多肽物質(zhì)分子量檢測(cè)技術(shù)

多肽物質(zhì)分子量檢測(cè)技術(shù)

隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的飛速發(fā)展，具有高生物活性的多肽類化合物的分離、純化和分析已顯得尤為突出。許多分離、純化和分析技術(shù)都是以分子量的大小為手段的，現(xiàn)將我們采用的幾種主要的技術(shù)介紹如下：凝膠過(guò)濾測(cè)相對(duì)分子量該技術(shù)即凝膠過(guò)濾層析，也稱分子排阻層析或凝膠滲透。利用凝膠過(guò)濾可以把蛋白質(zhì)多肽類混合物按分子量的大小分離出來(lái)。當(dāng)不同分子大小的蛋白質(zhì)多肽類混合物流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，由于不同大小的分子所經(jīng)路徑不同而得到分離，大分子先被洗脫出來(lái)，小分子后被洗脫出來(lái)。

該方法簡(jiǎn)單，不要求復(fù)雜的儀器就可較準(zhǔn)確地測(cè)出蛋白質(zhì)多肽的相對(duì)分子量。另外，利用該技術(shù)測(cè)Mr（相對(duì)分子量）還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即待測(cè)物可以不純。

該技術(shù)一般采用交聯(lián)葡聚糖為基質(zhì)，其商業(yè)名稱為Sephadex。根據(jù)需要可選用SephadexG－25（分級(jí)分離的Mr范圍5000以下）、SephadexG－75（Mr范圍3000～80000）、SephadexG－100(Mr范圍4000～150000)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的分子量對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)、洗脫體積為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測(cè)品的洗脫體積從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它的Mr。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)相對(duì)分子量在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉（SDS）和少量巰基乙醇，蛋白質(zhì)多肽類混合物的電泳遷移率將主要取決于它們的相對(duì)分子量，而與電荷和形狀無(wú)關(guān)。

目前，對(duì)于小分子多肽的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，選擇合適的系統(tǒng)及合適的分離膠、濃縮膠甚至是間隙膠的濃度和交聯(lián)度一直是人們研究的熱點(diǎn)。另外，應(yīng)選擇合適的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量范圍，使得待測(cè)品的分子量能落在此范圍內(nèi)。

實(shí)驗(yàn)測(cè)定時(shí)，以各種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Mr的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，其μR（相對(duì)遷移率）為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測(cè)品的μR從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它們的Mr。高效凝膠排阻色譜（HPSEC）技術(shù)測(cè)相對(duì)分子量HPSEC是一種基于分子篩原理與高速流動(dòng)的流動(dòng)相的層析分離方法，該技術(shù)快速、靈敏、高效，對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的處理與凝膠過(guò)濾一樣。

固定相的孔徑大小及流動(dòng)相速度直接影響分離效果。固定相原材料主要有Sw和Pw兩種，但一般情況下，仍首先考慮采用Sw型。主要規(guī)格有TSK－2000Sw(適合于5000～100000的蛋白多肽)、TSK－4000Sw(適合50000～1000000)等。流動(dòng)相一般為緩沖液（常用磷酸或醋酸緩沖液），也可含有機(jī)溶劑（甲醇或乙腈）和變性劑（尿素、胍、SDS）。

以上簡(jiǎn)要介紹了多肽類分子量測(cè)定的幾種常用技術(shù)。隨著科學(xué)技術(shù)水平的不斷發(fā)展，會(huì)有許多更新的技術(shù)不斷涌現(xiàn)，因此這一領(lǐng)域的研究具有廣闊的前景。

多肽的常見(jiàn)問(wèn)題匯總與解答（上） 干貨滿滿

根據(jù)以往客戶對(duì)于多肽如何保存使用等等的常見(jiàn)問(wèn)題，我們?cè)谶@里進(jìn)行了匯總整理，希望對(duì)各位有所幫助

01

我該如何處理和保存多肽？

凍干粉形式的多肽，經(jīng)密封包裝可在常溫條件下穩(wěn)定運(yùn)輸，溶解狀態(tài)的多肽不宜長(zhǎng)期保存。

昂拓萊司多肽保存指南：需要長(zhǎng)期保存的多肽，應(yīng)以凍干粉形式存放在含有干燥劑的密封容器內(nèi)，置于-20°C保存，-80°C效果更好，可以最大限度地避免多肽降解。這種儲(chǔ)存方式可以使多肽可保存數(shù)年，避免了被細(xì)菌降解和氧化，也可以避免二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。

