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中科院在免疫抑制劑的高效合成研究中取得進展

中醫(yī)世家 2024-05-15 00:25:13

中科院在免疫抑制劑的高效合成研究中取得進展

a和b是南京大學教授譚仁祥從螳螂腸道真菌中首先分離出來的

、具有強免疫抑制作用的聚酮類天然產物,在抑制小鼠脾細胞增殖中表現出與環(huán)孢素a相當的抗免疫活性,而且 a和b的細胞毒性則更小
。有趣的是天然的 a和b均為兩個對映異構體的非消旋混合物
,初步生物活性測試表明天然的混合物比光學純的對映異構體具有更強的抗免疫活性
。從分子結構上看
, a和b均具有一個獨特的含有七個不同大小稠環(huán)和兩個手性中心(其中一個為手性季碳)的高密度碳骨架
,合成挑戰(zhàn)性大
。由于它們獨特的生理活性和結構特征
,國際上許多研究小組展開了對 a和b的合成研究。在此之前
,僅有一例關于 a和b的消旋合成
,路線冗長,而且產率低

中國科學院上海有機化學研究所生命有機國家重點實驗室湯文軍課題組一直致力于發(fā)展高效的不對稱偶聯方法學并應用于手性天然產物和藥物的綠色合成

。兩年前,課題組發(fā)展了分子內兩芳基間的不對稱去芳構偶聯
,實現了對含有手性季碳中心的菲酮類三環(huán)結構的高效不對稱構筑
,并完成了對一些甾體和萜類分子或中間體的簡潔合成。最近
,趙國慶
、徐廣慶和錢超利用不對稱去芳構偶聯為主要合成策略僅用九步高效完成了對 a和b 的首次不對稱合成,總產率高達11%. 其中關鍵步驟包括:利用課題組自主研發(fā)的手性為配體的鈀催化不對稱去芳構環(huán)化-動力學拆分串聯高效構建含手性季碳多環(huán)結構
、大位阻stille偶聯
、ddq氧化高效構筑分子不飽和度以及一鍋法炔烴水解加成環(huán)化。此項研究成果將積極推動新型免疫抑制劑的研究和發(fā)展

該研究工作得到國家自然科學基金委

、中科院戰(zhàn)略性先導科技專項、中科院和生命有機國家重點實驗室的大力資助

動物毒素結構與功能
、抗菌肽與生物天然免疫
、抗蟲生物與抗蟲基因資源開發(fā)等方向的研究進展和發(fā)展趨勢

由動物體產生的、極少量即可引起中毒的物質


動物毒素大多是有毒動物毒腺制造的并以毒液形式注入其他動物體內的蛋白類化合物
,如蛇毒、蜂毒
、蝎毒
、蜘蛛毒、蜈蚣毒、蟻毒
、河豚毒
、章魚毒、沙蠶毒等以及由海洋動物產生的扇貝毒素
、石房蛤毒素
、海兔毒素等。毒液中還會有多種酶

根據毒素的生物效應
,動物毒素可分為神經毒素、細胞毒素
、心臟毒素
、出血毒素、溶血毒素
、肌肉毒素或壞死毒素等

不同動物所制造的毒素種類和生物效應均不相同,如蜂毒主要是神經毒素
、溶血毒素和酶
;蝎毒含神經毒素和酶;蜘蛛毒素含10多種蛋白
、壞死毒素和酶
;蛇毒所含毒素類型因蛇的種、屬不同而有很大差異
。動物毒素對人與動物有毒害作用
,但也有一定藥用價值。是農藥開發(fā)的潛在資源
。根據沙蠶毒的化學結構
,已合成出類似物殺蟲劑殺螟丹、殺蟲雙
、殺蟲環(huán)等
,并已大量生產應用。

抗菌肽原指昆蟲體內經誘導而產生的一類分子量在4KD左右
,具有抗菌活性的堿性多肽物質
。最初,人們在研究北美天蠶的免疫機制時
,發(fā)現其滯育蛹經外界刺激誘導后
,其血淋巴中產生了具有抑菌作用的多肽物質,這類抗菌多肽被命名為天蠶素(Cecropins)
。后來
,從其他昆蟲以及兩棲類動物
、哺乳動物中,也分離到結構相似的抗菌多肽
。迄今為止
,在不同動物組織中已發(fā)現了很多具有抗菌作用的蛋白質和多肽,已有70多種抗菌多肽的結構被測定
,抗菌肽的概念得到了極大的擴展

根據抗菌肽的結構,可將其分為5類:(1)單鏈無半胱氨酸殘基的α-螺旋
,或由無規(guī)卷曲連接的兩段α-螺旋組成的肽;(2)富含某些氨基酸殘基但不含半胱氨酸殘基的抗菌肽
;(3)含1個二硫鍵的抗菌多肽
;(4)有2個或2個以上二硫鍵、具有β-折疊結構的抗菌肽
;(5)由其它已知功能的較大的多肽衍生而來的具有抗菌活性的肽
。其中最早分離到的Cecropins和從非洲爪蟾中分離到的Magainins等屬于第一類抗菌肽,通常也將其稱為Cecropin類抗菌肽
,目前對此類抗菌肽的研究也較深入

抗菌肽的生物學效應
抗菌肽具有廣譜抗菌活性,對細菌有很強的殺傷作用
,尤其是其對某些耐藥性病原菌的殺滅作用更引起了人們的重視

除此之外,人們還發(fā)現
,某些抗菌肽對部分病毒
、真菌、原蟲和癌細胞等有殺滅作用
,甚至能提高免疫力
、加速傷口愈合過程。
抗菌肽的廣泛的生物學活性顯示了其在醫(yī)學上良好的應用前景

抗菌肽的作用機制
自從發(fā)現抗菌肽以來
,已對抗菌肽的作用機理進行了大量研究。目前已知的是
,抗菌肽是通過作用于細菌細胞膜而起作用的
,在此基礎上,提出了多種抗菌肽與細胞膜作用的模型
。但嚴格地說
,抗菌肽以何種機制殺死細菌至今還沒有完全弄清楚。
目前一般認為,Cecropin類抗菌肽作用于細胞膜
,在膜上形成跨膜的離子通道
,破壞了膜的完整性
,造成細胞內容物泄漏,從而殺死細胞

對于抗菌肽破壞膜的完整性
,使細胞內外屏障喪失,從而殺死細菌這一觀點已得到基本統一的認識
,但對其具體作用過程
、是否存在特異性的膜受體、有無其它因子協同等問題尚不十分清楚
,存在不同看法
。不同抗菌肽的作用機制可能不一樣,尚有待進一步研究
抗菌肽基因工程
抗菌肽在動物體內含量極微
。從動物體內提取抗菌肽產量低
、費時長、工藝復雜
、費用昂貴
,無法實現大規(guī)模生產,這成為制約抗菌肽進入實際應用的最大障礙
。因此
,開展抗菌肽基因工程研究具有重要意義。
目前
,已進入臨床應用的基因工程藥物多數是采用原核表達系統生產的
,但由于抗菌肽對細菌的殺傷作用,不能用原核表達系統直接表達具有生物活性的抗菌肽
,而如果采用融合蛋白的形式表達
,將給表達產物的后處理帶來很大麻煩。因此
,國內外的研究者多采用真核表達系統進行抗菌肽基因工程研究

