寡核苷配體研發(fā)突飛猛進(jìn)

寡核苷配體研發(fā)突飛猛進(jìn)

寡核苷具有專一識別性，能與包括離子、整個細(xì)胞、毒素、低分子量配體、多肽類與蛋白質(zhì)等多種類的功能目標(biāo)物結(jié)合。由于寡核苷順序具有比其他已知“互補(bǔ)順序”與目標(biāo)物更強(qiáng)、更專一的結(jié)合力，這一特性使得寡核苷為基礎(chǔ)的測定技術(shù)可用于各種新領(lǐng)域，如醫(yī)療、化學(xué)分離技術(shù)以及生物傳感器等等。近年來，國外醫(yī)藥業(yè)界和臨床醫(yī)學(xué)界對寡核苷的應(yīng)用前景產(chǎn)生了濃厚的興趣，與之相關(guān)的各種研究也取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展。

新藥研發(fā)

在上世紀(jì)90年代中，美國科學(xué)家曾試圖將寡核苷配體用于醫(yī)療。這種人工合成的核苷由于具有極高的蛋白質(zhì)親和力故能阻滯體內(nèi)的受體，抑制蛋白質(zhì)活動，它們成為當(dāng)時不少醫(yī)藥研發(fā)機(jī)構(gòu)篩選新藥時的目標(biāo)。

寡核苷配體具有分子量小、半衰期短、低生產(chǎn)成本、良好的生物相容性和與體內(nèi)抗體無交叉反應(yīng)性等優(yōu)點(diǎn)，故具有廣泛的醫(yī)療應(yīng)用前景。但問題在于人的血液中存在有大量的“核苷酶”，如若直接將寡核苷配體加工成制劑，它進(jìn)入人體后，很快就會因核苷酶的分解而失活。為避免這一結(jié)果，最好的辦法是將寡核苷配體進(jìn)行化學(xué)修飾，如將天然右旋型寡核苷加工成左旋型寡核苷。這樣一來，人體內(nèi)的核苷酶就無法識別并分解人工合成的寡核苷配體類制劑。

美國一公司在幾年前已開發(fā)上市了一種寡核苷配體類新藥Macugen。它能用于治療老年人群常見的一種棘手眼病——視網(wǎng)膜黃斑退化癥。這種眼病的發(fā)生與視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的異常生長有關(guān)。而新開發(fā)的Macugen能抑制視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的過度生長，因此能防止視網(wǎng)膜黃斑退化和視力下降。美國食品藥品管理局（FDA）去年已正式批準(zhǔn)Macigem作為老年性視網(wǎng)膜黃斑退化癥的治療劑。由Gilead公司開發(fā)的ARC183是另一種具有治療作用的寡核苷配體類新藥。它是一種抗凝血酶藥物，臨床上可用于治療血栓病和預(yù)防血液凝固。此藥現(xiàn)已順利通過Ⅰ期臨床試驗。

據(jù)最新報道，美國一公司正在研制一種專門用于抑制乙肝病毒促使體內(nèi)釋放“腸促胰腺液”（一種多聚蛋白質(zhì)）的新型寡核苷配體類藥物。而由乙肝病毒引起的腸促胰腺液能導(dǎo)致病人發(fā)生危險的溶血癥。

分離化學(xué)

由于寡核苷有很強(qiáng)的結(jié)合力和專一性，故它在分離化學(xué)方面亦有良好應(yīng)用前景，如從復(fù)雜的混合物中提取分離出目標(biāo)物質(zhì)等等。雖然抗體也有極強(qiáng)親和力，可用作靜止相的受體分子，但抗體在色層法中的應(yīng)用受到一定限制。寡核苷配體由于能克服抗體的上述缺陷，所以可用于“親和色譜法”中。例如，腺苷及其衍生物利用以靜止相為載體的寡核苷配體可加以純化。同樣原理，以靜止相為載體的寡核苷配體還可用于分離出手性氨基酸或多環(huán)芳香烴類化合物。這類例子不勝枚舉。

