全基因組測序解密慢性高原病(什么是基因組測序)

佚名 2023-08-15 08:00:46

8月16日，由加州大學(xué)圣地亞哥分校

、華大基因等單位共同完成的安第斯高地人慢性高原病全基因組測序及相關(guān)研究，在《美國人類遺傳學(xué)雜志》上發(fā)表

。研究為探索高原適應(yīng)性的遺傳機(jī)制提供了基礎(chǔ)理論，也為慢性高山病的機(jī)理研究及治療提供了科學(xué)依據(jù)

。

全球約有1.4億人世居高原

。對于高原低氧環(huán)境的不適

，通常會產(chǎn)生各種高原疾病

，尤其生活在海拔3000米以上的人

，通常會發(fā)生慢性高原病

，表現(xiàn)為紅細(xì)胞增多

，并出現(xiàn)一系列頭痛

、乏力、嗜睡等癥狀

。

研究人員對20個生活在高原地區(qū)的安第斯人進(jìn)行全基因組測序，其中包括10個慢性高原病患者和10個正常人

。研究人員發(fā)現(xiàn)其基因組中

，有11個區(qū)域存在明顯的單體型頻率差異并發(fā)生選擇性清除

，暗示著這些區(qū)域受到強烈的正向自然選擇。在位于這些區(qū)域的基因中

，相比于正常人群

，在慢性高原病患者中anp32d和senp1兩個基因顯著高表達(dá)

。同時還發(fā)現(xiàn)

，當(dāng)果蠅中anp32d和senp1的同源基因表達(dá)下調(diào)時

，其在低氧環(huán)境下的存活率將顯著升高

。據(jù)此

，他們推測

，這些基因表達(dá)下調(diào)可能有利于對低氧環(huán)境下的適應(yīng)和耐受。

研究人員發(fā)現(xiàn)

，慢性高原病患者負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的基因senp1表達(dá)上調(diào)，可能在導(dǎo)致慢性高原病患者紅細(xì)胞增多的癥狀中扮演了重要角色

。此外，anp32d是已知的原癌基因

，研究人員推測在慢性高山病患者中，該基因以用類似于在癌細(xì)胞中的方式來改變細(xì)胞代謝

，從而使得低氧環(huán)境下細(xì)胞大量增殖

。這些發(fā)現(xiàn)同時還將有助于揭示類似環(huán)境下發(fā)生的疾病病理機(jī)制

，如心臟病、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征等

。

科學(xué)家表示

，通過強大的全基因組測序技術(shù)

、體外培養(yǎng)的人細(xì)胞模型和果蠅活體模型的有機(jī)結(jié)合

，不僅能夠鑒定出與缺氧耐受相關(guān)的基因

，同時也對這些基因的功能進(jìn)行了系統(tǒng)的評估

。這種研究策略將可用于發(fā)現(xiàn)更多疾病的致病基因

。

什么是基因組測序

基因組測序是一種新型基因檢測技術(shù)

，能夠從血液或唾液中分析測定基因全序列，預(yù)測罹患多種疾病的可能性

，個體的行為特征及行為合理?div id="4qifd00" class="flower right">

；驕y序技術(shù)能鎖定個人病變基因，提前預(yù)防和治療

。基因測序相關(guān)產(chǎn)品和技術(shù)已由實驗室研究演變到臨床使用

，可以說基因測序技術(shù)

，是下一個改變世界的技術(shù)

。

為何處于高原環(huán)境中
，有的人會有高原反應(yīng)
？

人處于高原中

，之所以有些人會有高原反應(yīng)而有些人又沒有高原反應(yīng)是和人的上山速度

、海拔高度

、居住時間以及人體的基因等有關(guān)