近年來,以酵母為基因工程受體菌的研究引起人們的重視
,酵母具有比大腸桿菌更完備的基因表達調控機制和對表達產物的加工修飾及分泌能力
,并且不會產生內毒素,是基因工程中良好的真核基因受體菌
。自1978年Hinnen等首先試驗酵母轉化成功后
,已有人干擾素基因、乙型肝炎表面抗原基因
、α-淀粉酶基因等數十種外源基因在酵母中獲得表達
。國內研究者大量研究表明,利用酵母表達抗菌肽是一條可行的道路
,如能在表達產率上得到進一步提高
,將為抗菌肽早日進入臨床應用奠定良好的基礎

一、概述
抗菌肽是生物體內經誘導產生的一種具有生物活性的小分子多肽
,分子量在2000~7000左右
,由20~60個氨基酸殘基組成。這類活性多肽多數具有強堿性
、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點
。世界上第一個被發(fā)現的抗菌隊是1980年由瑞典科學家G.Boman等人經注射陰溝通桿菌及大腸桿菌誘導惜古比天蠶蛹產生的具有抗菌活性的多肽,定名為Cecropins
。此后數年間
,人們相繼從細菌、真菌
、兩棲類
、昆蟲、高等植物
、哺乳動物乃至人類中發(fā)現并分離獲得具有抗菌活性的多肽。由于最初人們發(fā)現這類活性多肽對細菌具有廣譜高效殺菌活性
,因而命名為“antibactetial pepiides
,ABP”,中文譯為抗菌肽
,其原意為抗細菌肽
。隨著人們研究工作的深入開展,發(fā)現某些抗細菌肽對部分真菌
、原蟲
、病毒及癌細胞等均具有強有力的殺傷作用,因而對這類活性多肽的命名許多學者傾向于稱之為”peptide antibiotics”一多肽抗生素

、抗菌肽的理化性質、作用機理和作用范圍
天然抗菌肽通常是由30多個氨基酸殘基組成的堿性小分子多肽
,水溶性好
,分子量大約為4000道爾頓左右。大部分抗菌肽具有熱穩(wěn)定性
,在l00℃下加熱10~15min仍能保持其活性
。多數抗菌肽的等電點大于7,表現出較強的陽離子特征
。同時
,抗菌肽對較大的離子強度和較高或較低的pH值均具有較強的抗性。此外
,部分抗菌肽尚具備抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力

抗菌肽功能從目前的研究結果來看
,一般認為抗菌肽殺菌機理主要是作用于細菌的細胞膜,破壞其完整性并產生穿孔現象
,造成細胞內容物溢出胞外而死亡
。首先由靜電吸引而附于細菌膜表面,疏水性的C端插入膜內疏水區(qū)并改變膜的構象
,多個抗菌肽在膜上形成離子通道而導致某些離子的逸出而死亡
。亦有學者認為抗菌肽作用于膜蛋白引起凝聚、失活及離子通道
,引起膜滲透性改變而導致死亡
,亦有學者提出抗菌肽是否存在特異性的膜受休及有無其它因子的協同作用等問題。不同類別的抗菌肽的作用機理可能不一樣

抗菌肽多數具有強堿性
、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點。某些抗菌肽對部分真菌
、原蟲
、病毒及癌細胞等均具有強有力的殺傷作用。
1. 抗菌肽對細菌的殺傷作用
抗菌肽對革蘭氏陰性及陽性細菌均有高效廣譜的殺傷作用
。國內外已報道至少有113種以上的不同細菌均能被抗菌肽所殺滅

2.抗菌肽對真菌的殺傷作用
最先發(fā)現具有抗真菌作用的抗菌肽是從兩棲動物蛙的皮膚中分離到的蛙皮素(Magainins),它不僅作用于C+
、C-
,對真菌及原蟲亦有殺傷作用。Defensins是一種動物細胞內源性殺菌多肽
,是從吞噬細胞中分離出來的
,具有很寬的抗菌譜,對G+的殺傷作用大于對G-的殺傷作用
,它也作用于真菌和部分真核細胞
。Cecropin A及其類似物如天蠶素——蜂毒素雜合肽對感染昆蟲的真菌具有一定的殺傷作用。
3.抗菌肽對原蟲的殺傷作用
抗菌肽Magainins對原蟲有殺傷作用
。實驗證明抗菌肽可以殺死草履蟲
、變形蟲和四膜蟲。柞蠶抗菌肽D對陰道毛滴蟲亦有殺傷作用

4. 抗菌肽對病毒的殺傷作用
Melitiin和Cecropins在亞毒性濃度下通過阻遏基因表達來抑制HIV-1病毒的增殖
。Magainin-2及合成肽Modelin1 和Moderln-5對皰疹病毒HSV-1和HSV-2有一定的抑制效果。這些肽對病毒被膜直接起作用
,而不是抑制病毒DNA的復制或基因表達

5.抗菌肽對癌細胞的殺傷作用
抗菌肽對正常哺乳動物細胞及昆蟲細胞無不良影響,但對癌細胞株則有明顯殺傷作用
。這種選擇性機理可能與細胞骨架有關
。已有有關抗菌肽對宮頸癌細胞
、直腸癌細胞及肝癌細胞的殺傷作用與劑量相關的效應的報道。
、抗菌肽的發(fā)展現狀
迄今為止
,從不同的生物體內誘導分離獲得的抗菌肽已不下200多種,僅從昆蟲中分離獲得的就多達170余種
。人們根據抗菌肽的來源及結構性質進行了分類
。根據抗菌肽的結構,可將其分為5類
1.具有螺旋結構的線性多肽 cecropins是第一個被發(fā)現的動物抗菌肽
,1980年
,由Boman等從美國天蠶蛹中分離得到。該類多肽抗生素一般含有37~39個氨基酸殘基
,不含半胱氨酸
,其N端區(qū)域具有強堿性,可形成近乎完美的雙親螺旋結構
,而在C端區(qū)域可形成疏水螺旋
,兩者之間有甘氨酸和脯氨酸形成的鉸鏈區(qū),多數多肽的C端被酰胺化
,酰胺化對其抗菌活性具有重要作用
。此后,人們相繼從家蠶
、柞蠶、果蠅
、麻蠅中分離到了cecropins類抗菌肽
。1989年,Lee等人從豬小腸中分高到了cecropin P1
,說明了cecropins可能在動物中廣泛存在
。cecropins對革蘭陽性菌、陰性菌部具有很強的殺傷力
,而對真菌和真核細胞沒有毒性
。目前cecropins已被人工合成并已商品化。
magainins也是較早發(fā)現的一類具有雙親螺旋結構的抗菌肽
。最初是從蟾蜍的皮膚中分離得到的
,后來在哺乳動物的神經組織和腸組織中發(fā)現了其類似物。magainins對革蘭陽性菌
、陰性菌
、真菌、原生動物都有殺傷作用
,但是對革蘭陰性菌的活性比cecropins要低10倍左右