新型生物傳感器

寡核苷配體另一用途是作為“生物識別元件”，用于生物傳感器用途。所謂“生物傳感器”，系指能選擇性地測定一種“被分析物”并借助物理傳導(dǎo)方法產(chǎn)生一種生物類產(chǎn)品的可測出的相應(yīng)信號。生物傳感器的分析目標(biāo)并非只限于生物制品一種。實際上任何化學(xué)“被分析物”均可用生物傳感器進(jìn)行測定。“寡核苷配體傳感器”就是一種使用寡核苷配體作為生物識別元件的新穎傳感器。上世紀(jì)90年代末，首個寡核苷配體生物傳感器才剛剛問世。

過去10年來，西方學(xué)者發(fā)表了眾多的有關(guān)寡核苷配體生物傳感器的研究文獻(xiàn)。這些寡核苷配體生物傳感器通常使用熒光標(biāo)記。例如，測定L－腺苷可用“消散波引導(dǎo)熒光技術(shù)”；測定凝血酶可用“寡核苷配體－熒光驟冷對”。目前寡核苷配體已被成功用于多種檢測技術(shù)中。如“石英晶體微平衡”（QCM）與“表面等離子振子共振”（SPR）是兩種被廣泛應(yīng)用的傳導(dǎo)和測定非標(biāo)記寡核苷配體的技術(shù)。測定一種無標(biāo)記蛋白質(zhì)的方法是利用“微織懸臂傳感器”，其作用是：作為TaqDNA多聚酶的受體與寡核苷配體反應(yīng)。至于寡核苷配體與免疫球蛋白E(IgE)之應(yīng)可通過原子力顯微鏡法加以測定。此外，測定凝血酶與艾滋病毒（HIV）逆多肽可使用表面聲波生物傳感器排列偶合寡核苷配體。

最近，美國又開發(fā)出兩種寡核苷配體傳感器。例如，一種由兩種寡核苷配體組成的“三明治構(gòu)型”可作為新型生物傳感器并用“阻抗光譜法”來測定寡核苷與IgE的敏感反應(yīng)。由于寡核苷分子能產(chǎn)生可測定的對應(yīng)于被分析物信號變化，故寡核苷配體可作為電化學(xué)法的“信號燈”。這方面的新成功應(yīng)用實例是，一種用“二茂鐵”標(biāo)記的寡核苷配體信號燈生物傳感器可用于測定凝血酶，而另一種以電化學(xué)寡核苷配體為主要成分的“信號燈”可用于檢測血樣（或其他物體）中的可卡因成分。

新型寡核苷配體的開發(fā)成功為人們提供了更為有效的鑒別方法與生產(chǎn)技術(shù)（如SELEX等等）、便捷的化學(xué)合成法（如在分析支持下的直接自動合成）、高密度固相化、測定一切毒物以及在非生理條件下的穩(wěn)定性等等。然而，寡核苷配體圖集首先應(yīng)與抗體相匹配。其次，在采用寡核苷配體作為原材料之前必須先行確定開發(fā)最優(yōu)化和確定障礙的分析方法。

【相關(guān)鏈接】

寡核苷配體（Aptamer）系一種小分子人工合成寡核苷類化合物（oligonucleotides），通常由40~100個氨基酸分子所組成。

寡核苷配體是美國3個不同的科研小組在1990年研究脫氧核糖核酸的酶活力時偶然發(fā)現(xiàn)。他們在試管中分離具有酶功能的核糖核酸時，偶然發(fā)現(xiàn)了一種無規(guī)則分布的8個核苷酸順序。他們發(fā)明的“指數(shù)富集法配體進(jìn)化系統(tǒng)（SELEX）”為一種新穎寡核苷配體生產(chǎn)技術(shù)，該項生產(chǎn)技術(shù)已獲得美國專利。利用SELEX方法能順利鑒定大多數(shù)可作為酶使用的選擇性寡核苷配體。

