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杜亞楠教授:3D微組織陣列實(shí)現(xiàn)高通量精準(zhǔn)藥物篩選和評(píng)估(高通量藥物篩選的簡(jiǎn)介)

佚名 2024-05-19 11:53:38

杜亞楠教授:3D微組織陣列實(shí)現(xiàn)高通量精準(zhǔn)藥物篩選和評(píng)估

3月3日

,由生物谷主辦的“2017疾病特異性模型研究及應(yīng)用研討會(huì)”在上海隆重召開(kāi)
。清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究員
,長(zhǎng)聘副教授
、博士生導(dǎo)師杜亞楠教授以“3D微組織陣列實(shí)現(xiàn)高通量精準(zhǔn)藥物篩選和評(píng)估”為題為我們介紹了3D微組織模型及在藥物篩選中的應(yīng)用

杜亞楠教授2007年畢業(yè)于新加坡國(guó)立大學(xué)生物工程系并獲該專業(yè)博士學(xué)位。2007年至2010年于美國(guó)麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)進(jìn)行博士后研究

。2010年9月起受聘于清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系
。國(guó)家自然科學(xué)基金委優(yōu)秀青年基金獲得者
。于2014年獲得皇家化學(xué)學(xué)會(huì)lab on chip期刊評(píng)選的新興研究者稱號(hào),并獲得清華大學(xué)學(xué)術(shù)新人獎(jiǎng)
。他整合生物材料
、細(xì)胞/組織工程和微納技術(shù)等領(lǐng)域形成了微組織工程這一獨(dú)具特色的交叉研究方向。

杜教授在報(bào)告中分享了其在3D培養(yǎng)研究成果

,他們應(yīng)用微納加工技術(shù)結(jié)合生物材料和細(xì)胞生物學(xué)構(gòu)建精確可控
、具有仿生結(jié)構(gòu)和功能的3D微尺度組織,可為藥物的高通量篩選
、臨床精準(zhǔn)用藥
、3D細(xì)胞基礎(chǔ)研究提供新型工程手段和解決方法。比如在384微孔板制備了3D微組織陣列
,可以高通量篩查藥物活性
,并且創(chuàng)新性地提出細(xì)胞收縮率的表型指標(biāo),進(jìn)而篩查了上百種藥物驗(yàn)證其可行性
;并以此為篩選模型
,考察了臨床聯(lián)合用藥及腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療,相關(guān)研究成果也發(fā)表在PNAS
, Advanced Materials
, biomaterials 等國(guó)際知名雜志上。

高通量藥物篩選的簡(jiǎn)介

1. 化合物樣品庫(kù)
化合物樣品主要有人工合成和從天然產(chǎn)物中分離純化兩個(gè)來(lái)源

。其中,人工合成又可常規(guī)化學(xué)合成和組合化學(xué)合成兩種方法

2.自動(dòng)化的操作系統(tǒng)
自動(dòng)化操作系統(tǒng)利用計(jì)算機(jī)通過(guò)操作軟件控制整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程。操作軟件采用實(shí)物圖像代表實(shí)驗(yàn)用具
,簡(jiǎn)潔明了的圖示代表機(jī)器的動(dòng)作
。自動(dòng)化操作系統(tǒng)的工作能力取決于系統(tǒng)的組分,根據(jù)需要可配置加樣
、沖洗
、溫解、離心等設(shè)備以進(jìn)行相應(yīng)的工作

3.高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)
檢測(cè)系統(tǒng)一般采用液閃計(jì)數(shù)器
、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)計(jì)數(shù)器、寬譜帶分光光度儀
、熒光光度儀等。
4.數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)
數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)承擔(dān)4個(gè)方面的功能: 樣品庫(kù)的管理功能;生物活性信息的管理功能; 對(duì)高通量藥物篩選的服務(wù)功能; 藥物設(shè)計(jì)與藥物發(fā)現(xiàn)功能
。 常用的篩選模型都在分子水平和細(xì)胞水平
,觀察的是藥物與分子靶點(diǎn)的相互作用,能夠直接認(rèn)識(shí)藥物的基本作用機(jī)制