。

例如：根據(jù)科學(xué)研究表明

，在藏族人中有一種基因是變異的，這種基因叫MTHFR

，MTHFR變異后會提高藏族人體內(nèi)的葉酸含量使其更能適應(yīng)高原的生活環(huán)境

。高原適應(yīng)本來就有一個復(fù)雜的生物學(xué)過程

，參與的基因應(yīng)該很多

，此次發(fā)現(xiàn)的基因變異只是其中發(fā)現(xiàn)的一小部分

。

那作為在平原生活的人要怎樣來面對高原反應(yīng)呢

？我們可以從高原反應(yīng)的癥狀和適應(yīng)性訓(xùn)練兩方面來入手

。

一

、高原反應(yīng)高原反應(yīng)是指人體快速進(jìn)入海拔3000米以上的高原

，在低壓低氧環(huán)境下出現(xiàn)的各種不適

，是高原地區(qū)特有的常見病

。

主要癥狀為頭痛

，失眠

，食欲不振

，疲勞

，呼吸困難等

。其中頭疼是高原反應(yīng)最常見的癥狀，癥狀通常是額部和雙顳部跳動痛

，在晚上或早上起床時疼痛會加劇

。但通過調(diào)整呼吸或者輕微的運動等可以減輕頭痛。

高原反應(yīng)可分為急性和慢性

。無論是急性高原反應(yīng)還是慢性高原反應(yīng)

，最好的應(yīng)對方法就是休息

，減少機(jī)體的氧耗

，同時注意保暖

，防曬

，防風(fēng)等

。

二

、避免高原反應(yīng)的適應(yīng)性訓(xùn)練要避免高原反應(yīng)需進(jìn)行心理、體質(zhì)適應(yīng)性鍛煉

，使身體能對從平原到高原缺氧環(huán)境的轉(zhuǎn)變過來

。在避免高原反應(yīng)的方法中，除對缺氧特別敏感者外

，階梯式上山是預(yù)防急性高原病最安全、最可靠的方法

。

如果想要進(jìn)入海拔4000 m以上的高原

，進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練時應(yīng)在2500~3000m處停留2~3天

，然后每天上升的速度不宜超過600~900m

。

除此之外

，抵達(dá)高原后的前兩天避免飲酒和服用不合適的藥物

，避免劇烈的體力活動

，輕度的活動可以促使身體盡快的適應(yīng)高原反應(yīng)

，同時要注意防寒防凍

，注意保溫

，多吃高碳水化合物食物。

新一代測序技術(shù)

第一代測序技術(shù)以“Sanger法”為代表

，實現(xiàn)了測序技術(shù)從無到有的飛躍，人們借助其完成了“人類基因組草圖”

，以及動植物

、微生物等模式生物的基因組測序

。一代測序經(jīng)發(fā)展實現(xiàn)了自動化

，但總體而言通量低、流程長

、成本高，難以商業(yè)化

。新測序技術(shù)以不可抵擋的勢頭發(fā)展起來

。

新一代測序技術(shù)（next-generation sequencing, NGS）的起點是2005年以來Roche 454

、Illumina GA/HiSeq

、Life SOLiD/Ion Torrent、PacBio RS技術(shù)的發(fā)明

，新技術(shù)使測序通量快速增加，測序成本極大降低

。本文主要介紹Illumina測序技術(shù)

、Pacific BioSciences SMRT RS測序技術(shù)

、Oxford納米孔測序技術(shù)及華大平臺的DNBSEQ TM 測序技術(shù)

。

該技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的新一代基因組測序平臺

，它使用邊合成邊測序技術(shù)實現(xiàn)大規(guī)模平行測序

。它最早是由Solexa公司開發(fā)

，所以也稱為Solexa測序技術(shù)

。Illumina測序平臺有多種儀器選擇

，如超大通量

、適合測序中心和測序公司的 HiSeq 系列測序儀，也有適合中小型實驗室測序和醫(yī)院醫(yī)療診斷測序使用的 MiSeq 和 NextSeq500 測序儀

，也有專門用于醫(yī)療診斷測序用的 MiniSeq 等。測序模式分為 高通量模式 與 快速模式

。其中，高通量模式可兼容更多的樣本量及應(yīng)用種類

；而快速模式測序速度更快、單次運行成本更低

。

Solexa測序技術(shù)的原理網(wǎng)友“星空Idealist”在“知乎”