此后不久，美國馬薩諸塞州總醫(yī)院的研究人員宣布說，他們發(fā)現(xiàn)了100種無規(guī)則分布的寡核苷，它們與業(yè)已確認(rèn)的寡核苷完全不同。新發(fā)現(xiàn)的寡核苷之中有不少有可能成為新的“寡核苷配體”。上述新發(fā)現(xiàn)震動了全球化學(xué)界。

凝膠的生物

生物分子下游純化的對象一般包括蛋白、酶、重組蛋白、單抗、抗體及抗原、肽類、病毒、核酸等。純化前首先需要測定生物分子的各物理和化學(xué)特性，然后通過實驗選擇出最有效的純化流程。
1.測定——分子量、PI
當(dāng)目標(biāo)蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚時，可用PAGE電泳方法或?qū)游龇椒右詼y定。分離范圍廣闊的Superose HR預(yù)裝柱很適合測定未知蛋白的分子量。用少量離子交換介質(zhì)在多個含不同PH緩沖液的試管中，可簡易地測出PI，并選擇純化用緩沖液的最佳PH。
2.選擇——層析方法
若對目標(biāo)蛋白的特性或樣品成分不太了解，可嘗試幾種不同的純化方法：
一 使用最通用的凝膠過濾方法，選擇分離范圍廣闊的介質(zhì)如Superose、Sephacryl HR依據(jù)分子量將樣品分成不同組份。
二 用含專一配體或抗體的親和層析介質(zhì)結(jié)合目標(biāo)蛋白。亦可用各種活化偶聯(lián)介質(zhì)偶聯(lián)目標(biāo)蛋白的底物、受體等自制親和介質(zhì)，再用以結(jié)合目標(biāo)蛋白。一步即可得到高純度樣品。
三 體積大的樣品，往往使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品，可再用疏水層析純化。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理，洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用于純化流程中。
3.純化——大量粗品
處理大量原液時，為避免堵塞柱子，一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大顆粒離子交換介質(zhì)。擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)利用多種STREAMLINE介質(zhì)，直接從含破碎細(xì)胞或組織萃取物的發(fā)酵液中俘獲蛋白。將離心、超濾、初純化結(jié)合為一。提高回收率，縮短純化周期。
4.純化——硫酸氨樣品
硫酸氨沉淀方法常被用來初步凈化樣品，經(jīng)處理過的樣本處于高鹽狀態(tài)下，很適合直接上疏水層析。若作離子交換，需先用Sephadex G-25脫鹽。疏水層析是較新技術(shù)，隨著介質(zhì)種類不斷增多，漸被融入各生產(chǎn)工藝中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八種疏水介質(zhì)中選擇最適合介質(zhì)及最佳的純化條件。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。
5.純化——糖類分子
固化外源凝訂素如刀豆球蛋白、花生、大麥等凝集素，可結(jié)合碳水化合物的糖類殘基，很適合用作分離糖化細(xì)胞膜組份、細(xì)胞、甚至亞細(xì)胞細(xì)胞器，純化糖蛋白等。兩種附上外源凝集素的Sepharose 6MB親和層析介質(zhì)，專為俘獲整個細(xì)胞或大復(fù)合物，如膜囊等。
6.純化——膜蛋白