打開(kāi)包裝： 在打開(kāi)包裝和稱重前，請(qǐng)先將多肽在干燥器中平衡至室溫。因多肽往往具有吸濕性，未經(jīng)平衡到室溫的多肽在打開(kāi)蓋子后易凝結(jié)，從而降低了多肽產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

稱重： 迅速稱取您所需的多肽，并將剩余多肽繼續(xù)儲(chǔ)存在-20°C或更低溫度。與其他多肽相比，含有半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和谷氨酸N -末端的多肽保存期更短。

02

如何溶解多肽？

昂拓萊司生產(chǎn)的多肽的溶解性很大程度上取決于多肽的極性。酸性的蛋白溶解于堿性溶液，而堿性蛋白可溶解于酸性溶液，含有大量不帶電荷的極性氨基酸殘基或疏水性氨基酸的疏水性多肽和中性多肽可先溶解于少量有機(jī)溶劑中，如DMSO、DMF、醋酸、乙腈、甲醇、丙醇或異丙醇，然后加水（蒸餾水）稀釋。含有甲硫氨酸或半胱氨酸的多肽不能用DMSO溶解，因?yàn)镈MSO可能造成側(cè)鏈氧化。

多肽溶解測(cè)試：在多肽溶解之前先取小部分進(jìn)行多肽溶解測(cè)試，您需要測(cè)試幾種不同的溶劑，直到找到最適當(dāng)?shù)囊环N。超聲處理有助于打碎顆粒并增加溶解度。（注意: 超聲處理會(huì)引起溶液發(fā)熱和多肽降解。）

將每個(gè)酸性氨基酸賦值為－1，包括天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、以及羧基末端-COOH。每個(gè)堿性氨基酸賦值為＋1，包括精氨酸（R）、賴氨酸（K）、組氨酸（H）以及氨基末端-NH2。然后計(jì)算整個(gè)多肽的電荷數(shù)。

如果整段肽所帶電荷是陽(yáng)性的，說(shuō)明該肽是堿性的?？上葒L試用蒸餾水來(lái)溶解；如果不溶于水，接著嘗試用少量10%-25%醋酸溶解，如果仍然失敗的話，添加一些TFA（10-50微升）來(lái)增溶，然后用水稀釋至理想濃度。

如果整段肽所帶電荷是陰性的，說(shuō)明該肽是酸性的。酸性的多肽可以嘗試用PBS（PH 7.4）來(lái)溶解，如果不溶的話，添加少量的堿性溶劑，如0.1 M的碳酸氫銨，然后加水稀釋至理想濃度。含有游離半胱氨酸的多肽應(yīng)溶于脫氣的酸性緩沖液中，因?yàn)楫?dāng)PH值大于7時(shí)，巰基會(huì)被迅速氧化成二硫化物。

如果整段肽電荷是零，說(shuō)明肽是中性的。中性肽通常溶于有機(jī)溶劑。首先，昂拓萊司建議您嘗試添加少量乙腈、甲醇或異丙醇。對(duì)于高度疏水的多肽，可使用少量的二甲基亞砜溶解，然后用水稀釋至理想濃度。對(duì)于含有自由半胱氨酸的肽，需使用DMF而不是DMSO。對(duì)于有聚集傾向的肽，可添加6M鹽酸胍或8M尿素，然后進(jìn)行必要的稀釋。

為了防止或盡量減少多肽降解，請(qǐng)將多肽以凍干粉形式保存在-20°C，-80°C更佳。如果需要保存溶液肽，最好分成小樣存放，以避免反復(fù)凍融。一份樣品融凍后未用完，應(yīng)扔掉。細(xì)菌降解有時(shí)會(huì)成為溶液肽的麻煩，所以請(qǐng)將肽溶于無(wú)菌水或肽溶液過(guò)濾除菌。

堿性氨基酸: K, R, H,N-terminus

酸性氨基酸: D, E,C-terminus

極性中性氨基酸: F, I,L, M, V, W, Y

非極性疏水氨基酸: G, A,S, T, C, N, Q, P, 乙?；?，酰胺基

舉例說(shuō)明：

RKDEFILGASRHD:(+5) + (-4) = +1 認(rèn)為是堿性多肽

EKDEFILGASEHR:(+4) + (-5) = -1 認(rèn)為是酸性多肽

AKDEFILGASEHR:(+4) + (-4) = 0 認(rèn)為是中性多肽

03

一個(gè)肽段是否可溶能預(yù)測(cè)嗎？

昂拓萊司無(wú)法通過(guò)研究多肽的結(jié)構(gòu)來(lái)預(yù)測(cè)其在水中的溶解度。然而，賴氨酸的ε-氨基和精氨酸的胍通常有助于預(yù)測(cè)溶解度，尤其是短肽。與此相反，含有天門冬氨酸和谷氨酸的酸性肽往往是不易溶于水的，但易溶于稀氨水或堿性緩沖液。

