巨噬細胞泡沫化抑制劑研究快步進行

巨噬細胞泡沫化抑制劑研究快步進行

動脈粥樣硬化（AS）是一個復雜的病理生理過程，由動脈管壁上膽固醇累積的斑塊形成引起。膽固醇酯蓄積的巨噬細胞（泡沫細胞）是早期動脈粥樣硬化斑塊的主要組成和特征。它通過其細胞表面的多種受體無限制地攝取變性（氧化的或乙?；┑牡兔芏戎鞍?LDL)顆粒及其他配體，結(jié)果在巨噬細胞內(nèi)有大量的膽固醇酯和甘油三酯蓄積，使巨噬細胞發(fā)展成為泡沫細胞。因此，通過各種途徑抑制這種在巨噬細胞的過量脂質(zhì)蓄積，可以起到預防和治療動脈粥樣硬化的作用。而通過各種途徑抑制泡沫細胞形成的各個環(huán)節(jié)以預防AS，受到研究人員廣泛的關注。目前，巨噬細胞泡沫化抑制劑的研究也在快速進行之中，以期能在防治AS上產(chǎn)生突破性的進展。

抗氧化劑 已有許多證據(jù)說明，LDL被氧化后轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸偷兔芏戎鞍祝╫x-LDL），這種ox-LDL與AS有關。當LDL在血液中蓄積時，被不明因素氧化，巨噬細胞對這種ox-LDL有極強的親和力且能無休止地攝取，導致巨噬細胞泡沫化。

20世紀70年代初普羅布考（probucol）作為降膽固醇藥引入臨床，后來卻意外發(fā)現(xiàn)它能阻止AS的發(fā)生和發(fā)展。究其原因，主要是它的抗氧化作用——可以防止ox-LDL的形成。其他一些天然的抗氧化劑包括β-胡蘿卜素、番茄紅素、維生素E、紅酒中的類黃酮、甘草等等，也在進一步研究中。最近，國外研究發(fā)現(xiàn)了一種具有抗AS作用的磷脂相關酶——血小板活化因子-乙酰水解酶(PAF-AH)。PAF-AH由巨噬細胞產(chǎn)生，并和脂蛋白結(jié)合存在于血漿中。研究表明：發(fā)生AS時，血漿PAF-AH的活性改變。除了分解血小板活化因子(PAF)，血漿PAF-AH蛋白還能夠結(jié)合到所有的脂蛋白，防止發(fā)生氧化作用。一方面，PAF-AH阻止高密度脂蛋白（HDL）的氧化，從而加強了HDL防止LDL脂質(zhì)過氧化的抗AS作用；另一方面，PAF-AH也阻止了LDL發(fā)生氧化。

ACAT抑制劑 脂酰輔酶A膽固醇酯酰轉(zhuǎn)移酶(ACAT)催化膽固醇的3位羥基，由長鏈酯酰輔酶A將酯?；D(zhuǎn)入后，生成膽固醇酯的酶，它在膽固醇的代謝中起重要作用。由于ACAT抑制劑與巨噬細胞泡沫化過程直接相關，間接和直接對抗AS，因而具有強大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

研究表明：抑制體內(nèi)的ACAT，可減少食物中的膽固醇及隨膽汁排泄的膽固醇在小腸的吸收，減少肝中膽固醇酯的生成及極低密度脂蛋白的分泌，有效降低血漿膽固醇及LDL水平，并且直接抑制斑塊中巨噬細胞泡沫化過程。同時，ACAT抑制劑并不降低血漿膽固醇水平。目前從結(jié)構(gòu)上看，ACAT抑制劑主要包含兩類化合物：一類是酰胺類，如日本住友株式會社研究開發(fā)的新藥Molinamide和山道士公司研究開發(fā)的50-035；另一類是脲類，如美國氰胺公司研究開發(fā)的CL-277032和CL-283546。此外，還有苯基咪唑類等其他類型。

激素敏感脂肪酶（HSL） 在泡沫細胞中，ACAT和中性膽固醇酯水解酶共同調(diào)節(jié)膽固醇酯的形成，除了抑制ACAT的活性外，還可通過阻止膽固醇酯的合成或刺激膽固醇酯的水解來減少泡沫細胞中膽固醇酯的積累。實驗證明，用孕酮抑制A-CAT的活性，可以促進小鼠腹膜泡沫細胞中膽固醇酯的水解。而且，自由膽固醇的胞外受體如HDL可通過刺激自由膽固醇的轉(zhuǎn)運而促進膽固醇酯的水解。