此外
,從一些動物的再生性器官和兩棲類的多種組織器官中分離得到了一些具有螺旋結構的多肽,如來源于南美蛙的dermaseptin和來源于樹蛙的bombininh

2.富含某種氨基酸的線性多肽 apidaecins是從蜜蜂中分離得到的富含脯氨酸的多肽抗生素
,一般含有16~18個氨基酸殘基,其中脯氨酸含量高達33%
,精氨酸含量可達17%
。apidaecins對某些革蘭陰性菌具有很強的活性,而對革蘭陽性菌不起作用
。apidaecins對某些革蘭陰性的植物病原菌和腸桿菌科的致病菌的高殺傷力
,使其在植物抗細菌病基因工程和食品工業(yè)中有著很好的應用前景。
drosocin是來源于果蠅的一種富含脯氨酸的抗菌肽
,在結構上與apidaecins具有一定的相似性
,但是在其11位的蘇氨酸羥基上連接著一個O-二糖鏈(-N-乙酰半乳糖胺-半乳糖。)
coleoptericin和hemiptericin分別來源于鞘翅目和半翅目昆蟲
,一級結構中富含甘氨酸
,分子量一般較大。Oppenheim等人從人的腮腺和下頜腺分泌物中分離得到了一組富含組氨酸的抗菌肽
,長度在7~38個氨基酸殘基不等
,被稱為histatins。對于引起口腔感染的多種微生物具有活性
。indolicidin是來源于牛中性粒細胞的多肽抗生素
,因其13個氨基酸中含有5個色氨酸而得名
。其C端是酰胺化的
。對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有很強的殺菌活性

3.含有一個二硫鍵的多肽 這是一類數量很少的抗菌肽
,第1個被發(fā)現的這類多肽是bactenecin
,來源于牛中性粒細胞
。其12個氨基酸中含有4個精氨酸
,在其第2位和第11位氨基酸殘基間形成二硫鍵
。bactenecin對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有活性
。這類多肽中還包括一些來源于蛙類皮膚的多肽抗生素
,一般在C端有一個由7個氨基酸形成的“l(fā)oop”和一個長的N端“尾巴”,如brevinin-1,brevinin-2

4.含有兩個或兩個以上二硫鍵的多肽 這類多肽的典型代表是defensins
,最初發(fā)現的α-defensins來源于哺乳動物的組織中,一般含有29~34個氨基酸殘基
,其中6個保守的半胱氨酸形成3個分子內二硫鍵
,此外,其第6位和第15位的精氨酸,第24位的甘氨酸也是保守的
。α-defensins可形成3層的β片層結構
,通過3個二硫鍵和Arg-6與Glu-24之間的鹽橋而被穩(wěn)定。目前
,defensins已被合成并已商品化
。defensins對多種細菌和某些真菌具有殺傷作用,并且對真核細胞有一定的毒性
。defensins對革蘭陽性菌的活性比革蘭陰性菌強
。defenssins的活性比cecropins弱,并且通常在低離子強度下起作用
。 β-defensins比α-defensins大一些
,一般含有38~42個氨基酸殘基。都含有3個二硫鍵和4~8個精氨酸
。昆蟲defensins在C末端與α-defensins相似
,但是只有兩個β片層結構,中間有一段α螺旋起穩(wěn)定作用
,主要對革蘭陽性菌起作用
,而對真菌沒有作用。 植物defensins一般有45~54個氨基酸殘基
,可形成4個二硫鍵
,3個β片層結構和一個α螺旋結構。植物defensins一般只對真菌起作用而對細菌沒有作用
。不同植物defensins對真菌的抗菌譜不同
。 thionins也是一類來源于植物的多肽抗生素,含有45~47個氨基酸殘基
,有6個或8個半胱氨酸形成的3個或4個二硫鍵
。其二級結構可形成2個反平行的α螺旋結構和2個反平行的β片層結構。thionins抑制多種植物致病細菌和真菌
,但是對假單胞菌屬和歐文氏菌屬的細菌不起作用。
5.羊毛硫抗生素 羊毛硫抗生素(1antibiotics)是指一些由細菌產生的
,由基因編碼在核糖體中合成
,經翻譯后加工而含有一些特殊有機基團的多肽抗生素。其中研究最廣泛的是nisin
。它是來源于乳酸菌的一種抗菌肽
,成熟多肽由34個氨基酸組成,含有羊毛硫氨酸
、甲基羊毛硫氨酸等特殊基因
。主要對革蘭陽性菌起作用,而對革蘭陰性菌不起作用,已被廣泛應用作食品保鮮劑
。nisin及其類似物在醫(yī)藥上的應用研究也正在進行

四、抗菌肽在醫(yī)藥工業(yè)的應用及前景
目前
,所有的常規(guī)抗生素都出現了相應的抗藥性致病株系
,致病菌的抗藥性問題已經日益嚴重地威脅著人們的健康。尋找全新類型的抗生素是解決抗藥性問題的一條有效途徑
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?咕囊驗榭咕钚愿撸咕V廣
,種類多
,可供選擇的范圍廣,靶菌株不易產生抗性突變等原因
,而被認為將會在醫(yī)藥工業(yè)上有著廣闊的應用前景
。目前,已有多種多肽抗生素正在進行臨床前的可行性研究
,其中magainins已經進入三期臨床試驗階段
。一些多肽抗生素在醫(yī)藥研究中的進展情況。
現在大多數臨床試驗是用于局部治療
,這種治療應該是安全和有效的
,因為一些毒性更強的多肽和脂多肽,如短桿菌肽S
,多粘菌素B已被用于制造皮膚軟膏
。這些多肽也可用于那些常規(guī)抗生素和常規(guī)療法無效的地方。利用粉劑的方法治療肺部感染是一個很有前途的發(fā)展方向
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?诜幬锟赡軙挥糜谥委熌c道感染,nisin正在進行抗螺旋桿菌的臨床試驗
。至少有兩個公司正在開發(fā)非腸道給藥的治療方法

抗菌肽基因工程在農業(yè)上的應用,主要是用于轉化農作物培育抗病品種
。由于抗菌肽對多種植物病原菌有殺菌活性
,將抗茵膚基因導人植物體內表達可望提高其抗病能力。
抗菌肽基因用于轉化農作物培育抗病品種
,如抗馬鈴薯青枯病
、煙草抗青枯病及水稻抗白葉枯病等已有良好的開端。
抗菌肽對正常哺乳動物細胞無不良影響
,但對癌細胞株
,部分病毒則有明顯殺傷作用
。這預示抗菌肽在治療及預防癌癥和抗病毒方面具有良好的應用前景。
由于某些多肽抗生素對一些植物致病細菌和真菌具有很強的抗性
,一些多肽抗生素已經被用于植物抗病基因工程
。如Jaynes等將兩個cecropin的類似物基因,Shiva-I基因和SB-37基因轉入煙草
,發(fā)現Shiva-I的轉基因煙草對青枯病具有一定的抗性
,而SB-37的轉基因煙草沒有抗性。Huang等的研究表明將cecropin類多肽MB-39基因與大麥
、淀粉酶信號肽基因融合后轉入煙草中
,所得植株野火病的抗性增強。在國內
,黃大年等利用cecropinB基因轉化水稻
,得到了一些對水稻細條病具有不同抗性的植株。
抗菌肽動物轉基因的研究也已經取得了一些進展
,比如可以通過基因工程的方法來阻斷一些蟲媒疾病的傳播
,Possani等的研究表明,在蚊子體內表達Shiva-3可以抑制瘧疾的傳播
,但是在蚊子的轉基因技術方面還存在著一些困難
;Durasu1a等通過在長紅獵蟋的共生菌中表達CecropinA明顯減少了其體內錐蟲的數量。Reed等將Shiva-Ia轉入小鼠中
,轉基因小鼠對布魯氏桿菌的抵抗力顯著增強
,這為人工培育抗病飼養(yǎng)動物新品種提供了新思路。此外
,抗菌肽在食品防腐
,鮮花保鮮和動物飼料添加劑等方面的應用研究也正在進展之中。
、國內抗菌肽研究開發(fā)現狀
華南農業(yè)大學教授黃自然及其研究組從我國特有物種柞蠶蛹中經人工誘導和提取的產物(溶菌酶)--抗菌肽
,是經過十幾年的努力取得的一項首創(chuàng)性科研成果?div id="d48novz" class="flower left">
?咕尼t(yī)藥產品即以生物工程方法將抗菌肽純化為一類新型藥物
。具有廣譜性殺菌作用,并能抑制乙型肝炎病毒的復制
。特別是對耐藥性細菌
,抗菌肽有較強殺滅作用,并能選擇性殺傷腫瘤細胞
,是一種具有作用靶點及新作用機制的化合物。
南開大學
、天津大學和大港油田聯手攻關
,成功地從蒼蠅體內分離出抑制多種病源菌和病毒的抗菌肽。目前多種抑菌實驗已經完成,科研人員正在著手進一步純化從蒼蠅幼蟲體內提取出的抗菌肽