膜蛋白分離常使用去污劑以保持其活性。離子性去污劑應(yīng)選用與目標(biāo)蛋白相反電荷者，避免在作離子交換時和目標(biāo)蛋白競爭交換介質(zhì)，藉此除去去污劑。非離子性去污劑可以疏水層析除去。
7.純化——單抗、抗原
單抗多為IgG.來源主要是腹水和融合瘤培養(yǎng)上清液。在培養(yǎng)前除去IgG.重組蛋白A介質(zhì)Mabselect和rProtein A Sepharose FF對IgG有更高的載量和專一性，基團(tuán)脫落更少。脫落的rProtein A用離子交換Q Sepharose HP或凝膠過濾Superdex 200，很容易去除。
疏水層析Phenyl Sepharose HP亦很適合純化IgG.宿主抗體和污染IgG可用凝膠過濾Superdex 200在精細(xì)純化中去除。
純化IgG抗原最有效的方法是用活化偶聯(lián)介質(zhì)如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶聯(lián)IgG，再進(jìn)一步獲取IgG抗原。
HiTrap IgM是用來純化融合瘤細(xì)胞培養(yǎng)的單抗IgM，結(jié)合量達(dá)5mg IgM.HiTrap IgY是專門用來純化IgY，結(jié)合量達(dá)100mg純IgY.
8.純化——重組蛋白
重組蛋白在設(shè)計、構(gòu)建時應(yīng)已融入純化構(gòu)想。樣品多夾雜了破碎細(xì)胞或溶解產(chǎn)物，擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)STREAMLINE便很適合做粗分離。Amersham biosciences提供三個快速表達(dá)、一步純化的融合系統(tǒng)。
一 GST融合載體使要表達(dá)的蛋白和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶一起表達(dá)，然后利用Glutathione Sepharose 4B作親和層析純化，再利用凝血酶或因子Xa切開。
2. 蛋白A融合載體使要表達(dá)的蛋白和蛋白A的IgG結(jié)合部位融合在一起表達(dá)，以IgG Sepharose 6 FF純化。
二 含組氨酸標(biāo)記（Histidine-tagged）的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金屬，在一般或變性條件（8M尿素）下透過組氨酸螯合融合蛋白。HisTrap試劑盒提供整套His-Tag蛋白的純化方法。
9.純化——包涵體蛋白
包涵體蛋白往往需溶于6M鹽酸胍或8M尿素中。一般包涵體蛋白樣品的純度越高，復(fù)性效果越好。SOURCE 30 RPC反相層析介質(zhì)很適合純化復(fù)性前的粗品，并可以1MnaOH重生。此方法純化后的包涵體蛋白，復(fù)性回收率明顯提高。
10.包涵體蛋白固相復(fù)性
許多文獻(xiàn)報導(dǎo)將包涵體蛋白在變性條件下固定（吸附）在層析介質(zhì)上，一般用各種Sepharose FF離子交換層析介質(zhì)。而且無需大量稀釋樣品，并將復(fù)性和初純化合二為一，大大節(jié)省時間及提高回收率。
固相復(fù)性方法也被用于以HiTrap Chelating金屬螯合層析直接復(fù)性及純化包涵體形式表達(dá)的組氨酸融合蛋白；以HiTrap Heparin肝素親和層析直接復(fù)性及純化包涵體形式表達(dá)的含多個賴氨酸的融合蛋白。兩種親和層析預(yù)裝柱均可反復(fù)多次重復(fù)使用，比一般試劑盒更方便、耐用。
11.純化——中草藥有效成分