國外有研究人員將小鼠巨噬細胞鏈中膽固醇酯的水解活性歸結(jié)于HSL的作用。而另有研究證明，泡沫細胞中HSL mRNA的低水平表達和細胞質(zhì)中性膽固醇酯水解酶（NCEH）的活力降低同時存在，因而推測低水平表達的HSL可能部分導致了NC-EH的活力減低，說明HSL在膽固醇代謝中的作用。過量表達的HSL可以在很大程度上阻止泡沫細胞內(nèi)膽固醇酯的聚集。而在ACAT抑制劑同時存在時，相比于對照組，HSL的過量表達可以將泡沫細胞中膽固醇酯的水解速度提高2~3倍，導致細胞內(nèi)膽固醇酯的快速耗盡。因此，巨噬細胞中HSL的過量表達或者有ACAT抑制劑的同時存在，可以阻止AS斑塊泡沫細胞內(nèi)膽固醇酯的積聚。

LXR/RXR活化劑 肝X受體/視黃醇類X受體（LXR/RXR）是核受體，其轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控膽固醇轉(zhuǎn)運途徑中多種基因的轉(zhuǎn)錄，ATP結(jié)合的轉(zhuǎn)運盒A1(ABCA1)基因就是LXR/RXR調(diào)控基因之一。ABCA1是一種較大的膜蛋白，可促進磷脂和膽固醇轉(zhuǎn)運到HDL，形成前β-HDL微粒。

由于核受體LXR/RXR調(diào)控多種細胞內(nèi)膽固醇及脂肪酸的代謝，激活這些受體可促進巨噬細胞內(nèi)膽固醇的外流、肝臟中膽汁酸的合成和阻止小腸中膽固醇的吸收。國外研究發(fā)現(xiàn)，用RXR激活劑LG100364處理載脂蛋白E和低密度脂蛋白受體缺失的小鼠時，ABCA1mRNA表達增加，促進了膽固醇流入載脂蛋白A-I。而且，用LXR活化劑來處理載脂蛋白E敲除的小鼠時，在AS斑塊內(nèi)，ABCA1和ATP結(jié)合的轉(zhuǎn)運盒G1(ABCG1)mRNA的表達均增加。因此認為，LXR/RXR可調(diào)控全身的膽固醇清除過程，激活LXR信號途徑能上調(diào)巨噬細胞內(nèi)AB鄄CA1基因的表達，通過HDL將膽固醇轉(zhuǎn)運進入肝臟，并減少膽固醇的吸收，從而抑制巨噬細胞泡沫化過程。

PPARγ抑制劑 泡沫細胞中，脂肪細胞脂質(zhì)結(jié)合蛋白（ALBP）基因和環(huán)氧酶增生激活受體γ（PPARγ）均呈高表達，通過巨噬細胞清道夫受體介導的無限制攝取ox-LDL可刺激PPARγ基因表達。ALBP基因是核受體PPARγ的調(diào)控基因之一，ALBP的過量表達會加速膽固醇酯的累積，從而促進泡沫細胞的形成，因此，PPA-Rγ抑制劑的研究也是一個有效預防泡沫細胞產(chǎn)生的方法。

相關基因的研究 載脂蛋白E具有多種生理功能，對血漿脂蛋白的清除具有重要作用。在泡沫細胞形成早期，動脈血管壁上巨噬細胞載脂蛋白E的分泌還可以抑制巨噬細胞泡沫化的發(fā)展，因此，通過載脂蛋白E轉(zhuǎn)基因在動脈血管巨噬細胞上的表達是一條有效的抑制途徑。

此外，巨噬細胞清道夫受體也是泡沫化過程的一個重要靶點。MSRAI/AII是導致泡沫細胞形成的主要受體之一。最近，國外研究人員構(gòu)建了一個分泌型三聚體融合蛋白，包含人MSRAI細胞外部分。此分泌型三聚體融合蛋白是跨膜受體，并且和MSR具有相同的胞外部分，可以競爭性地結(jié)合ox-LDL顆粒及其他配體，從而阻止這些配體結(jié)合到人MSR上。

另一類巨噬細胞清道夫受體MSR-B包括MSR-BI和CD36，在泡沫化的形成過程中也有重要的作用。MSR-BI是一種選擇性攝取受體，能選擇性地攝取HDL膽固醇酯。此外，MSR-B可阻礙游離膽固醇和膽固醇酯在動脈壁的聚集，因而有抗泡沫化形成作用。CD36是另一個MSR-B亞型，研究表明，CD36缺乏的小鼠，動脈斑塊的面積減少了70%～80%，其巨噬細胞攝取的氧化LDL減少了50%，不易形成泡沫細胞，因此認為，CD36參與了泡沫細胞的形成過程。雖然尚未有關于這兩種清道夫受體的應用的報道，MSR-BI和CD36無疑具有潛在的發(fā)展前景。