中國科學院上海生化與細胞所張永蓮等人對名為Binlb的鼠源新基因的功能研究取得突破(批準號:39893320)
。該基因只在附睪頭部上皮細胞中特異表達具有抗菌功能的多肽,生育旺期表達最高
。這是目前第一個發(fā)現與附睪防御系統相關的天然抗菌肽
,人體也類似,也是國際上發(fā)現的第一個與男性生殖系統炎癥相關的功能基因
,第一次證實附睪具有免疫系統
。其研究成果:《大鼠生殖系統中的一個抗菌肽基因》,于2001年3月在《Science》上發(fā)表
,是我國生命科學基礎研究成果第一次在《Science》上刊載

中國水稻所黃大年教授主持的蠶抗菌肽B基因轉化水稻的研究,抗菌肽B基因轉化植株表現出對白葉枯病合細條病的抗性有明顯提高,為水稻白葉枯病的抗性育種提供了一條新的途徑.將該基因導入推廣品種,可以獲得農藝性狀保持優(yōu)良.另外,轉基因第二代植株仍然表現對白葉枯病合細條病的抗性

中國農業(yè)科學院生物技術研究中心研究員賈士榮完成了抗菌肽Cecropin B及Shiva A基因的合成
,構建了表達載體,并將這些基因成功地導入我國七個馬鈴薯主栽品種(品系)
,獲得1050個轉基因株系
,經多年多點抗病性鑒定,初步篩選出三個較起始品種抗病的株系。
黃亞東
,鄭青
,王林川,廖富蘋
,黃自然等采用病毒載體pAcGP67B
,通過PCR點突變技術將柞蠶抗菌肽基因起始密碼ATG刪除以利于形成信號肽切除位點的編碼序列。gp67信號肽的插入能引導表達產物分泌到細胞外而便于表達產物的鑒定及其生物活性的測定
,對柞蠶抗菌肽D基因重組桿狀病毒表達載體的構建及其表達

六、總結
抗菌肽要成為藥物
,目前還需要解決一些問題
。首先是來源問題。由于昆蟲抗菌肽的天然資源有限
,化學合成和基因工程便成為獲取抗菌肽的主要手段
。化學合成肽類
,成本較高
。而通過基因工程,在微生物中直接表達抗菌肽基因
,可能造成宿主微生物自殺而不能獲得表達產物
。以融合蛋白的形式表達抗菌肽基因
,雖然可以克服這一缺點,但仍有表達產物少的問題
。盡管來自青蛙皮膚的抗菌肽maganin類作為基因工程藥物已進入臨床II
,III期實驗,但人們認為
,只有每克價格低于10美元
,抗菌肽才可能商品化。因此
,如何提高抗菌肽的生產效率
,降低成本,是應用抗菌肽必須解決的問題
。其次
,與傳統抗生素相比,昆蟲抗菌肽的抗菌活性還不夠理想
。改造已有抗菌肽和設計新抗菌肽分子是創(chuàng)造高活力抗菌肽的有效途徑
。這就需要進一步研究抗菌肽結構與活性的關系和作用機理,為抗菌肽分子的改造和設計提供足夠的理論依據

,你問的范圍太廣了

免疫抑制劑的分類有哪些?

常用的免疫抑制劑主要有五類:

1、糖皮質激素類

,如可的松和強的松

2、微生物代謝產物

,如環(huán)孢菌素和藤霉素等

3、抗代謝物

,如硫唑嘌呤和6-巰基嘌呤等

4、多克隆和單克隆抗淋巴細胞抗體

,如抗淋巴細胞球蛋白和OKT3等

5、烷化劑類

,如環(huán)磷酰胺等

免疫抑制劑能抑制與免疫反應有關細胞的增殖和功能,能降低抗體免疫反應

。 免疫抑制劑主要用于器官移植抗排斥反應和自身免疫病如類風濕性關節(jié)炎
、紅斑狼瘡、皮膚真菌病
、膜腎球腎炎
、炎性腸病和自身免疫性溶血貧血等

擴展資料 常見免疫抑制劑介紹:

1、環(huán)孢菌素

環(huán)孢霉素可以有效地特異性抑制淋巴細胞反應和增生

。對T細胞,尤其是TH細胞有較好的選擇性抑制作用
,而對其他的免疫細胞的抑制作用則相對較弱
,因此在抗器官移植排斥中取得了很好的療效。

2

、他克莫司

他克莫司是從土壤真菌中提取的一種大環(huán)內酯類抗生素

,具有較強的免疫抑制特性,其藥物強度是環(huán)胞霉素A的10-100倍
,預防各種器官移植所出現的排斥反應的效果優(yōu)于環(huán)孢菌素

3、雷帕霉素

雷帕霉素是一種用于固體狀器官移植排斥反應的免疫抑制劑

。雷帕霉素結構與他克莫司相似
,但作用機制不同。雷帕霉素與他克莫司之間的相互作用尚未經深入研究

參考資料來源:百度百科——免疫抑制劑

如何從腫瘤免疫應答的角度設計研究思路?