中藥的化學(xué)成分極其復(fù)雜。例：如用甲醇分離黃酮甙，三糖甙先被洗下來，二糖甙其次，單糖甙隨后，最后是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各種試劑，廣泛用于各種天然產(chǎn)物的分離，包括生物堿、甙、黃酮、醌類、內(nèi)脂、萜類、甾類等。
生物堿在酸性緩沖液中帶正電，成為鹽，HiTrap SP陽離子交換層析柱可以分離許多結(jié)構(gòu)非常近似的生物堿。相反，黃酮、蒽醌、皂甙、有機(jī)酸等可溶于偏堿的緩沖液中，在HiTrap Q陰離子交換柱上分離效果良好。
一般多糖純化大多使用分子篩如Sephadex，Sephacryl.若分子量在600KD以下，并需更高分辨率，可選擇新一代的Superdex.一般植物可能含水溶性、酸溶性、堿溶性多種多糖。SOURCE5、15、30RPC反相層析也很適合各種中藥有效成分的檢測、分離和放大制備。由于中藥的成分非常復(fù)雜，SOURCE反相層析可用范圍為PH1-14 ，并可用1M NaOH，1M HCL清洗、再生。比傳統(tǒng)硅膠反相層析更易于工藝優(yōu)化及在位清洗，壽命也更長。
12.純化——肽類
肽類的來源有天然萃取，合成肽和重組肽三種。肽容易被酶降解，但可從有機(jī)溶劑或促溶劑中復(fù)性，所以多以高選擇性的反相層析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或離子交換Minibeads、Monobeads作純化。Superdex Peptide HR是專為肽分子純化設(shè)計的凝膠過濾預(yù)裝柱，能配合反相層析做出更精美的肽圖。肽分子制備可用離子交換配合凝膠過濾Superdex 30 PG。醫(yī)學(xué)都市多功能
13.純化——核酸、病毒
核酸的純化用于去除影響測序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分為質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA和PCR產(chǎn)物等。病毒也可視作核酸大分子，和質(zhì)粒DNA一樣，可用分離大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝膠過濾介質(zhì)去除雜蛋白，再配合離子交換如Mono Q、 SOURCE Q分離核酸。
14.純化——寡核苷酸寡酸苷酸
多應(yīng)用在反義（anti-sense）DNA、RNA測序、PCR和cDNA合成等研究。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以陰離子交換的Mono Q或快速低反壓的SOURCE Q在PH12下可除副產(chǎn)物，并避免凝集和保護(hù)基的脫落。載量大大高過反相層析，可用做大量制備。不含三苯甲基的失敗序列可用反相柱ProRPC去除。
15.脫鹽、小分子去除
使用凝膠過濾介質(zhì)Sephadex G10，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，處理量可達(dá)床體積30%.只需在進(jìn)樣后收集首1/3-1/2柱體積的洗脫液，HiPrep Desalting（26ml）可在數(shù)分鐘為多至10ml樣品脫鹽。
16.疫苗純化
使用凝膠過濾介質(zhì)Sepharose 4FF純化疫苗，去除培養(yǎng)基中的雜蛋白，處理量可大于床體積10%.柱高一般40-70cm，整個過程約半至一小時。使用此法生產(chǎn)的疫苗品種有乙肝、狂犬、出血熱、流感、肺結(jié)核、小兒麻痹疫苗等。分子量較小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR，如甲肝疫苗等。