2021-02-21--文獻閱讀--人食管鱗癌微環(huán)境中的免疫抑制景觀

單細胞測序分析CD45+的細胞（免疫細胞）→利用經(jīng)典標記對免疫細胞注釋，研究免疫細胞的成分差異→闡明免疫細胞改變的分子機制→研究免疫細胞TCR序列的變化，克隆性，說明起源問題→研究髓系細胞，TAMs（腫瘤相關巨噬細胞），WCGNA研究細胞分子特征→細胞間相互作用（scTHI）

我們獲得了一個詳細的單細胞分辨率的食管鱗狀細胞癌（ESCC）免疫細胞圖譜。闡述了哪些免疫細胞處于休眠狀態(tài)，哪些免疫細胞處于增值狀態(tài)，以及這些細胞與免疫抑制之間的關系。

①食管癌在組織學上可分為兩個亞型：腺癌（EAC）和鱗狀細胞癌（ESCC）。食管鱗癌是食管癌的主要亞型，約占全世界食管癌的90%
②最近，PD-1抗體用于晚期食管癌一線化療失敗的患者顯示，與化療相比，總體生存率只有中度的改善。
③我們用高維（high-dimensional）scRNA序列分析了從七個切除的食管鱗癌腫瘤及其鄰近組織中分離的總免疫細胞。同時進行T細胞受體（TCR）測序，以獲得T細胞克隆性的信息
④相較于癌旁正常組織，腫瘤組織T細胞明顯擴增。
⑤我們在這些腫瘤中發(fā)現(xiàn)了耗盡的T細胞、耗盡的NK細胞、調(diào)節(jié)性T（Treg）細胞、交替激活的巨噬細胞（M2）和耐受性樹突狀細胞（tDCs），表明ESCC中 存在炎癥但免疫抑制的TME 。
⑥我們鑒定出了一個與預后相關的基因集

①我們分析了從7對新鮮、手術(shù)切除的腫瘤和ESCC鄰近組織中分離出CD45+細胞進行單細胞測序。過濾后，共80787個細胞（每個樣品3248-9078），中位基因數(shù)1170個。
②我們將所有樣本的單細胞數(shù)據(jù)進行標準化和匯總，并進行無監(jiān)督聚類以識別可區(qū)分的群體，用的是Seuratv3.0
③我們利用典型標記對這些細胞進行了注釋；這些細胞類型的經(jīng)典標記物的表達與注釋一致

④我們發(fā)現(xiàn)腫瘤中的t細胞和單核/巨噬細胞增多。與此相反，B細胞和NK細胞的百分率降低

（S133、S134和S150）--在這些腫瘤中，T細胞所占的比例不到總細胞的2%。
（S135、S149、S158、S159）--這些腫瘤中，免疫譜在PCA中呈現(xiàn)顯著變化，其中6–12%的細胞是T細胞。

①T細胞和NK細胞是TME中主要的細胞毒性免疫細胞，我們對來自所有樣本的T細胞和NK細胞進行無監(jiān)督聚類，我們鑒定了6個CD4 T細胞簇，7個CD8 T細胞簇，1個CD4和CD8雙陰性T細胞簇和3個NK細胞簇

②在T細胞中，我們使用已知的功能性標記來提示CD4 T細胞群，包括天真、記憶、效應、耗盡的T細胞和Tregs。這些標記物還鑒定了CD8T細胞群，包括記憶、效應、細胞毒性和耗盡的T細胞。

④我們進一步分析了與GFBP2、LAG3和FOXP37表達高度相關的基因。前50個基因用于細胞毒性、衰竭和Treg的分配。然后我們使用這些特征分析T細胞簇，發(fā)現(xiàn)富集分數(shù)與公布的特征一致。
⑤CD4群體中存在著譜系聯(lián)系，exhaustion和Treg評分的可視化證實了這兩個簇之間的重疊
⑥細胞毒性和耗盡的CD8 T細胞都表達許多效應分子，如GnY和GZMH，而耗盡的DCD8 T細胞表達的IFNG水平高于細胞毒性細胞（圖2f），這表明耗盡的T細胞仍表達高水平的某些效應分子并試圖對腫瘤細胞作出反應；
這些結(jié)果提示CD8-C5-CCL5處于衰竭早期，CD8-C7-TIGIT處于衰竭期，CD8-C6-STMN1可能是CD8-C5-CCL5與CD8-C7-TIGIT的過渡期。

①我們比較了腫瘤和鄰近組織中的T細胞簇。CD45+細胞中的 （Treg cluster CD4-C6-FOXP3） and （exhausted CD4 T cells CD4-C5-STMN1 ）的百分比與匹配的鄰近組織相比顯著增加；
流式細胞術(shù)也證實了在ESCC腫瘤中Tregs的富集。
同樣，耗盡的cd8t細胞在腫瘤中富集。