、“Z_Y_H”在“”等平臺做過詳細(xì)介紹：

（第二代測序原理的詳細(xì)解析

！- 星空Idealist的文章 - 知乎）

；

（ illumina 雙端測序- Z_Y_H的文章 - ）

。

下面只做簡單概括

。該方法的第一步是 建立測序文庫 （sequencing library preparation）（圖1）

?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">；蚪M打碎成小片段

，雙端補齊

，3’加A尾

，添加Illumina專用接頭（一端有oligo T）

，該接頭含有一個酶切位點

，且為環(huán)狀非互補鏈

，故形成一個“球形”接頭

。當(dāng)用限制酶進(jìn)行切割后

，形成“Y形”末端，從而能按部就班逐鏈復(fù)制

。在雙鏈末端加入與后續(xù)擴(kuò)增引物互補的片段（通過兩次復(fù)制實現(xiàn)，所加兩端引物序列不同

，設(shè)為P5

、P7）

，以及在引物內(nèi)側(cè)加入標(biāo)記（barcode）（所加兩端標(biāo)記不同）

，如有需要可用 Taq 酶補齊至平末端

。做好以上工作

，需行純化

，僅將正確添加接頭的序列用于后續(xù)反應(yīng)

，去除引物、酶等雜質(zhì)

。以上操作可一次性對整個文庫進(jìn)行。

提純后進(jìn)行文庫的 擴(kuò)增成簇過程 （cluster generation）

，該過程的目的是為使測序信號放大。經(jīng)變性的測序文庫在有八個泳道（lane）的芯片（flow cell）上

，與固化在泳道玻片壁上的寡核苷酸特異性互補結(jié)合（P5’

、P7’）

，經(jīng)一輪復(fù)制（5’->3’）

，模板被切斷并洗掉，固定在芯片的寡核苷酸合成為互補鏈

。然后開始橋式擴(kuò)增（bridge amplification）把帶有待測DNA片段的文庫擴(kuò)增到1000個拷貝左右

，每個拷貝都有相同的DNA序列，這樣就形成了簇（cluster）

。最后一次擴(kuò)增產(chǎn)物變性為單鏈，這些單鏈可用來雙端測序（paired-end sequencing）

，但通常的做法是利用甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）的8-氧鳥嘌呤糖苷（8-oxo-G）選擇性切斷作用

，選擇性將正向或反向序列從接頭處切去

，避免因鏈間距過近對序列添加的影響

。若先切去反向序列

，則測完后

，再重復(fù)前述反應(yīng)至選擇性切割時，切去正向序列

，進(jìn)行反向測序即可。

第三步是 測序過程

。Illumina平臺使用SBS技術(shù)和3’端可逆屏蔽終結(jié)子技術(shù)（3’-blocked reversible terminator）進(jìn)行測序。3’端可逆屏蔽終結(jié)子技術(shù)利用有熒光標(biāo)記的特殊核苷酸

，這種核苷酸的3’羥基被化學(xué)基團(tuán)屏蔽

，導(dǎo)致每次DNA鏈合成都只能加入一個核苷酸

，但當(dāng)熒光圖像記錄完后

，該化學(xué)屏蔽基團(tuán)便通過酶切方法切掉

，3’端恢復(fù)連接能力

，如此周而復(fù)始

?div id="m50uktp" class="box-center"> ？梢韵胂螅捎谄鸪踝冃晕膸熘邪０?互補鏈（二者的標(biāo)記沒有區(qū)別）

，在一次過程中同時被測序，因此在收集單向測序（single read sequencing）結(jié)果時需進(jìn)行互補鏈識別

，以免序列拼接發(fā)生混亂

。正反雙端測序，極大提高了測序效率

。

由于Illumina測序技術(shù)使用擴(kuò)增成簇的信號放大原理，使其讀長無法達(dá)到一代測序水平

，因為當(dāng)擴(kuò)增至數(shù)百堿基后

，受核苷酸濃度

、酶活等影響

，簇內(nèi)堿基添加將不再同步

，不同步則信號混亂

，導(dǎo)致讀序不準(zhǔn)

。

該技術(shù)是Pacific BioSciences推出的 單分子實時（single molecular real time）DNA測序技術(shù)

，基于邊合成邊測序原理。該技術(shù)主要特點是讀長長，平均序列在10kb以上

，最長讀長可達(dá)40kb

。它以SMRT Cell為測序載體

，SMRT Cell是一張厚度為100nm的金屬片

，一面帶有15萬個（2014年）直徑為幾十納米的小孔，稱為 零模波導(dǎo) （zero-mode waveguide, ZMW）

，也稱納米孔。測序時

，系統(tǒng)將測序文庫、DNA聚合酶和帶有不同熒光標(biāo)記的dDNA放置到納米孔底部進(jìn)行DNA合成反應(yīng)