17.抗生素聚合物分析
中國藥典從2000年版起要求抗生素頭孢曲松鈉需要找出聚合物占產(chǎn)品的白分比，規(guī)定使用Sephadex G10凝膠過濾法測定。
18.純化-基因治療用病毒載體
SORRCE 15Q
19.純化-基因治療用質(zhì)粒
Q Sepharose XL，SOURCE 15Q，STREAMLINE Q，Sephacryl S500，Plasmidselect 在下游純化中，可應(yīng)用不同層析技術(shù)在純化生物分子的同時，去除各種污染物。 1.去除——內(nèi)毒素
內(nèi)毒素又稱熱原。含脂肪A、糖類和蛋白，是帶負(fù)電的復(fù)合大分子。
內(nèi)毒素的脂肪A部份有很強(qiáng)的疏水性。但在高鹽下會凝集，無法上疏水層析。利用疏水層析試驗盒（17-1349-01）可選擇結(jié)合目標(biāo)蛋白的介質(zhì)而去除內(nèi)毒素。
內(nèi)毒素與陰離子交換介質(zhì)Q或DEAE Sepharose Fast Flow有較強(qiáng)結(jié)合?？稍谙疵撃繕?biāo)蛋白后用高鹽緩沖液或NaOH去除。
利用CNBr或NHS Sepharose FF可偶聯(lián)內(nèi)毒素底物如LAL，PMB，自動成親合層析介質(zhì)結(jié)合內(nèi)毒素。內(nèi)毒素經(jīng)常是多聚體，凝膠過濾層析可有效地將之去除。
2.去除——蛋白中的核酸
大量核酸增加樣本黏度，令區(qū)帶擴(kuò)張，反壓增加，降低分辨率和流速。藥審和食檢對核酸含量也有嚴(yán)格限制。
胞內(nèi)表達(dá)蛋白的核酸問題尤其嚴(yán)重。核酸帶陰電荷，在初步純化時利用陽離子交換介質(zhì)如STREAMLINESP，SP Sepharose Big Beads，SP或CM Sepharose FF，SP SepharoseXL結(jié)合目標(biāo)蛋白，可除去大量核酸。
核酸在高鹽下會和蛋白解離，疏水層析介質(zhì)很適合用來結(jié)合目標(biāo)蛋白，在純化蛋白的同時去除核酸。
利用核酸酶將核酸切成小片斷，用凝膠過濾做精細(xì)純化時便很容易去除了。
3.去除——病毒和微生物
病毒和微生物可成為病原，應(yīng)盡量減除。結(jié)合不同層析技術(shù)，使用注射用水，用NaOH定期進(jìn)行儀器和凝膠的在位消毒和在位清洗，皆可避免污染物增加。
病毒大都有脂外殼?？捎门c目標(biāo)蛋白電荷相反的S/D（solvent/detergent）處理，使病毒失活，如Triton和Tween.再用適當(dāng)?shù)碾x子交換介質(zhì)如CM Sepharose FF結(jié)合目標(biāo)蛋白，去除S/D.
其它污染物可以改變pH和離子強(qiáng)度使其從目標(biāo)分子中解離或失活，凝膠過濾介質(zhì)Superdex及多種吸附性介質(zhì)，SOURCE都是很好的精細(xì)純化介質(zhì)，可去除多種微量污染物。 凝膠是指顆粒大小在1埃到10埃之間的混合物。高分子溶液和某些溶膠，在適當(dāng)?shù)臈l件下，整個體系會轉(zhuǎn)變成一種彈性的半固體狀態(tài)的稠厚物質(zhì)，失去流動性。這種現(xiàn)象稱為膠凝作用,所形成的產(chǎn)物叫做凝膠或凍膠.
“氣凝膠”是指分散系為氣態(tài)的，如：云，霧等，“固凝膠”有煙水晶等，“液凝膠”就是呈液態(tài)的膠體，如氫氧化鐵膠體 。