②在ESCC中，PD1在CD8 T細胞中的表達一直較高（圖3f）。腫瘤組織中Tregs和耗盡的DCD4和CD8 T細胞顯著增加表明存在免疫抑制環(huán)境
③我們還觀察到，與匹配的鄰近組織相比，腫瘤組織中的NK細胞顯著減少；
NK-C1-NCR3表達高水平的NCR3、CD266、NKG7和LAMP1（圖3h）。
相反，NK-C3-KLRC1和NK-C2-STMN1簇高水平表達KLRC1和ITGA1抑制性受體（圖3h）。
流式細胞術(shù)分析證實，與鄰近組織相比，ESCC中NKG2A（KLRC1）在NK細胞中的表達增加（圖3i）。事實上，NK-C3-KLRC1和NK-C2-STMN1的細胞毒性分數(shù)極低；相反，衰竭分數(shù)升高（圖3j），這表明在ESCC中NK細胞不足，功能受損

①根據(jù)TCR結(jié)果我們共觀察到15654個獨特的tcr序列。觀察到克隆擴展，克隆大小從2到2600（圖4a）。
如預期的那樣，患者之間沒有發(fā)現(xiàn)共享克隆。與其他癌癥類型的研究一致，大多數(shù)TCR是獨特的。然而，TCR基因型的組成在患者中是高度可變的

②S149和S150腫瘤中有65%和68%的T細胞具有兩個以上細胞共用的TCR，這表明這些腫瘤中T細胞的高度克隆性擴增（圖4b）。與匹配的鄰近組織相比，7名患者的腫瘤中有4人的擴增克隆數(shù)增加。

④CD8 T細胞的克隆性細胞明顯多于CD4 T細胞，并且幼稚的CD4-C1-CCR7簇顯示出非常有限的克隆性擴增（圖4d）。
⑤CD8-C1-NKG7是CD8 T細胞中的細胞毒性簇，在鄰近組織中具有較高的頻率，在鄰近組織中也顯示出比腫瘤組織中更高的克隆擴增（圖4e）。

⑥然而，與鄰近組織相比，腫瘤中的Tregs克隆數(shù)增加（圖4f），這表明特異性克隆細胞的擴張可能是腫瘤中Tregs高百分比的原因。
⑦我們在CD4細胞的所有簇（包括Tregs）和CD8細胞的所有簇（C2除外）中發(fā)現(xiàn)了TCR序列的共享（圖4g，h）
⑧CD8-C7-TIGIT與CD8-C5-CCL5和CD8-C6-STMN1共有的克隆數(shù)分別為166（9.0%）和156（8.4%）（圖4i）。
⑨Treg簇CD4-C6-FOXP3在腫瘤中也有相同的趨勢，與CD4-C1-CCR7共有的克隆型占14.4%，在鄰近組織中占40.7%（圖4j和補充圖8c）

①接下來，我們對髓系細胞進行無監(jiān)督聚類。十四個簇被鑒定，包括9簇單細胞/巨噬細胞和5簇樹突狀細胞（圖5a）。
②利用已發(fā)表的信號特征：單核細胞（Mono）、經(jīng)典活化巨噬細胞（M1）、交替活化巨噬細胞（M2）和髓源性抑制細胞（MDSCs）；
③我們使用Monocle，一種無監(jiān)督的推斷方法，來構(gòu)建細胞轉(zhuǎn)化的潛在發(fā)展軌跡。另一種算法Slingshot的結(jié)果（s9b）；
巨噬細胞中M1和M2信號之間的顯著相關性（補充圖。9c），表明ESCC中存在一個復雜的巨噬細胞極化過程，這與其他研究一致
Mono-C1-VCAN顯示出強大的單核細胞信號（圖5b）。

④我們用wgcna對單核/巨噬細胞進行加權(quán)相關網(wǎng)絡分析
我們發(fā)現(xiàn)綠松石模塊與單核細胞簇、單核細胞C1-VCAN和單核細胞C2-IL1B正相關，與M2簇宏C3-CSF1和MDSC簇MDSC-C1-C1QC、MDSC-C2-APOE負相關（圖5d，e）;我們進一步分析了這個模塊中的基因以及它們與Mono-C1-VCAN的關聯(lián)（圖5f），以選擇最相關的前50個基因，形成一個特征集；
有趣的是，這一特征與ESCC（圖5g）以及宮頸鱗狀細胞癌和肺鱗狀細胞癌（補充圖9g）的高無進展生存率密切相關，這表明這一特征可作為ESCC和其他組織鱗狀細胞癌的預后生物標志物。