在抗腫瘤免疫應答過程中

,藥物的療效很大程度上取決于腫瘤特異的效應性免疫細胞的功能狀態(tài)
,而效應細胞的增殖和活性受免疫檢查點共刺激和共抑制信號的共同調節(jié)。因此增加抗腫瘤免疫反應往往是通過 增強作為正向調節(jié)的共刺激信號
,或阻斷負向調節(jié)的抑制信號
。但往往事情沒有我們想的那么簡單,尤其是在異質性很強的腫瘤微環(huán)境中
,各種免疫調控網絡紛繁復雜
,這也就促使我們采用多種免疫檢查點抑制劑聯合治療的方案。

目前發(fā)現具有可用于藥物治療的免疫檢查點分子有很多: PD-1, PD-L1, CTLA4, LAG-3, TIM-3, TIGIT, PVRIG, NKG2A 等
,因為PD-1/PD-L1和CTLA4最早被發(fā)現
,也研究的最多,因此目前抗CTLA-4 與抗 PD-1/PD-L1 聯合策略也被用于多種腫瘤的免疫治療中
。但這種組合方式在很多腫瘤患者中的療效并不顯著
,還具有很強的副作用,因此近些年科學家正不斷研究別的免疫檢查點聯合用藥方式
。其中因 TIM-3 廣泛表達于T細胞
、Tregs、B細胞
、NK細胞
、DCs
、巨噬細胞和肥大細胞等各種免疫細胞,并與 Galectin9
、高遷移率組盒1( HMGB1 )和癌胚抗原相關細胞粘附分子1( CEACAM-1 )結合成為了近幾年基礎和臨床研究工作者的青睞
。此外,TIM-3與PD-1在耗盡的T細胞和TILs上的共表達現象為聯合使用抗PD-1和抗TIM-3提供了一個思路
。并且一些小鼠模型的實驗為這種組合的有效性提供了直接證據
,幾個I期的抗PD-1聯合抗TIM-3的研究已經在晚期和轉移性實體腫瘤中開始施行。

那么接下來我就先通過解讀今年發(fā)表在 Nat Commun (IF:14.91)一篇名為:Galectin-9 interacts with PD-1 and TIM-3 to regulate T cell death and is a target for cancer immunotherapy的文章介紹免疫檢查點分子情侶PD-1/TIM-3以及 Galectin-9 的三角戀故事


1.質譜分析篩選PD-1的結合蛋白

研究者首先通過IP/Western和免疫復合物的質譜分析確定了Galectin-9是PD-1的結合蛋白
,且具有免疫調節(jié)活性。這里可能大家需要想到作者肯定篩選出了很多可以與PD-1結合的蛋白
,然后通過實驗逐一進行功能驗證
,最后發(fā)現Galectin-9蛋白具有較好的表型,因此后續(xù)都對這個蛋白進行分析
。 類比這樣的方法我們還可以篩選與自己研究基因相結合的蛋白
,從而縮小靶基因的范圍。 后續(xù)實驗證明了Galectin-9與PD-1的結合是高度選擇性的
,并且是由多糖介導的
,它不影響PD-1與其同源配體PD-L1的結合,也不影響PD-1和治療性抗體Pembrolizumab和nivolumab的結合


Galectin-9主要有兩個CRD ( N-CRD
,C-CRD )結合位點,研究者發(fā)現Galectin-9主要通過其 C-CRD 與PD-1結合
,而N-CRD和C-CRD均介導其與Tim-3的結合
。為了確定PD-1上與Galectin-9結合的糖基化位點,將PD1上4個可能的糖基化位點(N49
、N58
、N74和N116)上的天冬酰胺(N)殘基分別突變?yōu)楣劝滨0?Q),發(fā)現 N116Q 突變在很大程度上影響了PD-1與Gal-9的結合
,因此Galectin-9/PD-1的相互作用主要由Gal-9的C-CRD和PD-1的N116連接的糖鏈介導


圖1:

2. Galectin-9可與PD-1和TIM-3交聯形成復合物

緊接著研究者通過平板蛋白結合實驗,發(fā)現在沒有Galectin-9的情況下
,PD-1 ECD并不結合TIM-3 ECD
,而Galectin-9促進了它們的協同結合。DuoLink實驗和IP/Western實驗的結果進一步證實了這一點
。但神奇的是
, 在沒有外源Galectin-9的情況下,PD-1/TIM-3相互作用也能被檢測到 ,這種相互作用并不被乳糖或PD-1 N116Q突變所抑制
。這就好比PD-1/TIM-3本來是一對情侶
,只是感情并不是太穩(wěn)定,這時生活中出現了一個和兩人都能處得來的好友Galectin-9
,表面是調節(jié)二者關系
,其實是和其中一人搞曖昧。

圖2:

3. Galectin-9可作為癌癥免疫治療的靶點

通過流式細胞術分析,研究者發(fā)現 Galectin-9誘導的T細胞死亡可能與抗癌免疫抑制有關
,因此研究者評估了抑制Galectin-9在癌癥治療中的潛力
,并推測這可能是由于抑制Galectin-9后T細胞共刺激受損所致。接下來
,通過將抗Galectin-9與 GITR (TNFRSF共刺激受體家族的一個成員)的激動型抗體DTA-1相結合驗證了這一想法,它們的組合在不同的腫瘤模型中協同抑制了腫瘤的生長和延長了總生存期
。因此
,這些結果表明Galectin-9是腫瘤免疫治療的靶點,并且抗Galectin-9聯合GITR激動劑可以誘導出強大的抗腫瘤活性


圖3:

4. 質譜流式證實抗Galectin-9治療針對特定的腫瘤浸潤性T細胞亞群

只有推測
,沒有動物實驗當然是不行的,研究者接下來就在荷瘤小鼠中進行體內實驗
。通過分析幾組質譜流式的結果
,研究者發(fā)現抑制Galectin-9可以選擇性地擴大了瘤內TIM-3+ CD8T和CD4T細胞亞群,這也包括具有免疫抑制性的Treg細胞
, 并且Treg細胞在總CD45+TIL中的比例增加
,特別是CD8T細胞中CD8T_1亞群的比例在抗Galectin-9處理后增加了兩倍以上。由于Treg可以特異性的抑制抗腫瘤免疫
,因此接著通過聯合使用抗Galectin-9和抗GITR(可特異下調Treg)后
,CD8T亞群的比例進一步增加,而Treg細胞幾乎完全喪失
。因此
,抗Galectin-9單一療法雖然擴增了具有效應潛能的CD8T細胞亞群。然而
,它的治療效果可能會因為Treg細胞的共同擴增而受到影響


圖4:

一般情況下,CD8T細胞在腫瘤抗原的不斷刺激下會逐漸失去功能
,變成衰竭前體細胞
。在這個階段的CD8T細胞會高表達TCF1,同時也表達PD-1,TIM-3
,如果腫瘤抗原持續(xù)存在
,CD8T細胞就會走向終末衰竭的T細胞,并且逐漸走向死亡
。但是處在這個終末衰竭性T細胞狀態(tài)前的T細胞可以被抗Galectin-9治療給逆轉成具有較強增殖和分化能力的功能性T細胞
,只不過同時擴增的還有Treg細胞
。因此,聯合使用抗GITR來控制Treg細胞的擴增則解決了這一難題


圖5:

5.單細胞數據揭示Galectin-9的表達分布

其實講到這
,文章的主體研究思路都講完了,但是為了進一步解析Galectin-9在各類免疫細胞的表達情況
,作者還分析了之前發(fā)表的一套單細胞數據
。所以,這也進一步說明了數據挖掘的重要性
。無論是多高級的研究思路
,都是需要大數據作為支撐才變得更有說服力,這個數據可以來源于自己花錢測的
,也可以來自已經發(fā)表的研究
。這里作者就通過數據挖掘發(fā)現Galectin-9(LGALS9)在多種免疫細胞中都有表達,而且發(fā)現與對PD-1治療沒有應答的患者相比
,應答患者表達更高水平的Galectin-9,這也證實了抗Galectin-9和抗PD-1聯合用藥的可能性


圖6:

6.關于免疫應答研究可做的生信思路

好了,上面介紹了如何通過 實驗研究 免疫檢查點分子間的互作關系從而探索影響腫瘤免疫治療應答的因素
,學習了一些實驗設計的研究策略
。然而,為了符合我一貫寫作的氣質
,下面得對應來點別的有深意的生信干貨
。其實作為數據挖掘的熱點,有關腫瘤對免疫治療應答的相關生信思路有很多
,下面主要列舉幾篇今年剛發(fā)表的研究免疫治療應答的文章思路:

圖7:

第一篇解讀的是發(fā)表在Mol Ther Oncolytics(IF:7.20)雜志上篇名為“Single-cell RNA-sequencing analyses identify heterogeneity of CD8 + T cell subpopulations and novel therapy targets in melanoma”的文章
。作者重新分析了已經發(fā)表的黑色素瘤單細胞數據,揭示出來7群CD8 T細胞亞群
,這些亞群具有不一樣的特征
。此外,作者還鑒定出了3個在衰竭性CD8 T細胞上過表達的基因(PMEL, TYRP1和EDNRB)
,它們與患者的不良預后顯著相關
。像這種思路,只要有數據都能很容易的復現一篇
,至于發(fā)到什么樣的雜志上
,就看證實的發(fā)現是否新穎。

圖8:

另一篇發(fā)表在 J Immunother Cancer (IF:13.75)篇名為:CXCL13 shapes immunoactive tumor microenvironment and enhances the efficacy of PD-1 checkpoint blockade in high-grade serous ovarian cancer的文章則是從影響免疫浸潤的趨化因子著手
。這個思路主要是對明星分子在不同癌型中的功能進行探索
,需要通過實驗來進行功能驗證。因為明星分子被研究的很多了,除非做泛癌分析
,否則基本上很難做出太新穎的東西
。但是這類實驗設計很簡單,只需要證明某個明星分子在 特定的癌型 中通過何種方式影響免疫治療反應即可


圖9:

如果覺得明星分子沒有太多研究新意
,當然還可以通過各種生信方法篩選出關鍵基因。接下來一篇發(fā)表在 Oncoimmunology (IF:8.11)的篇名為“YKT6, as a potential predictor of prognosis and immunotherapy response for oral squamous cell carcinoma, is related to cell invasion, metastasis, and CD8+ T cell infiltration”的文章就是先通過 WGCNA 的方法篩選出和免疫抑制相關的基因YKT6
,進行后續(xù)的分析
。對于這種新篩出的之前沒有報道過的基因就比較容易說故事,當然這個思路有一些運氣的成分
,很有可能百費周折篩選出的基因要么沒有很好的功能
,要么就已經被報道。

圖10:

如果你腫瘤免疫的生物學背景知識不強
,也沒有很好的實驗平臺
,那么還有最后一種選擇,那就是萬能膏藥之臨床預測模型
。最后一篇發(fā)表在 Front Immunol (IF:7.56)雜志上,篇名為“9-Gene Signature Correlated With CD8 + T Cell Infiltration Activated by IFN-γ: A Biomarker of Immune Checkpoint Therapy Response in Melanoma”的文章就是通過構建和免疫治療相關的臨床預測模型
。有關臨床預測模型的構建
,現在已經很成熟了,如 LASSO,COX,NMF 等模型都可以套用
。這個思路前提是需要找一個較為新穎切入點
,且最后能被多套數據集驗證出來,那就基本可以發(fā)表一點不錯的SCI文章了


7.小結

本文從研究腫瘤免疫治療應答的這個科學問題著手
,先是通過一篇以實驗為主的研究型文章解讀了如何通過巧妙的實驗設計篩選出有潛力的免疫檢查點分子,隨后分別解讀了一些純生信和生信聯合實驗的文章思路
。有關腫瘤免疫治療問題可以研究的方向有很多
,但是 一般需要先了解研究癌型的免疫治療進展 ,有的問題在一些癌型中已經被研究的很通透
,那就沒有必要再去浪費時間了
,而同樣的科學問題在一些腫瘤中就還是一個未知,那這樣的問題就比較有研究的價值了
。此外
,就像開頭說的因為免疫治療應答與否牽扯的問題主要和免疫細胞的比例有關,而免疫細胞在腫瘤中的占比不高
,因此bulk測出來的高表達基因主要是腫瘤細胞自身的基因
,從這個角度看基于 bulk數據差異分析找出的高表達基因需要用腫瘤細胞系去做實驗驗證 。而單細胞數據就比較利于揭示免疫細胞上表達和免疫治療的基因,但是商品化的10X平臺可測得的基因不多
,我的經驗是先從單細胞數據揭示各種免疫細胞的比例
,找出應答和非應答的差異免疫細胞亞群,從而進一步找出高表達的基因
,最后通過簡單實驗進行免疫細胞的功能驗證就基本都可以發(fā)表一篇不錯的生信文章了


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原代培養(yǎng)在生命科學研究中有什么應用
?其優(yōu)勢是什么

原代培養(yǎng)(primary culture)又名初代培養(yǎng),是從供體取得組織細胞后的首次培養(yǎng)