基因診斷的基本原理

基因診斷又稱DNA診斷或分子診斷，通過分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)，直接檢測出分子結(jié)構(gòu)水平和表達(dá)水平是否異常，從而對疾病做出判斷。
　核酸分子雜交是基因診斷的最基本的方法之一。 基因診斷技術(shù)它的基本原理是：互補(bǔ)的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即能夠進(jìn)行雜交。這種結(jié)合是特異的，即嚴(yán)格按照堿基互補(bǔ)的原則進(jìn)行，它不僅能在DNA和DNA之間進(jìn)行，也能在DNA和RNA之間進(jìn)行。因此，當(dāng)用一段已知基因的核酸序列作出探針，與變性后的單鏈基因組DNA接觸時，如果兩者的堿基完全配對，它們即互補(bǔ)地結(jié)合成雙鏈，從而表明被測基因組DNA中含有已知的基因序列。由此可見，進(jìn)行基因檢測有兩個必要條件，一是必需的特異的DNA探針；二是必需的基因組DNA。當(dāng)兩者都變性呈單鏈狀態(tài)時，就能進(jìn)行分子雜交。 一、基因探針基因探針（probe）就是一段與目的基因或DNA互補(bǔ)的特異核苷酸序列，它可以包括整個基因，也可以僅僅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA。 1．探針的來源 DNA探針根據(jù)其來源有3種：一種來自基因組中有關(guān)的基因本身，稱為基因組探針（genomic probe）；另一種是從相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄獲得了mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄得到的探針，稱為cDNa 探針（cDNa probe）。與基因組探針不同的是，cDNA探針不含有內(nèi)含子序列。此外，還可在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因序列互補(bǔ)的DNA片段，稱為寡核苷酸探針。基因診斷
2．探針的制備 進(jìn)行分子突變需要大量的探針拷貝，后者一般是通過分子克?。╩olecular cloning）獲得的?？寺∈侵赣脽o性繁殖方法獲得同一個體、細(xì)胞或分子的大量復(fù)制品。當(dāng)制備基因組DNA探針進(jìn)，應(yīng)先制備基因組文庫，即把基因組DNA打斷，或用限制性酶作不完全水解，得到許多大小不等的隨機(jī)片段，將這些片段體外重組到運(yùn)載體（噬菌體、質(zhì)粒等）中去，再將后者轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如大腸肝菌，這時在固體培養(yǎng)基上可以得到許多攜帶有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通過原位雜交，從中可篩出含有目的基因片段的克隆，然后通過細(xì)胞擴(kuò)增，制備出大量的探針。 為了制備cDNA 探針，首先需分離純化相應(yīng)mRNA，這從含有大量mRNA的組織、細(xì)胞中比較容易做到，如從造血細(xì)胞中制備α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，就可以合成與之互補(bǔ)的DNA(即cDNA)，cDNA與待測基因的編碼區(qū)有完全相同的堿基順序，但內(nèi)含子已在加工過程中切除。 寡核苷酸探針是人工合成的，與已知基因DNA互補(bǔ)的，長度可從十幾到幾十個核苷酸的片段。如僅知蛋白質(zhì)的氨基酸順序量，也可以按氨基酸的密碼推導(dǎo)出核苷酸序列，并用化學(xué)方法合成。 3.探針的標(biāo)記 為了確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交，有必要對探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識別的信號,通常采用放射性同位素32P標(biāo)記探針的某種核苷酸α磷酸基。但近年來已發(fā)展了一些用非同位素如生物素、地高辛配體等作為標(biāo)記物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是保存時間較長,而且避免了同位素的污染。最常用的探針標(biāo)記法是缺口平移法(nicktranslation)。 探針的標(biāo)記也可以采用隨機(jī)引物法，即向變性的探針溶液加入6個核苷酸的隨機(jī)DNA小片段，作為引物，當(dāng)后者與單鏈DNA互補(bǔ)結(jié)合后，按堿基互補(bǔ)原則不斷在其3’OH端添加同位素標(biāo)記的單核苷酸，這樣也可以獲得比放射性很高的DNA探針。 二、限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease），又簡稱限制酶或內(nèi)切酶。它們是基因工程和基因診斷重要的一類工具酶。它們的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用為從基因組中分離目的基因提供了必要的手段.