①五個DC簇表達熱圖（圖6a）;DC-C3-LAMP3癌旁組織中富集（圖6b）。

②發(fā)現(xiàn)LAMP3+DC與其他樹突狀細胞亞群相比具有更高的活性和遷移能力，同時其還富集到了耐受性特征（圖6c）

④流式顯示：LAMP3+DC表達的CD83、CCR7和PDL1明顯高于LAMP3 DC（圖6e，f）、提示LAMP3+DCs的成熟、遷移和調(diào)控能力。
⑤多色ihc染色也證實了腫瘤組織中CD11C+LAMP3+PDL1+IDO+DCs的存在（圖6g）。
⑥我們進一步用IFNγ和LPS治療dc。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)IFNγ和lps刺激誘導dc表達PDL1和IDO（圖6h）；
當DCs與CD4+CD45RA+幼稚T細胞共培養(yǎng)時，誘導FOXP3表達的能力增強（圖6i）。
提示IFNγ和LPS可能在體外誘導耐受性DCs

①我們基于已知配體-受體對在任何兩種腫瘤浸潤性免疫細胞中的共同表達，對潛在的細胞-細胞相互作用進行了系統(tǒng)分析
scTHI--另一種廣泛使用的方法--分析巨噬細胞和Tregs的相互作用
②我們發(fā)現(xiàn)巨噬細胞和Tregs之間TNF-TNFSF1B、CCL4-CCR8和IL-1β-IL1R2的相互作用具有較高的相互作用得分，并且Tregs在腫瘤中表達高水平的TNFSF1B、CCR8和IL1R2（圖7a–c）

③腫瘤中分離的樹突狀細胞中IL1R2的表達高于癌旁組織，多色IHC也證實了IL1R2在Tregs中的表達。（圖7d）

通過scrna-seq分析巨噬細胞中LILRB1的表達，并通過FACS進一步驗證。我們發(fā)現(xiàn)，與鄰近組織相比，ESCC中巨噬細胞中LILRB1的表達增加（圖7h，i和補充圖7）。

①在這里，我們結(jié)合了深鏈RNA序列和TCR序列，并闡明了整個免疫景觀，包括ESCC和鄰近組織中固有的和適應性的免疫細胞圖譜；描述了ESCC免疫細胞的分類、比例、功能變化及機制、細胞間相互作用
②ESCC富含免疫抑制細胞：Tregs, exhausted CD8 T,CD4 T and NK cells, M2 macrophages, and tDCs；促進免疫逃避和腫瘤進展
③我們證明耗盡的CD4、CD8 T細胞和NK細胞是主要的腫瘤內(nèi)增殖免疫細胞室，盡管這些細胞富含耗盡基因。
與耗盡簇（CD8-C7-TIGIT）相比，預耗盡簇CD8-C5-CCL5和CD8-C6-STMN1可能是更好的免疫治療靶點，因為耗盡簇處于永久性和不易逆轉(zhuǎn)的耗盡階段，由于其表觀遺傳變化，使其更耐檢查點抑制。
④發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤的NK細胞不僅在ESCC中普遍減少，而且還表達高水平的檢查點分子，包括NKG2A和CD49d，提示處于耗盡狀態(tài)；據(jù)報道，抗NKG2A和抗CD49d是促進抗腫瘤活性的檢查點抑制劑
⑤T細胞的TCR序列共享，提示T細胞啟動后有著廣泛的分化。
⑥衰竭的CD8 T細胞（CD8-C7-TIGIT）與其他CD8簇具有更高比例的共享克隆，尤其是衰竭前簇CD8-C5-CCL5和CD8-C6-STMN1，這與這些簇的相關狀態(tài)和多步衰竭假說相一致。
相反，CD8-C1-NKG7是細胞毒性最強的CD8 T細胞簇，在腫瘤中克隆性T細胞明顯減少
最近在膀胱癌中也有類似的發(fā)現(xiàn)，細胞毒性cd8t細胞（FGFBP2+clusterin）在正常組織中的克隆性比在膀胱癌中的克隆性強。
另一方面，食管細胞毒性細胞的克隆擴增可能是由于食管中的非腫瘤抗原的偶然暴露，并且相鄰組織中的大多數(shù)CD8-C1-NKG7細胞表達低水平的CD39，這表明它們是旁觀者CD8 T細胞。
幼稚的CD8 T細胞可能不常滲入食管或被局部環(huán)境激活，因此不太可能被檢測為獨立的群體。
⑦單核細胞/巨噬細胞在腫瘤中的關鍵作用已經(jīng)在肝癌、乳腺癌和肺癌中用scRNA-seq進行了描述；
通常，巨噬細胞的活化分為炎癥前M1狀態(tài)或與炎癥溶解相關的M2狀態(tài)；
我們的分析顯示單核細胞/巨噬細胞存在于單核細胞、M1和M2狀態(tài)的光譜中；M1相關基因和M2相關基因經(jīng)常在同一細胞中共同表達；M1和M2信號的共存表明TAMs比經(jīng)典的M1/M2模型更復雜，這種現(xiàn)象在乳腺癌和肝癌中也有發(fā)現(xiàn)
當使用WGCNA分析單核/巨噬細胞的基因相關性時，我們發(fā)現(xiàn)一組基因與單核細胞呈正相關，在ESCC和其它類似的病理類型腫瘤有著較好的預測預后能力
⑧cDC2特別參與MHCⅡ類介導的抗原提呈和cd4t的活化和擴增細胞.cDC1也是抗腫瘤免疫所必需的。最近，一些文獻報道了TME中的DCs，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)與我們的數(shù)據(jù)一致。
比較了不同癌腫之間的這種差異，對分析出來的細胞做了些功能分析。
⑨我們的工作進一步證實了樹突狀細胞與巨噬細胞之間的相互作用；
在Treg上表達的IL1R2可能通過阻斷IL1β依賴性效應T細胞的活化而增強Treg的功能;
IL1R2在活化的腫瘤樹突狀細胞上表達，并與肺腺癌的預后不良相關。
我們的研究還表明，Tregs可能通過hhla-A、B、C和LILRB1相互作用調(diào)節(jié)巨噬細胞的功能。
研究TAMs中這種免疫抑制MHC類I-LILRB1信號軸的機制將有助于開發(fā)恢復巨噬細胞功能的療法。
總之，我們的ESCC和鄰近組織免疫細胞的轉(zhuǎn)錄圖譜提供了一個了解免疫狀態(tài)的框架，并揭示了ESCC環(huán)境中免疫細胞的動態(tài)特性。此外，我們還從多個方面闡述了食管鱗癌的免疫抑制狀態(tài)，這些都是食管鱗癌及其他癌癥免疫治療的潛在新靶點