。通常一個納米孔固定一個DNA聚合酶Fenix和一條DNA模板

。

該方法的特別之處在于 測序文庫不需要擴(kuò)增

，因為零模波導(dǎo)能極大消除噪音熒光背景

，而使單分子反應(yīng)釋放的熒光也能被準(zhǔn)確記錄。此外

，SMRT技術(shù)用于檢測標(biāo)記的熒光基團(tuán)與脫氧核苷酸的結(jié)合位置不是在堿基上

，而是在5’磷酸基團(tuán)的第3個磷酸基上

，這樣在dNTP于測序模板互補結(jié)合到測序引物上發(fā)生縮合反應(yīng)后

，熒光基團(tuán)就隨焦磷酸一起被切掉了，省去酶切步驟

。

2014年Oxford Nanopore公司推出了幾款基于納米孔測序技術(shù)的測序儀MinION、PromenthION

、GridION。其基本原理為：在充滿了電解液的納米級小孔兩端加上一定的電壓

，可以很容易地測量通過此納米孔的電流強度

。納米孔的直徑只能容納一個核苷酸通過

，當(dāng)核苷酸通過時

，納米孔被核苷酸阻斷，通過的電流強度隨之變?nèi)?div id="m50uktp" class="box-center"> 。由于四種核苷酸堿基的空間構(gòu)象不同，它們在通過納米孔時

，被減弱的電流強度變化程度也就有所不同。因此

，只需檢測DNA通過納米孔時檢測電流強度的變化

，即可實現(xiàn)實時測序

。

該法亦無需文庫擴(kuò)增

，讀長長，實時

，單分子，可以極大降低測序成本

。

該技術(shù)起源于Complete Genomics，改進(jìn)于華大

。下面根據(jù)華大官網(wǎng)文章簡要說明該方法的原理

。

按照圖2的流程

，華大基因使用DNA納米球技術(shù)來擴(kuò)增DNA序列

，在該技術(shù)中，DNA被分割成約100堿基對的片段

。該片段的每一側(cè)與第一種接頭

，即接頭1連接

。連接后的DNA片段被擴(kuò)增

，通過將兩端的接頭結(jié)合而形成環(huán)狀連接的序列片段

。該環(huán)狀DNA片段被切割以加入第二種銜接子

，即接頭2，并重復(fù)擴(kuò)增和環(huán)化過程

。一旦將四種接頭，即接頭1,2,3和4（四種接頭的序列不同

，有些是與引物互補的寡核苷酸，有些是標(biāo)記物等）加入到DNA片段中

，則通過滾環(huán)擴(kuò)增最后的環(huán)狀DNA以產(chǎn)生 DNA納米球 （DNA nanoball, DNB）

。滾球擴(kuò)增時不切斷各拷貝

，而利用某種方法使擴(kuò)增后變性但又不影響延伸，得到一團(tuán)多拷貝的納米球

。將納米球固定在芯片上的網(wǎng)狀小孔內(nèi)。

測序使用聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)（combinatorial probe-anchor ligation sequencing, cPAS）和多重置換擴(kuò)增的雙末端測序法（MDA-PE）增加測序讀長

，可測得100bp/150bp的雙端序列

。目前為止

，并沒有對聯(lián)合探針錨定聚合技術(shù)的詳細(xì)披露

。 MDA-P的具體原理是：經(jīng)復(fù)制延伸完成第一鏈（Forward Strand）的測序后，在具備鏈置換功能的高保真聚合酶的作用下

，除去第一鏈模板同時合成第二鏈（Reverse Strand）

，并通過DNA分子錨

，進(jìn)行第二鏈的測序

。

與其他二代測序相比，DNBSEQ TM 測序技術(shù)基于DNB

，DNB以最初模板擴(kuò)增

，不同于PCR的指數(shù)增長

，最重要的是 其不會使擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的錯誤累積

。

[1] 陳浩峰. 新一代基因組測序技術(shù)[M]. 第一版. 北京: 科學(xué)出版社, 2016.
[2]第二代測序原理的詳細(xì)解析！- 星空Idealist的文章 - 知乎.
[3]illumina 雙端測序- Z_Y_H的文章 - .
[4]華大科技-產(chǎn)品服務(wù)-全外顯子測序-產(chǎn)品介紹 .
[5]解密人類基因組：下一代測序 -（一）- Jing Zhou的文章 - LEXOLOGY.