限制酶能特異地識別和切割特異的核苷酸序列，將雙鏈DNA切成較小的片段。酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一DNA片段上，并被分離出來。 限制酶主要來源于原核生物，是一組能水解DNA磷酸二酯鍵的酶。迄今已發(fā)現(xiàn)的限制酶多達(dá)數(shù)百種，分為三類。在基因工程中使用的主要是第二類。限制酶根據(jù)其來源命名。 每種限制酶識別和切割的通常為4-6個核苷酸序列，稱為限制性位點(diǎn)(restriction sites)或切點(diǎn)。限制酶切割雙鏈DNA的方式有兩種，產(chǎn)生的末端也有兩種：第一種是交錯切割，即兩條鏈的切點(diǎn)不在同一水平而是相隔數(shù)個堿基，故斷口產(chǎn)生兩小段自身互補(bǔ)的單鏈，這種末端容易互補(bǔ)連接，稱為粘性末端（cohesive terminus）；第二種為平整切割。 限制酶的上述特性在基因工程和基因診斷中具有重要用途：①首先不論DNA的來源如何，用同一種內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的粘性末端很容易重新連接，因此很容易將人和細(xì)菌或人和質(zhì)粒任何兩個DNA片段連接在一起，即重新組合，這是重組DNA技術(shù)的基礎(chǔ)。②人類的基因組很大，不切割無法分析其中的基因。限制酶能把基因組在特異的部位切開，即切割不是隨機(jī)的，因而從每個細(xì)胞的基因組得到的是相同的一組長度各異的片段。這些可能含有某一基因的片段可用電泳分離，并加以研究。③由于限制酶的特異性，如果識別位點(diǎn)的堿基發(fā)生了改變，限制酶將不再能切割；同樣，堿基的改變也可能導(dǎo)致出現(xiàn)新的酸切位點(diǎn)。在人類基因組中，這兩種情況是十分常見的，而切點(diǎn)的消失或出現(xiàn)將影響獲得的DNA片段的長度，表現(xiàn)為限制性片段長度多態(tài)性（RFLP），這在基因的連鎖診斷中具有極重要的意義。 三、限制性片段長度多態(tài)性一個人的兩套單倍體DNA是不完全相同的，一般每100－500個堿基對就有一個是不相同的。換言之，如果把兩套基因組DNA（各3.2×109bp）排列起來，那么平均有1000萬處不同，它們多位于內(nèi)含子序列中。實際上，除單卵雙生子外，人群中沒有兩個個體的基因組DNA是完全相同的。 DNA的多態(tài)性雖可通過DNA測序檢出，但用限制酶消化卻是最常用的檢測方法。 1．RFLP由于堿基的變異可能導(dǎo)致酶切點(diǎn)的消失或新的切點(diǎn)出現(xiàn)，從而引起不同個體在用同一限制酶切時，DNA片段長度出現(xiàn)差異，這種由于內(nèi)切酶切點(diǎn)變化所導(dǎo)致的DNA片段長度的差異，稱為限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragmentlength polymporphism, RFLP）。RFLP反映了常見的個體間DNA核苷酸的可遺傳性變異，它按照孟德爾方式遺傳。RFLP可用Southern印跡雜交法檢出。用Southern雜交檢出RFLP時，如探針跨越切點(diǎn)，則被切開的兩個片段均可與探針雜交，從而顯示兩條雜交帶。 2．兩點(diǎn)RFLP （1）點(diǎn)多態(tài)（point polymorphism）：是由于單個或少數(shù)堿基的改變引起酶切點(diǎn)的出現(xiàn)或消失所致的RFLP。上述的RFLP即屬于這一類。它們屬經(jīng)典的RFLP。在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)數(shù)以百計的此類多態(tài)位點(diǎn)。 （2）數(shù)目變異的串連重復(fù)（variable number tandem repeats,VNTR）：上述經(jīng)典的單個堿基取代所致的RFLP一般只能檢測到一種雜合性的兩種形式，即“有”或“無”某個限制酶切位點(diǎn)，而且每個位點(diǎn)在人群中的雜合子頻率通常不會超過50%，當(dāng)被測個體為純合狀態(tài)時，利用RFLP就無法得到所需要的多態(tài)信息。此外，在整個基因組中，這類RFLP目前發(fā)現(xiàn)的數(shù)量還有限，并分布不勻。 但是，在人類基因組中還存在一類DNA重復(fù)序列，稱為小衛(wèi)星DNA。它們分布十分廣泛，每一個單位通常只有16-28bp長，但其重復(fù)次數(shù)在人群中是高度變異的。當(dāng)用限制酶切割VNTR區(qū)時，只要酶切點(diǎn)不在重復(fù)區(qū)內(nèi)，就可能得到各種長度不同的片段與小衛(wèi)星DNA不同，另一類重復(fù)序列是衛(wèi)星DNA。它們的基本序列有1－6bp，如（TA）n、(CGG)n等，通常重復(fù)10－60次并呈高度的多態(tài)性。 VNTR具有高度的變異性，同時也是按照孟德爾方式遺傳的，因此是很好的遺傳標(biāo)記，由于它們類型眾多和在基因組中分布廣泛，因而在基因連鎖診斷中應(yīng)用日益廣泛。

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