1.分子水平的藥物篩選模型:受體篩選模型;酶篩選模型;離子通道篩選模型
1.1受體篩選模型:指受體與放射性配體結(jié)合模型
。以受體為作用靶的篩選方法,包括檢測(cè)功能反應(yīng)
、第二信使生成和標(biāo)記配體與受體相互作用等不同類(lèi)型。
1.2酶篩選模型:觀察藥物對(duì)酶活性的影響
。根據(jù)酶的特點(diǎn),酶的反應(yīng)底物,產(chǎn)物都可以作為檢測(cè)指標(biāo),并由此確定反應(yīng)速度。典型的酶篩選包括1) 適當(dāng)緩沖液中孵化;(2)控制反應(yīng)速度,如:溫度,緩沖液的pH值和酶的濃度等;(3)單時(shí)間點(diǎn)數(shù)器, 需測(cè)量產(chǎn)物的增加和底物的減少。
1.3離子通道篩選模型: (1)貝類(lèi)動(dòng)物毒素的高通量篩選,其作用靶為Na+通道上的蛤蚌毒素結(jié)合位點(diǎn)
,用放射性配體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)考察受試樣品
。(2)用酵母雙雜交的方法高通量篩選干擾N型鈣通道β3亞單位與α1β亞單位相互作用的小分子,尋找新型鈣通道拮抗劑

2.細(xì)胞水平藥物篩選模型
觀察被篩樣品對(duì)細(xì)胞的作用,但不能反映藥物作用的具體途徑和靶標(biāo),僅反映藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)等過(guò)程的綜合作用
。包括: 內(nèi)皮細(xì)胞激活; 細(xì)胞凋亡; 抗腫瘤活性; 轉(zhuǎn)錄調(diào)控檢測(cè); 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路; 細(xì)菌蛋白分泌; 細(xì)菌生長(zhǎng)。
高通量篩選技術(shù)與傳統(tǒng)的藥物篩選方法相比有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):反應(yīng)體積?div id="4qifd00" class="flower right">
?div id="4qifd00" class="flower right">
;自動(dòng)化;靈敏快速檢測(cè)
;高度特異性
。但是,高通量篩選作為藥物篩選的方法,并不是一種萬(wàn)能的手段
,首先
,高通量篩選所采用的主要是分子、細(xì)胞水平的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)P?div id="m50uktp" class="box-center"> ,任何模型都不可能充分反映藥物的全面藥理作用
;其次,用于高通量篩選的模型是有限的和不斷發(fā)展的
,要建立反映機(jī)體全部生理機(jī)能的理想模型
,也是不現(xiàn)實(shí)的。但我們應(yīng)該相信
,隨著對(duì)高通量篩選研究的深入
,隨著對(duì)篩選模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)、新的藥物作用靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)以及篩選模型的新穎性和實(shí)用性的統(tǒng)一
,高通量篩選技術(shù)必將在未來(lái)的藥物研究中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用
。 光學(xué)測(cè)定技術(shù)。美
、英兩國(guó)研究人員在高通量篩選檢測(cè)中
,努力進(jìn)行了光學(xué)測(cè)定方法的研究,建立了大量的非同位素標(biāo)記測(cè)定法
,如用分光光度檢測(cè)法篩選蛋白酪氨酸激酶抑制劑
、組織纖溶酶原激活劑等,均獲得成功

