后，首先對所有的未發(fā)病仔豬用滅活疫苗免疫接種，對已發(fā)病的豬用青霉素等藥物配合治療。另外，注意衛(wèi)生管理。目前該病已得到有效的控制。

4．4從致病力試驗結果可以看出，引起豬關節(jié)炎的豬鏈球菌的致病力較小，而引起敗血癥的豬鏈球菌的致病力較強。但通過生化試驗和血清學鑒定，它們又是同種細菌且血清型也相同。為什么同種血清型的豬鏈球菌的致病力差別很大？這個問題還有待于進一步研究。

參考文獻

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豬鏈球菌病治療方案

　　應用抗菌類藥物治療有效。當分離出致病鏈球菌后，應立即進行藥敏試驗。根據(jù)試驗結果，選出具有特效作用的藥物進行全身治療?？梢赃x用青霉素、新霉素、氨芐青霉素、鹽酸林可霉素、卡那霉素以及磺胺類藥物進行治療。與此同時，飼料和飲水中添加維生素A、維生素K等，適當降低養(yǎng)殖密度，改善飼養(yǎng)環(huán)境，加強飼養(yǎng)管理可促進本病的治療效果。

　　1．敗血型全身療法 對敗血癥型及腦膜炎型，采用抗敗血性休克療法，應早期大劑量使用抗生素或磺胺類藥物，還應采用對癥療法，補充營養(yǎng)，如投予葡萄糖、電解質(zhì)、維地塞米松等。

　?。?）初發(fā)病豬每頭每次用青霉素或氨芐青霉素80-180萬國際單位，鏈霉素lg混合肌注，連用3-5d：也可用先鋒霉素Ⅵ。

　　（2）高熱的重癥豬可用較大劑量阿莫西林的氨基比林稀釋后一側注射，另一側注射復方磺胺五甲氧嘧啶。按使用說明中規(guī)定的劑量首次加倍，每天兩次，直至癥狀消失。

　　（3）加倍量青霉素肌注，每4-6hl次，連用3d。對危重病豬，首先肌肉注射醫(yī)用青霉素G鈉鹽160萬國際單位，30min后再靜脈滴人5%葡萄糖鹽水注射液200-500mL+醫(yī)用青霉素G鈉鹽1 60萬國際單位?(4-8)支，1日1次；同時按每4- 6hl次肌注醫(yī)用青霉素G鈉鹽160萬國際單位?(4-8)支，連用3日后每日肌注兩次直至痊愈，可取得顯著療效。因敗血型常發(fā)生肺炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎等使病程拖長，治療時間延長，故應作好對癥療法和加強護理工作，適時防止繼發(fā)感染，選用支原凈、氟苯尼考、強力霉素、乙基環(huán)丙沙星等敏感藥物。

　　（4）復方磺胺嘧啶鈉肌肉注射，首次用藥加倍，1日2次，連用4-5d。復方敵菌凈拌料對出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的病豬有一定的療效。

　　2．腦膜炎型全身療法 除可用磺胺嘧啶等藥外，還可用林可霉素肌注，連用3-5d；或紅霉素緩慢靜注，1日2次，連用3 - 5d，同時可注山梨醇防止腦水腫。

　　3．淋巴結膿腫型局部治療 先將皮膚、關節(jié)及臍部等處的局部潰爛組織剝離，膿腫應予切開，清除膿汁，用3%雙氧水或1%高錳酸鉀溶液清洗和消毒。然后用抗生素或磺胺類藥物（懸液、軟膏或粉劑）置入患處，必要時可施以包扎。

豬鏈球菌病的專家觀點

1. 人感染豬鏈球菌病是一種嚴重的疾病，嚴重病例病情進展非?？?，如果診斷、治療不及時，預后較差，病死率極高，所以一旦懷疑此病，應該到有細菌培養(yǎng)條件的醫(yī)院接受診斷和治療，并積極做血培養(yǎng)和有關分泌物培 養(yǎng)，分離并原菌，以便得到準確的診斷治療。
2. 人感染豬鏈球菌病是可治之病，早期發(fā)現(xiàn)，治療及時非常重要。
3. 對于高危人群如屠夫、屠場工人或吃了不潔的涼拌病/死豬肉或吃生的豬肉丸子、洗切加工處理病/死豬肉的人，出現(xiàn)畏寒、發(fā)熱等應該及時到醫(yī)院接受檢查和治療，以免延誤診斷和治療。

如何防治豬鏈球菌??？

（1）治療 對病豬進行隔離治療。如已分離出病原菌，最好通過藥敏試驗，選用最有效的抗菌藥物治療；如尚未分離出病原菌，疑似本病時，采用對革蘭氏陽性菌有效的抗生素治療，如青霉素、金霉素等。中藥治療：生石膏300～500克，細生地30～60克，水牛角15～30克，川黃連30～60克，梔子15～30克，桔梗9～24克，黃芩15～30克，知母15～30克，赤芍15～30克，玄參15～30克，連翹15～45克，甘草9～24克，丹皮15～45克，鮮竹葉15～30克。水煎，1劑/天，分2～3次胃管投服，連服3～6天。同時配合解熱類藥物及抗生素治療。