。其特點是細胞或組織剛離開機體
,生物性狀尚未發(fā)生很大的改變,一定程度上反映了它們在體內的狀態(tài)
,表現出原組織或細胞的特性
。對于藥物實驗研究,原代培養(yǎng)是一種很好的實驗技術
。由于原代培養(yǎng)的組織含有多種細胞成分
,即使生長出同一種類型的細胞,細胞間也存在很大差異
。如果供體不同
,即使組織的類型、部位相同
,個體差別也可以在細胞上反映出來
。因此原代培養(yǎng)細胞的部分生物學特征尚不夠穩(wěn)定,在進行較為嚴格的對比性實驗研究時
,還需先對細胞進行短期傳代
。近年來,原代培養(yǎng)技術已被廣泛應用于中醫(yī)藥研究尤其是中藥研究之中
。1 原代培養(yǎng)技術1.1 組織塊培養(yǎng)法 組織塊培養(yǎng)法即將組織剪切成小塊后接種于培養(yǎng)瓶
,簡便易行且成功率較高。但由于反復剪切和接種過程對組織塊易造成損傷
,因此并不是每個小塊都能長出細胞
。此法適于細胞數量較少的原代培養(yǎng),如牙髓細胞培養(yǎng)等
。1.2 消化培養(yǎng)法 用酶制劑(最常用的是胰蛋白酶)處理組織塊
,除去細胞間質,使細胞相互分離形成單細胞懸液
,大多形成單層細胞生長方式
。本法的優(yōu)點在于單層細胞更易攝取營養(yǎng)及排出代謝產物
,因此生長較快。但操作不慎易于造成污染
,且消化處理須恰到好處
,否則會對細胞產生一定的損傷。隨著實驗技術水平的提高
,目前此方法已被較多地應用于研究之中[1]
。2 原代培養(yǎng)技術在中醫(yī)藥研究中的應用 綜合近十年來的文獻報道,體細胞
、血細胞和腫瘤細胞的原代培養(yǎng)技術較為成熟
,已被應用于中醫(yī)藥的研究之中,尤其是肝細胞和神經細胞的原代培養(yǎng)
,其應用更為廣泛
。2.1 用于中藥藥理學研究 中藥藥理學研究是目前應用原代培養(yǎng)技術最廣泛的領域,被稱為中藥的生物學效應研究
,用以了解中藥的細胞藥理與毒理作用
。與體內整體實驗相比,體外實驗具有簡便迅速
、條件易控制
、藥理靶點與環(huán)節(jié)較為清楚等優(yōu)點。2.1.1 用于藥效學研究 利用原代培養(yǎng)技術研究中藥有效成分和復方的作用效果和機制
,是從分子水平研究藥效的重要手段
。 朱陵群等[2]研究發(fā)現:原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經細胞缺氧、缺糖5 h后再給氧
,可誘導神經細胞凋亡和細胞壞死
,并顯著增加細胞內Ca2+濃度和乳酸脫氫酶的釋放
,且隨再給氧時間的延長而增加
;三七總皂苷能降低神經細胞凋亡及壞死的百分率,降低細胞內Ca2+濃度
,減少乳酸脫氫酶的釋放
,且其作用隨劑量增加而增強。Shih等[3]發(fā)現
,川芎提取物川芎嗪可以保護原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經元線粒體
,減少自由基的產生并幫助清除自由基,從而對紅藻氨酸所致的細胞損傷起到保護作用
。劉曉玲等[4]原代培養(yǎng)大鼠滑膜細胞
,發(fā)現青藤堿可以通過抑制滑膜細胞惡性增殖及白細胞介素6 mRNA基因的表達來阻斷滑膜炎的進程。林愛華等[5]報道
,粉防己堿可以明顯抑制氣道平滑肌細胞的增殖活性
。粉防己堿對組胺激發(fā)的[Ca2+] i升高表現出明顯的抑制效應
,推測粉防己堿抑制培養(yǎng)的氣道平滑肌細胞增殖活性的作用可能是通過阻斷細胞膜Ca2+通道而降低[Ca2+] i實現的。Bickmeyer等[6]研究報道
,粉防己堿可以阻滯原代培養(yǎng)的牛嗜鉻細胞電壓依賴式鈣離子通道
,促進兒茶酚胺釋放,增加細胞內鈣離子的水平
。崔云華等[7]原代培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞
,發(fā)現丹參酸乙可降低活化的以及經丙二醛刺激后的肝星狀細胞內的氧化程度、抑制增殖細胞核抗原的表達量
,在抗氧化和抗增殖作用之間可能存在一定的聯系
。Li等[8]原代培養(yǎng)中腦神經元及神經膠質細胞,發(fā)現雷公藤提取物雷公藤內酯可以對抗脂多糖所致的多巴胺吸收減少和細胞中酪氨酸羥化酶免疫活性的丟失
、抑制小神經膠質細胞的活動和腫瘤壞死因子α及一氧化氮的過度生成
。雷公藤內酯還可保護脂多糖所致的多巴胺能神經元的損傷,其機制可能是抑制小神經膠質細胞的活動
。Kamei等[9]采用原代培養(yǎng)技術培養(yǎng)大鼠脂肪細胞和心肌細胞
,首次證實中藥提取物紫草素在體外實驗中具有胰島素樣作用。Hsu等[10]采用原代培養(yǎng)技術培養(yǎng)嗜中性粒細胞
,發(fā)現靈芝多糖可促進嗜中性粒細胞的移動
,增強蛋白激酶C、絲裂酶原激活蛋白激酶和酪氨酸激酶的活性
,從而增強嗜中性粒細胞的趨化性和吞噬作用
。Wang等[11]報道,從白術中提取的有效成分蒼術酮對原代培養(yǎng)的人白血病單核細胞有一定的細胞毒性
。 萬文成等[12]發(fā)現清開靈能減少谷氨酸所致的原代培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經細胞內乳酸脫氫酶的漏出量
、減輕細胞的形態(tài)學改變,表明清開靈能夠對抗谷氨酸介導的興奮性毒性
,對培養(yǎng)的大鼠皮層腦細胞具有保護作用
。李彧等[13]原代培養(yǎng)大鼠系膜細胞,經脂多糖刺激10 h后
,核轉錄因子-κB的活性達到最高峰
,且最高熒光強度位于細胞核內;大劑量溫脾湯藥物血清可明顯抑制核轉錄因子-κB的活性
;大劑量藥物血清能明顯抑制核轉錄因子-κB抑制劑IκB的降解
。李彤等[14]采用血清藥理學方法及原代培養(yǎng)心肌細胞技術,發(fā)現在通脈湯含藥血清干預下
,缺氧心肌細胞游離鈣離子的濃度明顯下降
,同時細胞膜L型鈣離子通道的表達在缺氧條件下亦明顯下降,表明通脈湯可以減輕缺氧心肌細胞鈣的超負荷
。尤紅等[15]的實驗結果顯示
,一定濃度的復方861(由丹參
、黃芪等十味中藥組成)可以促進體外分離培養(yǎng)的大鼠肝細胞DNA的合成,對肝細胞的凋亡則無明顯影響
。張斌等[16]觀察抗纖復方對大鼠纖維化肝原代培養(yǎng)貯脂細胞自分泌的影響
,結果表明抗纖復方藥物血清能明顯抑制貯脂細胞產生轉化生長因子β1,阻斷肝纖維化時貯脂細胞的自分泌
。Imanishi等[17]采用原代培養(yǎng)技術培養(yǎng)肝星狀細胞
,并用硫代乙酰胺造成肝纖維化模型。結果表明
,茵陳蒿湯主要是通過抑制血小板源生長因子b受體的磷酸化及下行信號傳導通路來抑制DNA的合成與轉錄
,可能是茵陳蒿湯治療肝纖維化的機制。Zhang等[18]原代培養(yǎng)胎鼠皮層神經細胞
,用谷氨酸鹽造成細胞損傷
,使細胞中膽堿酯酶和鏈親合素標記的過氧化物酶活性降低、乳酸脫氫酶釋放增加
。加入清腦益智方藥物血清后
,上述酶的活性可恢復至正常水平,一氧化氮的生成及細胞凋亡亦受到抑制
。2.1.2 用于方劑配伍機制的研究 劉成海等[19]將扶正化瘀319方進行拆方
,各自制備藥物血清并作用于原代培養(yǎng)肝細胞。結果顯示
,各藥物血清對細胞形態(tài)無明顯影響
,對肝細胞白蛋白分泌及其前白蛋白原mRNA表達則有不同程度的促進作用,其中尤以扶正化瘀319方全方的作用最為顯著
。2.2 用于針灸學研究 梁希彬等[20]觀察電針后大鼠中腦腹側部粗提液對體外培養(yǎng)多巴胺能神經元表達數目
、神經元胞體直徑及神經突起長度的影響。實驗證實
,電針后大鼠中腦腹側部粗提液能夠促進多巴胺能神經元胞體的發(fā)育和突起的生長
,但對多巴胺能神經元表達數目則無明顯影響。2.3 用于中醫(yī)證候本質的研究 陳云波等[21]采用血瘀證兔模型血管內皮細胞直接培養(yǎng)以及血瘀證兔模型血清培養(yǎng)血管內皮細胞兩種方法
,建立血瘀證細胞損傷模型
。原代培養(yǎng)的血管內皮細胞出現了病理性損傷及內分泌功能的改變
。此外
,模型組原代細胞培養(yǎng)液中一氧化氮的含量比對照組明顯減少,而內皮素含量則有上升趨勢
。證明實驗建立的細胞損傷模型從功能和結構上能反映血瘀證整體動物模型及部分臨床病人的病理特征
,可用于血瘀證實質和活血化瘀作用機制的研究。3 原代培養(yǎng)技術應用于中醫(yī)藥研究存在的問題及前景3.1 加強相關的基礎研究 原代培養(yǎng)經首次傳代成功即成細胞系
,通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的具有特殊性質或標志的培養(yǎng)物稱為細胞株
。各種已被命名和經過細胞生物學鑒定的細胞系或細胞株
,都是一些形態(tài)比較均一、生長增殖比較穩(wěn)定
、生物性狀較為明確的細胞群
。細胞系分裂繁殖過程中形成單層有利于培養(yǎng),細胞亦可凍存
,以備以后的培養(yǎng)
。一般來說,細胞系優(yōu)于原代培養(yǎng)
。細胞系在中醫(yī)藥研究中已被廣泛應用
,如各種腫瘤細胞、肝星狀細胞系
、巨嗜細胞系
、經乙肝病毒基因轉染的肝細胞等,主要用于中藥的藥效學研究
。但畢竟還有許多細胞尚無法獲得細胞系(株)
,尤其在現階段的中國,穩(wěn)定的細胞系
、細胞株不易獲得
,原代培養(yǎng)細胞至少提供了體外細胞水平實驗的工具。因此
,須加強細胞培養(yǎng)的基礎研究
,將更多的細胞系(株)應用于中醫(yī)藥研究領域,使中醫(yī)藥研究在細胞水平上有所提高
。 目前
,國內外已有許多取材于人的細胞培養(yǎng)研究,其細胞多取材于器官捐獻者
。國內在此方面的研究工作開展較少
,在中醫(yī)藥領域中的研究才剛剛開始。由于存在倫理學等方面因素的制約
,其應用范圍仍然較窄
,目前主要用于一些比較容易獲得的細胞,如子宮內膜細胞
、人牙髓細胞
、角質細胞(來源于手術切除的包皮)、血細胞及血管內皮細胞(來源于臍帶)等
,還有一些來源于手術切除的細胞
,如腫瘤細胞及腹主動脈瘤血管平滑肌細胞等。 細胞培養(yǎng)技術研究中藥時的一個關鍵技術是中藥的給藥方法
,關于這方面的基礎研究正日益受到重視
。目前在中藥藥效學研究中主要存在兩種給藥方式:(1)直接添加法
。將中藥復方以水煎醇提等方法進行粗提,直接添加于培養(yǎng)體系
,或將粗提物冷凍干燥
,再用培養(yǎng)液稀釋后添加于培養(yǎng)體系。該方法簡便
,但易受制劑的雜質
、pH值、滲透壓
、電解質等因素影響
。國內外相關研究中已有使用中藥有效成分進行直接添加的實驗報道。(2)間接添加法(血清藥理學方法)
。給予動物復方灌胃給藥
,收集服藥后的動物血清,將含藥血清添加于培養(yǎng)細胞
。該法避免了體外用藥的一些干擾因素
,但起步較晚,尚有待進一步完善
。3.2 用于中醫(yī)理論的研究 細胞培養(yǎng)技術在中醫(yī)藥研究中主要用于中藥尤其是藥效學的研究
,并已取得不少成果。迄今為止
,研究目的多限于驗證臨床有效復方或探索其可能的作用機制
,但這顯然是不夠的。應充分發(fā)揮體外實驗的優(yōu)勢
,深入研究中藥復方在組方
、劑量、辨證論治上的奧妙
,進而推陳出新
,給臨床以啟示或指導[22],這對于開發(fā)中藥
、推進中醫(yī)藥走向世界有重要意義
。 此外,運用細胞培養(yǎng)技術闡明中醫(yī)理論的實質亦是值得探索的領域
。如吳正正等[23]提出中醫(yī)“證”(虛證和部分實證)的本質是細胞內基因誘生性表達的細胞因子
。中醫(yī)“證”發(fā)生的分子機制是由于細胞因子網絡自穩(wěn)態(tài)平衡破壞的結果。陰虛證的本質可能是由于白細胞介素1和腫瘤壞死因子基因表達增強
、生物學活性相對升高
,引起細胞因子網絡自穩(wěn)態(tài)平衡失調的結果?div id="jfovm50" class="index-wrap">,F已有一些研究證候實質的實驗
,如血瘀證血管內皮細胞病理模型的建立及其相關研究
。鄭愛華等[24]探討了肝郁證、脾虛證模型動物干擾素γ及白細胞介素4 mRNA表達的變化
。由于傳統中醫(yī)理論比較重視整體而忽視微觀的原因
,因而從細胞、分子水平來研究中醫(yī)基礎理論的工作目前還相對較少
,利用細胞培養(yǎng)技術深入進行這方面的研究
,可以促進中醫(yī)基礎理論研究的進一步發(fā)展。

