CRISPR專利爭奪戰(zhàn)或塵埃落定：張鋒團(tuán)隊(duì)取得決定性勝利

2017年2月16日 訊 /生物谷BIOON/ --北京時(shí)間2月16日（美東時(shí)間2月15日），美國專利局審查與上訴委員會(huì)作出裁決，判定張鋒（Feng Zhang）及哈佛大學(xué)與麻省理工學(xué)院Broad研究所申請(qǐng)的CRISPR基因編輯專利，與加州大學(xué)伯克利分校研究者Dougna和歐洲合作者Charpentier的CRISPR發(fā)現(xiàn)，并不存在沖突，"no interference in fact"。這也就表明，兩家的研究發(fā)現(xiàn)并不重復(fù)，因此張鋒（Feng Zhang）與Broad研究所得以繼續(xù)保留其2014年獲批的CRISPR專利權(quán)；這場天價(jià)的專利爭奪戰(zhàn)，至少在當(dāng)前已經(jīng)結(jié)束，張鋒取得了巨大勝利。

2012年，一種名為“CRISPR/Cas9”的DNA編輯技術(shù)橫空出世。從那時(shí)開始，CRISPR/Cas9被用于很多生物系統(tǒng)中進(jìn)行基因組編輯，在各大頂級(jí)期刊上發(fā)表了大量文章，可算是賺足了眼球。隨著CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)逐漸進(jìn)化，并趨于成熟，從學(xué)術(shù)界的共享走向?qū)＠暾?qǐng)以及商業(yè)化的道路也逐漸清晰起來。然而科學(xué)家們還面臨著很多問題，比如，CRISPR/Cas9的專利申請(qǐng)利。

加利福尼亞大學(xué)的研究者Jennifer Doudna及瑞典于默奧大學(xué)的研究者Emmanuelle Charpentier首先聯(lián)合提出了專利申請(qǐng)，2012年她們首次在Science雜志發(fā)表論文闡明了Cas9酶可以定向切割離體DNA的特殊位點(diǎn)，同時(shí)于當(dāng)年5月25日提交了專利申請(qǐng)；此時(shí)來自MIT Broad研究所及哈佛大學(xué)的研究者張鋒（Feng Zhang）在2013年所發(fā)表的一篇論文中闡述了CRISPR–Cas9技術(shù)在哺乳動(dòng)物機(jī)體中的應(yīng)用，同時(shí)他們也于2012年12月12日提交了專利的申請(qǐng)。

盡管伯克利的研究小組首先提交了專利申請(qǐng)，但隨后張鋒（Feng Zhang）團(tuán)隊(duì)提交了加快審核專利的計(jì)劃，并于2014年4月最終獲得了該專利；隨后來自伯克利的研究者要求對(duì)Broad研究組的最早專利以及另外11項(xiàng)專利進(jìn)行專利干涉，2016年1月11日美國專利商標(biāo)局（USPTO）接受了伯克利研究小組的請(qǐng)求。一場圍繞CRISPR-Cas9的專利大戰(zhàn)也隨之打響了，兩個(gè)團(tuán)隊(duì)分別號(hào)稱自己最先發(fā)明了這項(xiàng)技術(shù)，雙方各執(zhí)一詞，整個(gè)生物界莫衷一是。

此前雙方都已提交了大量文件，而他們爭論的焦點(diǎn)不僅在于誰發(fā)明了CRISPR，還有誰首先解決了這項(xiàng)科技關(guān)鍵問題。這就是齟齬所在。伯克利認(rèn)為2012年Doudna的研究發(fā)表后，任何人都能夠?qū)⑦@一技術(shù)用于編輯真核細(xì)胞（一種人類和動(dòng)物細(xì)胞）。這一技術(shù)的衍生發(fā)展顯而易見，易如反掌；因此張鋒（Feng Zhang）的專利缺乏法律依據(jù)。Broad研究所則認(rèn)為，這絕無可能，將理論知識(shí)真正應(yīng)用于編輯復(fù)雜器官是一次巨大的進(jìn)步，張鋒獲得專利是實(shí)至名歸。