（2）免疫預防 在疫區(qū)或疫場，可用死菌苗或弱毒苗進行免疫預防。每噸飼料中加入土霉素400克，連喂2周，有一定預防效果。對剛產(chǎn)出的仔豬注意臍帶的消毒，防止臍帶感染。帶菌母豬為主要傳染源，應進行及時治療，并及時淘汰無經(jīng)濟價值的母豬。

試分析發(fā)生豬鏈球菌病的因素有哪些

豬鏈球菌病的類型及防治

　　冬季天氣寒冷，養(yǎng)殖場應警惕鏈球菌病流行爆發(fā)，避免給養(yǎng)豬場帶來不必要的經(jīng)濟損失。豬鏈球菌病是一種急性、熱性、敗血性傳染病，主要分為以下類型。
　　疫病類型

　　急性敗血癥型一般發(fā)生在流行初期，突然發(fā)病，往往還未見任何癥狀就死亡，體溫升至41℃~42℃，在數(shù)小時至1天內(nèi)死亡。精神委頓，腹下有紫紅色斑。
　　腦膜炎型多發(fā)于哺乳仔豬和保育仔豬，發(fā)病初期，患豬體溫升高，食欲廢絕，便秘，有漿液性或粘液性鼻液，繼而出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，轉圈，空嚼，磨牙，直至后軀麻痹，共濟失調(diào)，側臥于地，四肢作游泳狀，頸部僵直，角弓反張，甚至昏迷死亡。部分豬出現(xiàn)多發(fā)性關節(jié)炎、關節(jié)腫大，病程1~2天。
　　關節(jié)炎型多發(fā)生于小豬，關節(jié)腫大，跛行，臥地不起。病豬精神沉郁，食欲減退。體溫升高到41℃以上，呈稽留熱，呼吸促迫，心跳增速，糞便干燥，有的呈算盤子狀，糞便表面常有粘液。后由一肢變?yōu)閮芍弁?。病豬耳部、胸部、腹部出現(xiàn)紫斑。
　　化膿性淋巴結炎型病豬淋巴結腫脹、堅硬、有熱痛感，采食、咀嚼、吞咽和呼吸較為困難，多見于頜下淋巴結化膿性炎癥，咽喉、耳下、頸部等淋巴結也可發(fā)生。病程為3~5個星期，病豬經(jīng)治療后，腫脹部分中央變軟，皮膚壞死，破潰流膿，并逐漸痊愈。該病需通過實驗室檢驗出豬鏈球菌方可確診。
　　防治措施

　　預防措施發(fā)病后全場立即進行普查，隔離病豬，減少傳播；對有膿腫，尿囊積液，后肢麻痹，癱瘓的病豬予以淘汰，實行獨立防疫體系，可避免人員相互流動和生豬相互接觸傳播。
　　加強飼養(yǎng)管理加強通風換氣，每欄宜養(yǎng)6~8頭豬。加強衛(wèi)生，尿糞分離，欄桿清潔。若免疫不及時或免疫失敗發(fā)生鏈球菌病時，同群健康豬應立即接種鏈球菌病疫苗實行緊急預防，全場每周一次大消毒，消毒后在豬舍內(nèi)噴灑護舍安，使舍內(nèi)有益菌大量增殖，減少病原傳播。
　　定期添加營養(yǎng)物質(zhì)在飲水中交替添加優(yōu)樂舒等，以增強生豬的免疫力和減少應激。
　　切斷傳播途徑引種時，首先在隔離場飼養(yǎng)45天，經(jīng)觀察、檢測確認該豬無病后回本場飼養(yǎng)?；貓龊笤趫鰠^(qū)隔離場再飼養(yǎng)45天，實行仔豬早期免疫技術，即3~5日齡口服4頭份豬鏈球菌病疫苗進行首次免疫，50~60日齡肌注2頭份進行加強免疫以防止免疫失敗。
　　免疫失敗主要有2個因素：一是免疫給藥期間使用抗菌藥或飼喂含抗菌素的飼料，殺傷了部分抗原；二是免疫劑量不夠。所以，在使用鏈球菌病疫苗的前后10天共20天內(nèi)，不能使用抗菌藥和含抗菌素的飼料。免疫前后10天添加1%的促免1號，增強疫苗免疫水平。
　　藥物治療對發(fā)病豬治療首選藥物是氨芐青霉素、青霉素、阿莫西林和頭孢噻呋，肌肉注射，每天3次，連用2天；5%葡萄糖溶液500毫升、維生素C注射液10毫升，靜脈注射，每天2次，連用2天。對出現(xiàn)跛行癥狀豬，可配合使用鎮(zhèn)痛藥物治療；對出現(xiàn)高熱豬，應配合使用解熱鎮(zhèn)痛藥物；對淋巴結膿腫豬，待膿腫成熟變軟后，及時切開，排出膿汁，用0.1%高錳酸鉀液沖洗后，涂上碘酊，配合注射青霉素等抗菌藥物，短期內(nèi)避免用水沖洗，以防感染。

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