04

如何選擇適合自己研究的多肽純度？

昂拓萊司不推薦將粗品肽使用于生物實(shí)驗(yàn)。粗肽可能含有大量的非肽類雜質(zhì)，如殘留的有機(jī)溶劑、清除劑、TFA和其他不完整肽。TFA不能被完全消除，通常交付的肽以TFA鹽的形式存在。如果殘留的TFA影響您的實(shí)驗(yàn)，我們推薦其他鹽形式，如醋酸鹽和鹽酸鹽等。這些鹽通常比常規(guī)TFA鹽貴20-30%以上。這是由于在轉(zhuǎn)化過(guò)程中出現(xiàn)更多的肽損失和需要更多的原材料。

昂拓萊司建議對(duì)各種項(xiàng)目采用以下級(jí)別的肽純度：

>70% 肽純度

肽微陣列

作為制備抗體的抗原

層析法

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)抗血清滴度

>80% 肽純度

免疫印跡法（非定量）

酶底物肽（非定量）

封閉肽（非定量）

親和純化

磷酸化檢測(cè)

蛋白電泳的應(yīng)用和免疫細(xì)胞化學(xué)

>95% 肽純度

標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和RIA（定量）

受體配體相互作用（定量）

體內(nèi)、體外

生物學(xué)測(cè)定

酶的研究和阻斷實(shí)驗(yàn)（定量）

NMR研究

質(zhì)譜分析

其他定量檢測(cè)

>98% 肽純度

SAR研究

臨床試驗(yàn)

APIs(藥物活性成分)

工業(yè)品

X-ray晶體研究

其他敏感的實(shí)驗(yàn)：酶與底物、受體與配體相互作用、阻斷和競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)

05

什么是多肽的純度？

多肽的純度是指HPLC方法在214nm處檢測(cè)到的目標(biāo)多肽的含量(214nm是肽鏈的吸收波長(zhǎng))，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)不到水和殘留的鹽不?？砂l(fā)現(xiàn)其他的雜質(zhì)包括：缺失序列（缺失了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的靶序列），截?cái)嘈蛄校用边^(guò)程中產(chǎn)生的序列）脫保護(hù)不完全序列（產(chǎn)生于整個(gè)合成過(guò)程或最后的裂解過(guò)程）。

多肽純化不涉及水和鹽。HPLC純化會(huì)產(chǎn)生少量的TFA，如：游離的氨基末端和其他側(cè)鏈如Arg、Lys、His都可生成少量TFA雜質(zhì)。昂拓萊司通常交付的多肽多含有微量TFA和殘留水。即使處于凍干狀態(tài)，水也會(huì)因共價(jià)結(jié)合的能力不同而不同程度地存在著。

純化前的多肽中包含的雜質(zhì)包括多肽和非多肽物質(zhì), 純化后的多肽中包含的雜質(zhì)除了TFA鹽，大多數(shù)為序列被修改的多肽。

缺失了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的靶序列

為避免缺失序列的產(chǎn)生而進(jìn)行的加帽操作，截?cái)嘈蛄屑串a(chǎn)生于加帽過(guò)程中

產(chǎn)生于整個(gè)合成過(guò)程或最后的裂解過(guò)程

保護(hù)基重新附著在多肽的其他位置

06

什么是肽凈含量？

肽凈含量不同于多肽純度。肽凈含量是指與非肽物質(zhì)（主要為抗衡離子和水）相比的多肽量。可通過(guò)氨基酸分析來(lái)確定肽凈含量。通常，親水性多肽即使在嚴(yán)格的凍干狀態(tài)下，也會(huì)吸收微量的水。因純化和凍干工藝，會(huì)導(dǎo)致不同批次的肽凈含量有所不同。

07

如何合成多肽？

不同于天然蛋白質(zhì)的合成，人工合成的方向是從C到N端。昂拓萊司的多肽合成是基于PeptideSyn技術(shù)平臺(tái)的Fmoc或t-Boc法的多肽合成。具體合成由下列幾個(gè)循環(huán)組成：①去保護(hù)：Fmoc保護(hù)的柱子和單體必須用piperidine去除氨基的保護(hù)基團(tuán)。②激活和交聯(lián)：下一個(gè)氨基酸的羧基被一種活化劑所活化?；罨膯误w與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián)，形成肽鍵。③循環(huán)：這兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到合成完成。接著合成的肽從樹(shù)脂切割和去保護(hù)。最后被沉淀、洗脫、冷凍干燥。