由USPTO專利法官組成的小組會(huì)傾聽來自雙方的證據(jù)，以此來確定哪個(gè)團(tuán)隊(duì)發(fā)明了CRISPR–Cas9基因編輯技術(shù)，大部分的行動(dòng)都將通過電話或書面文件的形式來傳遞實(shí)現(xiàn)，同時(shí)可能會(huì)存在一些口頭辯論，而且還會(huì)包含學(xué)術(shù)發(fā)明者的相關(guān)證詞。來自北卡羅來納周立大學(xué)的法學(xué)學(xué)者John Conley說道，通常專利干涉具有較高的科技含量，對(duì)于我們來說很難引用更為復(fù)雜的法律，而USPTO法官小組將主要確定哪個(gè)團(tuán)隊(duì)是首個(gè)利用CRISPR–Cas9進(jìn)行基因編輯的團(tuán)隊(duì)，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)確定哪個(gè)團(tuán)隊(duì)先提出的這個(gè)發(fā)明思路。整個(gè)過程可能非常混亂，在先發(fā)明主義 （first-to-invent）專利的時(shí)代，許多公司會(huì)保留發(fā)明者的原始筆記，而且當(dāng)公司的某個(gè)人有某種創(chuàng)新性想法時(shí)，他就會(huì)記錄到筆記本上，并且在未來的專利紛爭中拿出來作為一定的證據(jù)，而目前很少有學(xué)術(shù)研究的實(shí)驗(yàn)室達(dá)到這樣的高度。

在今天的裁決中，法官們認(rèn)為在張鋒（Feng Zhang）之前沒有研究人員能夠絕對(duì)地確認(rèn)，CRISPR能用于有核細(xì)胞（比如人類細(xì)胞），而張鋒（Feng Zhang）研究團(tuán)隊(duì)的發(fā)明，并非簡單的擴(kuò)展。因此，他們判定張鋒（Feng Zhang）得以保留其專利。然而在聽取裁決后，加大伯克利分校發(fā)表聲明，她們表示尊重裁決，但同時(shí)也堅(jiān)持認(rèn)為是Dougna與Charpentier首先發(fā)明了CRISPR系統(tǒng)。

在專利大戰(zhàn)的背后是巨大的商業(yè)利益，此次裁決后，Editas Medicine股價(jià)暴漲超過30%以上。迄今為止，美國專利局已經(jīng)授予50項(xiàng)與CRISPR有關(guān)的專利，其中Broad研究所和MIT擁有15項(xiàng)。Broad研究所方面稱，全世界的科研人員可以用他們的技術(shù)進(jìn)行學(xué)術(shù)研究，但是廠商必須付費(fèi)使用。值得一提的是，專利判決并不會(huì)影響CRISPR-Cas9技術(shù)在科研領(lǐng)域的應(yīng)用，未來我們將會(huì)繼續(xù)期待CRISPR-Cas9為人類健康做出的更多貢獻(xiàn)。