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非因推薦 | 腫瘤微環(huán)境研究大剖析——腫瘤相關巨噬細胞

腫瘤微環(huán)境研究大剖析——腫瘤相關巨噬細胞

腫瘤免疫微環(huán)境是腫瘤與宿主免疫系統(tǒng)之間競爭博弈的主戰(zhàn)場，腫瘤微環(huán)境（TME）中各種細胞之間的相互作用造成免疫細胞具有依賴于TME的雙重作用，并決定腫瘤相關免疫反應的結(jié)果——即免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的攻擊或耐受。

腫瘤內(nèi)的免疫細胞包括介導適應性免疫反應的細胞（如T細胞、B細胞等），以及介導天然免疫反應的效應細胞（如巨噬細胞、中性粒細胞等），而腫瘤相關巨噬細胞(TAM) 是腫瘤微環(huán)境研究中最為熱門的免疫細胞亞群。越來越多的研究表明TAM具有支持腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等一系列促進腫瘤發(fā)展的功能，與腫瘤患者的不良預后呈高度相關性。由不同巨噬細胞表型定義的亞型（M1促炎型和M2型抗炎型），與腫瘤預后的關聯(lián)也有著廣泛的研究，在結(jié)直腸癌、胃癌、肺癌、卵巢癌食管癌、乳腺癌、胰腺癌等癌種中，均有大量研究報道，并證實兩個亞型在預后關聯(lián)上的負相關性。然而如何精準的找出不同組間TAM的表達譜差異、詮釋機理并結(jié)合現(xiàn)有的免疫療法，實現(xiàn)冷熱腫瘤的轉(zhuǎn)換將成為抗腫瘤治療的研究新方向。

巨噬細胞廣泛分布于各種組織中。通過對不同組間巨噬細胞表達譜的對比，存在于特定組織中的巨噬細胞按其組織位置可分為肝臟中的Kupffer細胞、腦中的小膠質(zhì)細胞、骨組織中的破骨細胞、肺中的肺泡巨噬細胞、腎臟中的系膜細胞和淋巴中的被膜下巨噬細胞等。不同組織中的巨噬細胞具有不同的轉(zhuǎn)錄和表達譜。

根據(jù)表型和功能，巨噬細胞可以分為M1(促炎，經(jīng)典激活的巨噬細胞)和M2(抗炎，交替激活的巨噬細胞)兩種主要類型(圖1)，此外還發(fā)現(xiàn)其他三種巨噬細胞：腫瘤相關的巨噬細胞(TAM)、CD169+巨噬細胞和TCR+巨噬細胞。

截止到目前的認識，TAM具有從M1到M2樣表型的特殊過渡期，這意味著它們在整個腫瘤進展過程中不僅僅屬于M1或M2樣表型。在腫瘤起始的早期階段，TAM在轉(zhuǎn)移到M2樣型之前為M1樣表型。此外，必須指出，類似巨噬細胞的M2還被進一步劃分為4個子類型，即M2a、b、c和d，不同子類型的標記也不同。