08

我應(yīng)該用什么鹽形式？

肽通常以TFA鹽的形式傳遞。如果殘留的TFA對(duì)您的實(shí)驗(yàn)有問(wèn)題，我們建議其他鹽形式，如醋酸鹽和鹽酸鹽。這些鹽形式通常比普通的TFA鹽貴20-30%，因?yàn)樵邴}轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)生肽損失，并且需要更多的原材料。

09

如何對(duì)合成的多肽進(jìn)行質(zhì)檢？

公司對(duì)客戶提供的所有材料均嚴(yán)格保密。昂拓萊司是在發(fā)送產(chǎn)品時(shí)，同時(shí)免費(fèi)提供HPLC和MS檢測(cè)結(jié)果。公司所有多肽均采用反相色譜法純化。以質(zhì)譜法測(cè)定肽的分子量來(lái)確定產(chǎn)品是否正確，MS檢測(cè)結(jié)果還可顯示大部份的主要雜質(zhì)。如果必要，還可提供肽凈含量檢測(cè)，如氨基酸分析或元素分析。這些方法可以證實(shí)多肽的氨基酸組成，他們均可作為多肽確認(rèn)的補(bǔ)充方法。所有交付的肽均達(dá)到了客戶要求的純度。沒(méi)有達(dá)到純度要求的那些多肽均被丟棄。當(dāng)然如果客戶需要，也可以發(fā)送給他們。

10

公司對(duì)合成的多肽提供分裝服務(wù)嗎？

根據(jù)要求，昂拓萊司可以將您的部分或全部訂單，免費(fèi)分裝成小份。由于少量分裝可以避免多次反復(fù)凍融，減少容器的開(kāi)蓋和閉合的次數(shù)，減少處理不當(dāng)或細(xì)菌污染的機(jī)會(huì)，讓您的多肽更加穩(wěn)定。

歡迎各位提問(wèn)關(guān)注，還有什么不清楚的有疑問(wèn)的，可以隨時(shí)聯(lián)系我們！

多肽在環(huán)境分析的應(yīng)用

多肽是由蛋白質(zhì)水解后得到的一類鏈狀化合物，其分子量較小，具有一定的生物活性和生物學(xué)功能。在環(huán)境分析領(lǐng)域，多肽具有以下應(yīng)用：
1. 水環(huán)境監(jiān)測(cè)
多肽可以作為水質(zhì)污染的生物指示物，通過(guò)對(duì)多肽的檢測(cè)，可以快速、準(zhǔn)確地評(píng)估水環(huán)境污染的程度和變化趨勢(shì)。比如，通過(guò)檢測(cè)特定類型的多肽，可以確定水環(huán)境中是否存在重金屬、有機(jī)污染物等物質(zhì)。
2. 氣體環(huán)境監(jiān)測(cè)
多肽可以應(yīng)用于氣體環(huán)境分析中，如空氣質(zhì)量監(jiān)測(cè)。研究人員可以利用多肽和其它生物標(biāo)志物等信息，綜合分析大氣污染物的來(lái)源、分布和演化規(guī)律。
3. 重金屬污染研究
多肽的結(jié)構(gòu)對(duì)重金屬離子有選擇性吸附，具有較好的重金屬富集作用。研究人員可以利用具有一定親和力的多肽結(jié)構(gòu)，研究重金屬離子在環(huán)境中的轉(zhuǎn)移、遷移和積累規(guī)律，進(jìn)而評(píng)估重金屬污染的流行和風(fēng)險(xiǎn)。
4. 生物毒性測(cè)定
多肽分子具有一定的活性，可以作為生物毒性測(cè)定的重要指標(biāo)。研究人員可以利用多肽的特點(diǎn)，研究微生物、藻類、魚(yú)類、高等植物等生物在不同環(huán)境因子下的毒性反應(yīng)，并對(duì)環(huán)境因子和毒性關(guān)系的研究提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。
5. 環(huán)境污染物的篩查和監(jiān)測(cè)
多肽具有較強(qiáng)的識(shí)別能力和選擇性，可以應(yīng)用于環(huán)境污染物的篩查和監(jiān)測(cè)。研究人員可以通過(guò)生物分子技術(shù)，篩查出環(huán)境污染物在不同生物樣本中的含量，并對(duì)污染源、污染程度等相關(guān)問(wèn)題進(jìn)行分析和研究。
綜上所述，多肽在環(huán)境分析中具有廣泛應(yīng)用前景。隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展和更新，多肽在環(huán)境分析領(lǐng)域的應(yīng)用也會(huì)不斷地得到推廣和擴(kuò)展。

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