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,甚至抑郁等消極情緒
,而剛剛過去的情人節(jié),成為單身們焦慮的高發(fā)期
芹菜與黃瓜同食好嗎
芹菜與黃瓜同食好嗎芹菜不宜與黃瓜一同食用
,這是因為黃瓜中含有維生素C分解酶,這種物質會導致芹菜的營養(yǎng)價值降低
老人健康飲食的10大要點
食要早早就是到了飯點得吃飯
。另外,從中醫(yī)的角度講
,上午7點~9點是胃經當令的時候
,所以早飯最好安排在這個時間。中醫(yī)還說“胃不和則臥不安”
,因此晚飯也盡量早吃
白帶常規(guī)能檢查出什么,白帶常規(guī)檢查的注意事項
一、白帶常規(guī)能檢查出什么問題檢查目的:白帶是陰道黏膜滲出物
、宮頸管及子宮內膜腺體分泌物等混合組成
,其形成與雌激素的作用有關。用于檢查陰道內有無滴蟲
、念珠菌
無氧運動是什么,有哪些好處(無氧運動的有什么好處)
無氧運動是什么,有哪些好處無氧運動是運動的一種方式,我們比較常見的就是有氧運動
,有氧運動要比較無氧運動更有利于健康
寶寶睡覺時驚厥的癥狀,如何預防小兒驚厥
一、寶寶睡覺時驚厥的癥狀有哪些癥狀一:嬰兒在剛入睡時或即將醒時滿頭大汗
。專家提醒:可以說大多數嬰兒夜間出汗都是正常的
。但如果大汗淋漓,并伴有其他不適的表現
,就要注意觀察
,加強護理
榆錢怎么吃,春天嘗鮮就吃榆錢
春季嘗鮮吃榆錢雖然榆錢寓意著富余
癌痛到底是陣痛還是持續(xù)痛
?如何才能緩解
?一文科普,不妨看看
癌痛指的是癌性疼痛
,是由于患上各種癌癥,引起了神經受壓等問題
,從而使患者產生的疼痛現象
。有很多人認為,癌痛屬于陣發(fā)性的疼痛
,只要適當服用藥物就能夠起到快速止痛的作用
。但有不少人認為,癌痛屬于劇烈且持續(xù)性的疼痛 !.png" alt="癌痛到底是陣痛還是持續(xù)痛
?如何才能緩解?一文科普,不妨看看
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