誰才是CRISPR技術(shù)的所有者

　近年來，CRISPR/Cas9風(fēng)暴席卷全球。這項(xiàng)基因組編輯技術(shù)在短短幾年內(nèi)迅速應(yīng)用于世界各地的實(shí)驗(yàn)室，并催生了上千篇文章的發(fā)表。然而，麻省理工學(xué)院（MIT）的《Technology Review》雜志提出了一個(gè)問題，誰才是CRISPR技術(shù)的所有者？ 立即索取更多資料 生物通 www.ebiotrade.com
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近年來，CRISPR/Cas9風(fēng)暴席卷全球。這項(xiàng)基因組編輯技術(shù)在短短幾年內(nèi)迅速應(yīng)用于世界各地的實(shí)驗(yàn)室，并催生了上千篇文章的發(fā)表。然而，麻省理工學(xué)院（MIT）的《Technology Review》雜志提出了一個(gè)問題，誰才是CRISPR技術(shù)的所有者？生物通 www.ebiotrade.com
一個(gè)月前，“科學(xué)突破獎(jiǎng)”（Breakthrough Prize）揭曉。加州大學(xué)伯克利分校的Jennifer Doudna和德國亥姆霍茲傳染研究中心的Emmanuelle Charpentier因在CRISPR技術(shù)方面的重要貢獻(xiàn)而獲獎(jiǎng)，且每人獲得了300萬美元的獎(jiǎng)金。
這一領(lǐng)域的另一位風(fēng)云人物，Broad研究院的張鋒（Feng Zhang）雖然沒有獲得科學(xué)突破獎(jiǎng)，但在今年4月獲得了CRISPR/Cas9的首個(gè)專利。他的研究中心控制著這一技術(shù)的每個(gè)重要商業(yè)應(yīng)用。生物通 www.ebiotrade.com
那么問題來了，這個(gè)備受矚目的獎(jiǎng)項(xiàng)和專利為何會(huì)落入不同人的手中？究竟是誰發(fā)明了它？“這一領(lǐng)域的知識(shí)產(chǎn)權(quán)相當(dāng)復(fù)雜，”CRISPR Therapeutics公司的CEO Rodger Novak談道。Emmanuelle Charpentier是這家公司的創(chuàng)始人之一。
Tech Review的記者Antonio Regalado指出，張鋒與Doudna共同創(chuàng)立了Editas Medicine公司，它獲得了Broad的技術(shù)授權(quán)。不過，在張鋒成功申請(qǐng)專利之后，Doudna就與該公司斷絕了關(guān)系。她將她的知識(shí)產(chǎn)權(quán)（專利申請(qǐng)中）授予了另一家競爭性的公司Intellia Therapeutics。然而，讓事情更加復(fù)雜的是，Charpentier又將她在同一專利申請(qǐng)中的權(quán)利出售給了CRISPR Therapeutics。生物通 www.ebiotrade.com
此外，圍繞這一技術(shù)的科學(xué)信用，那也是錯(cuò)綜復(fù)雜。2012年夏天，Doudna、Charpentier及她們的團(tuán)隊(duì)發(fā)表了一篇文章，證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以作為一種可編程的DNA編輯工具。半年后，張鋒博士以及哈佛大學(xué)的George Church發(fā)表文章稱它可應(yīng)用于人類細(xì)胞，不久后，Doudna也發(fā)表了類似的結(jié)果。
但是，張鋒表示他對(duì)Doudna和Charpentier的工作知之甚少。為了支持他的專利申請(qǐng)，他提交了實(shí)驗(yàn)室筆記本的照片，表示他在2012年年初就開始了這方面的研究，早于Doudna和Charpentier。生物通 www.ebiotrade.com
Charpentier表示：“我可以說的是，我和Jennifer Doudna是在我的實(shí)驗(yàn)室中開展研究。這里的一切都很夸張，因?yàn)檫@是一項(xiàng)人們很容易學(xué)會(huì)的技術(shù)。事情發(fā)生得太快了?！?br>Regalado在文中寫道：“目前還沒有CRISPR藥物。但是如果CRISPR真的如科學(xué)家想象得那么重要，對(duì)這一基本技術(shù)的商業(yè)控制將價(jià)值數(shù)十億美元?！币苍S，這場專利之戰(zhàn)才剛剛開始。（生物通 薄荷）

CRISPRa基因過表達(dá)技術(shù)

上回說到，基因功能研究，最常用的策略就是功能獲得和功能失活?；蜻^表達(dá)、基因干擾、基因敲除，這三板斧揮出去，配合下游的轉(zhuǎn)錄譜分析、表型分析，基因功能的神秘面紗，往往就能解開一角。

基因過表達(dá)技術(shù)，通常是指將目的基因的ORF構(gòu)建到組成型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子的下游，通過載體轉(zhuǎn)入某一特定細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)量增加的目的，可以使用的載體類型有Virus-Free轉(zhuǎn)座子載體，慢病毒載體，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體等多種類型。當(dāng)基因表達(dá)產(chǎn)物超過正常水平時(shí)，觀察該細(xì)胞的生物學(xué)行為變化，從而了解該基因的功能。

CRISPRa(轉(zhuǎn)錄激活)，作為基因過表達(dá)技術(shù)的新成員，是通過催化失活的Cas9（dCas9）連上轉(zhuǎn)錄激活子，來實(shí)現(xiàn)促進(jìn)基因組特定位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄。