M1和M2型巨噬細胞標志物分類匯總

表面分子： M2型巨噬細胞表達高水平的CD206、CD163和TGFβR，而M1型巨噬細胞表達高水平的CD40、CD80和CD86。

轉(zhuǎn)錄因子： STAT1和STAT3在M1表型中高度激活，STAT6在M2表型中高度激活。IRF3、5和7在M1表型中被激活，而IRF4在M2表型中被激活。

細胞因子和趨化因子： 在M1型巨噬細胞檢測到TNFα、IL1β和IL12等因子的高表達，在M2型巨噬細胞檢測到IL10、ALOX15和CCL18等因子的高表達。在M1型巨噬細胞當中iNOS高表達，在M2型巨噬細胞當中Arginase 1高表達。

此外，初級TAM可以通過分泌CCL2、CCL5、CCL7、CXCL8和CXCL12等趨化因子招募單核細胞，在IL4、IL6、IL10、IL13以及TGFβ刺激作用下發(fā)生極化，具有類似于M2型巨噬細胞的表型，并分泌多種細胞因子（如TGFβ、IL-10等）和趨化因子(招募Th2和調(diào)節(jié)性T細胞)，介導免疫抑制效應；分泌多種細胞因子、生長因子(如EGF、VEGF、PDGF、FGF和TGFβ）、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、M-CSF等分子，促進慢性炎癥、血管新生、腫瘤侵襲和調(diào)節(jié)免疫反應(圖2)。在這個過程中，TAM通過分泌多種因子與腫瘤微環(huán)境多種類型細胞發(fā)生相互作用和影響，并進而介導復雜的效應(圖3)。

用什么方法對腫瘤微環(huán)境當中的TAM進行分析和評估呢？

我們通過一篇發(fā)表在Cancer Microenviron的研究論文，來介紹一些基礎技術(shù)。文章中分三步對非小細胞肺癌(NSCLC)患者和非腫瘤患者組織中的TAM進行分析，具體如下：

首先，此研究使用免疫組織化學(IHC)來確定與同一患者的非腫瘤組織相比，非小細胞肺癌(NSCLC)患者腫瘤組織當中TAM表型可能發(fā)生的表型變化。分別使用CD68（通用巨噬細胞標記）、iNOS（M1）和CD163（M2）抗體測定TAM表型。

然后，作者對不同類型NSCLC患者腫瘤組織及非腫瘤組織當中CD68、iNOS及CD163陽性染色面積占比進行了統(tǒng)計學分析。結(jié)果表明，與非腫瘤組織相比，在所有NSCLC亞型腫瘤組織當中CD68和M2型巨噬細胞標記CD163均明顯增加(P≤0.0001)。與之相對，與非腫瘤組織相比，在肺腺癌患者和鱗狀癌患者組織當中M1型巨噬細胞標記iNOS的表達降低，顯著性分別為P≤0.01及P≤0.05，但大細胞癌患者組織當中M1型巨噬細胞標記iNOS的表達與非腫瘤組織相比無明顯差異。

接下來，作者利用多因子液相芯片技術(shù)(Bio-plex)對不同類型NSCLC患者及正常對照血清當中介導Th1型和Th2型免疫反應相關多種細胞因子進行了檢測和分析。結(jié)果表明，與正常對照相比，只有大細胞肺癌患者血清當中IL-1β、IL-4、IL-6和IL-8的水平增加，在其他類型的NSCLC患者當中并未發(fā)現(xiàn)明顯變化。

非因小結(jié)

腫瘤相關巨噬細胞(TAM)對腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及耐藥起著重要調(diào)控作用，使得TAM成為抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療的重要靶點。TAM功能的可塑性，使它能夠通過響應于腫瘤微環(huán)境的信號分子(如細胞因子、藥物)而改變自身的功能狀態(tài)，因此針對TAM的深入研究具有重要的科學意義和臨床價值，為腫瘤的治療開辟新的思路和途徑。

非因生物的DSP空間多組學技術(shù)可以通過對TAM的精確定位來實現(xiàn)不同空間組定義的巨噬細胞亞群表達譜差異的分析 （圖4），從而深化科研人員對腫瘤微環(huán)境的研究。非因DSP空間多組學技術(shù)通過在單張切片上選擇合適的興趣點（Region of Interest，ROI），來實現(xiàn)基于每個ROI微環(huán)境的100重蛋白或＞18,000重全轉(zhuǎn)錄組的原位表達譜分析，是針對腫瘤免疫和腫瘤微環(huán)境設計的高精度、多維度分析的新一代空間組學技術(shù)。目前已經(jīng)成功開發(fā)了針對DSP蛋白組和轉(zhuǎn)錄組分析的TAM研究流程，歡迎各位老師前來咨詢。