目前CRISPRa已經(jīng)發(fā)展出好幾個(gè)新版本。MIT的CRISPR先驅(qū)張鋒通過改造dCas9和sgRNA優(yōu)化了轉(zhuǎn)錄機(jī)器的招募，成功將RNA表達(dá)水平提升了一個(gè)數(shù)量級(jí)。張鋒團(tuán)隊(duì)用自己的改良版CRISPRa激活了十個(gè)基因,研究顯示，這些基因的轉(zhuǎn)錄都得到了兩倍以上的增漲，許多基因的活性甚至有了幾個(gè)數(shù)量級(jí)的增加。他們發(fā)現(xiàn)，CRISPRa離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)越近，轉(zhuǎn)錄激活的效果就越強(qiáng)。如果CRISPRa靶向轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游（超過200bp），觸發(fā)的轉(zhuǎn)錄就會(huì)更為溫和，更接近生理水平。通過這一途徑揭示了基因表達(dá)量與表型強(qiáng)度之間的線性關(guān)系。

加州大學(xué)的Jonathan Weissman研究團(tuán)隊(duì)在dCas9上融合了一連串短肽（也就是SunTag array），這些短肽相當(dāng)于一套分子掛鉤，能在細(xì)胞中招募多拷貝的轉(zhuǎn)錄激活子，生成強(qiáng)勁的信號(hào)。

綜合看CRISPRa（基因激活）系統(tǒng)是用于轉(zhuǎn)錄激活內(nèi)源性基因的強(qiáng)大工具。完整的CRISPRa系統(tǒng)包含三個(gè)組分，每個(gè)組分分別由單獨(dú)的載體提供：gRNA/MS2表達(dá)載體，MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64輔助載體。

gRNA/MS2表達(dá)載體，包括兩個(gè)138-nt發(fā)夾RNA適體，形成噬菌體MS2衣殼蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。這些發(fā)夾RNA適體與gRNA連接，有利于高效募集MS2-融合蛋白。

MS2/P65/HSF1輔助載體驅(qū)動(dòng)由MS2，p65（NF-kB的反式激活亞基）和HSF1（人熱休克因子1的激活結(jié)構(gòu)域）組成的三結(jié)構(gòu)域融合蛋白的表達(dá)。

dCas9/VP64輔助載體驅(qū)動(dòng)催化失活變體dCas9和合成型VP64反式激活結(jié)構(gòu)域融合蛋白的表達(dá)。

當(dāng)這三種載體共轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞時(shí)，用戶定制的gRNA可能會(huì)募集MS2/P65/HSF1（通過MS2結(jié)合發(fā)夾適體與gRNA連接）和dCas9/VP64（通過CRISPR/Cas9復(fù)合物組裝） 到gRNA靶位點(diǎn)，從而組裝出強(qiáng)大的SAM復(fù)合物。這些SAM復(fù)合物可通過VP64，p65和HSF1激活結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)的強(qiáng)烈轉(zhuǎn)錄激活。

該載體系統(tǒng)可用于激活單個(gè)或一系列基因的轉(zhuǎn)錄，也可用于基因組的大規(guī)模篩選，使用gRNA序列文庫來產(chǎn)生gRNA/MS2表達(dá)載體文庫。?

Chavez A, et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming[J]. Nature Methods, 2015, 12(4): 326-328.??

J Microbiol Biotechnol. 2017 Oct 28;27(10):1855-1866. doi:?10.4014/jmb.1705.05081.

CRISPRa vs ORF傳統(tǒng)過表達(dá)技術(shù)

相比于傳統(tǒng)ORF穩(wěn)轉(zhuǎn)過表達(dá)技術(shù)，CRISPRa通過激活內(nèi)源性啟動(dòng)子高效轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)基因表達(dá)，不需要額外構(gòu)建外源性表達(dá)元件，不受基因轉(zhuǎn)錄本大小的限制。

Kampmann M. (2018). CRISPRi and CRISPRa Screens in Mammalian Cells for Precision Biology and Medicine. ACS chemical biology, 13(2), 406–416.

因此，CRISPRa技術(shù)在長轉(zhuǎn)錄本基因過表達(dá)研究、單基因多轉(zhuǎn)錄本的整體激活研究具有不可替代的優(yōu)勢。

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