（該文章部分內(nèi)容轉(zhuǎn)自ABclonal）

Hepatology：M2型巨噬細胞來源外泌體通過αMβ2 整合素促進肝癌轉(zhuǎn)移

前言

肝細胞癌（HCC）是世界上第五大常見癌癥，以及全球癌癥死亡的第五大原因。大部分HCC患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，其中肺轉(zhuǎn)移的總體生存率約5.9月，無轉(zhuǎn)移患者總體生存率約16.2月。肺轉(zhuǎn)移在惡性腫瘤中的發(fā)病率約25%-30%，HCC患者發(fā)病率約41.6%-43.6%。

腫瘤細胞與相應微環(huán)境的相互作用以及基質(zhì)細胞參與腫瘤進展的重要性。腫瘤的基質(zhì)細胞有內(nèi)皮細胞，纖維母細胞，腫瘤浸潤的炎癥細胞，這些細胞創(chuàng)造微環(huán)境，改善腫瘤細胞的特性，調(diào)控腫瘤的發(fā)展及對治療的應答。研究表明，腫瘤相關的巨噬細胞（TAMs）可以加速腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。巨噬細胞根據(jù)極化特性分為M1和M2型，M1型巨噬細胞能夠分泌促炎癥和免疫刺激因子，TAMs比較接近M2型巨噬細胞，可以激活產(chǎn)生Th2細胞因子。TAMs加速癌細胞轉(zhuǎn)移以及癌細胞與TAMs對話的潛在機制有待進一步闡明。

外泌體是一種包含蛋白、核酸、脂質(zhì)的微小囊泡，參與腫瘤微環(huán)境中不同類型細胞間的物質(zhì)運輸、信息傳遞。由于TAMs外泌體與腫瘤的研究是有限的，所以TAMs外泌體對腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移也需要進一步探索。

最近發(fā)表于Hepatology雜志（IF=14.679）的研究指出，腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）來源的外泌體介導CD11b/CD18蛋白轉(zhuǎn)移到腫瘤細胞，可能增強了肝癌細胞遷移能力，為腫瘤轉(zhuǎn)移機制提供新的見解。

◆ 技術(shù)路線 ◆

在這項研究中，研究人員獲取120例肝癌vs. 癌旁，轉(zhuǎn)移vs. 非轉(zhuǎn)移臨床樣本，CD206、CD68在肝癌和HCC非轉(zhuǎn)移組織樣本中表達顯著升高，且CD206、CD68高表達患者預后較差。

功能上，M2型巨噬細胞/M2型巨噬細胞條件培養(yǎng)基與肝癌細胞共培養(yǎng)，促進肝癌細胞的遷移和侵襲。

PKH26染色示蹤肝癌細胞吞噬外泌體效率；M2型巨噬細胞來源外泌體（M1 exos）介導肝癌細胞遷移和侵襲；GW4869（外泌體抑制劑）逆轉(zhuǎn)遷移和侵襲表型。

體內(nèi)實驗表明，巨噬細胞來源外泌體預處理肝癌細胞，尾靜脈接種到小鼠。與對照、M1 exos相比，M2 exos組肺轉(zhuǎn)移顯著增強；GW4869可以逆轉(zhuǎn)體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移表型。另外，M2 exos組總體生存時間也顯著降低。M2 exos增強HCC細胞侵襲能力，可能是巨噬細胞和肝癌細胞之間的一種新的信息傳遞模型。

蛋白質(zhì)組學測序：M2 exos 組顯著上調(diào)的蛋白有：FGL2，F(xiàn)ABP4, CD37, ITGB2 (CD18 or β2 integrin), ITGB5, and ITGAM (CD11b or αM integrin)。體內(nèi)和體外研究結(jié)果表明，CD18 、CD11b在M2 exo中高表達，可通過M2 exo傳遞到HCC細胞；CD18 、CD11b抗體阻斷后遷移和侵襲能力也下調(diào)，小鼠存活時間延長。

前期研究結(jié)果表明，在腫瘤發(fā)生的初期，MMPs降解胞外基質(zhì)介導腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究者通過WB、qPCR、ELISA實驗發(fā)現(xiàn)M2 exo處理的肝癌細胞中MMP-9表達上調(diào)，CD18 、CD11b抗體阻斷后MMP-9表達量下調(diào)；MMP抑制劑（MMPi）或聯(lián)合M2 exo處理肝癌細胞，其遷移和侵襲力下降；另外MMPi處理的肝癌細胞接種小鼠，肺轉(zhuǎn)移數(shù)目顯著降低。

總之，本研究闡明了M2 exo傳遞αMβ2到肝癌細胞，激活受體細胞表達MMP9，從而促進肝癌轉(zhuǎn)移。

● HYY提供外泌體研究的整體實驗服務 ●

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