放射性檢測(cè)技術(shù)
。美國(guó)學(xué)者GanieSM在高通量藥物篩選研究中
,應(yīng)用放射性測(cè)定法,特別是親和閃爍(SPA)檢測(cè)方法
,使在96孔板上進(jìn)行的樣本量實(shí)驗(yàn)得到發(fā)展
。該方法靈敏度高,特異性強(qiáng)
,促進(jìn)了高通量藥物篩選的實(shí)現(xiàn)
,但存在環(huán)境污染問(wèn)題。
熒光檢測(cè)技術(shù)
。美國(guó)學(xué)者GiulianokA研究認(rèn)為
,采用FLIPR(fluor ometricimaging readet)熒光檢測(cè)法,可在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)測(cè)定熒光的強(qiáng)度和變化
,對(duì)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子流及測(cè)定細(xì)胞內(nèi)pH和細(xì)胞內(nèi)鈉離子流等
,是非常理想的一種高效檢測(cè)方法

多功能微板檢測(cè)系統(tǒng)。由西安交通大學(xué)藥學(xué)院研制的1536孔板高通量多功能微板檢測(cè)系統(tǒng)
,是國(guó)際上先進(jìn)的高通量檢測(cè)系統(tǒng)
,它可使篩選量進(jìn)一步提高
,現(xiàn)已在該院投入使用。
1.基本原理
高通量藥物篩選技術(shù)是將多種技術(shù)方法有機(jī)結(jié)合而形成的新的技術(shù)體系
,它以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)
,以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體
,以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過(guò)程,以靈敏快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
,以計(jì)算機(jī)對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理
。它的正常開(kāi)展需要有一個(gè)高容量的化合物庫(kù)
、自動(dòng)化的操作系統(tǒng)、高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)
、高效率的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)以及高特異性的藥物篩選模型

1.1 化合物樣品庫(kù)
高通量篩選是一種利用已有的化合物進(jìn)行的體外隨機(jī)篩選
。因此通過(guò)高通量藥物篩選發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物(leading compounds)的有效性取決于化合物樣品庫(kù)中化合物的數(shù)量及其質(zhì)量?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">;衔飿悠返臄?shù)量是指不同樣品的數(shù)量
?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">;衔飿悠返馁|(zhì)量主要由化合物結(jié)構(gòu)的多樣性決定的
。許多活性反應(yīng)基團(tuán)(reactive groups)使初篩的假陽(yáng)性大量增加
,剔除這些化合物可以提高化合物樣品庫(kù)的質(zhì)量

化合物樣品主要有人工合成和從天然產(chǎn)物中分離純化兩個(gè)來(lái)源

人工合成又可分為常規(guī)化學(xué)合成和組合化學(xué)合成兩種方法
。采用常規(guī)化學(xué)合成的純化合物一直是國(guó)外制藥企業(yè)建立化合物樣品庫(kù)的主要來(lái)源。它們通過(guò)長(zhǎng)年積累的化合物建立化合物樣品庫(kù)
,通過(guò)購(gòu)買(mǎi)和化合物交流使化合物樣品庫(kù)的數(shù)量和質(zhì)量大幅度提高

組合化學(xué)(combinatorial chemistry)的出現(xiàn)為大量增加化合物的數(shù)量提供另外一種來(lái)源。組合化學(xué)的基本原理是采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法
,在特定的分子母核上加入不同的基團(tuán)
,在同樣條件下
,產(chǎn)生大量的新化合物
。這種方法在化合物的結(jié)構(gòu)改造和優(yōu)化方面已經(jīng)表現(xiàn)出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。但是
,由于該方法是基于母核結(jié)構(gòu)的改造
,因此產(chǎn)生的大量化合物在結(jié)構(gòu)多樣性方面尚有極大的不足。解決組合化學(xué)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)多樣性的問(wèn)題
,已經(jīng)成為化學(xué)研究人員的研究課題

從天然產(chǎn)物中分離出來(lái)的化合物
,母核結(jié)構(gòu)和活性基團(tuán)是長(zhǎng)期的自然選擇形成的
,它們通過(guò)高通量篩選所表現(xiàn)出來(lái)的生物活性在藥物發(fā)現(xiàn)中具有人工合成化合物所不能比擬的優(yōu)勢(shì)。因此
,增加樣品庫(kù)中具結(jié)構(gòu)多樣性的天然化合物及其衍生物是提高樣品庫(kù)質(zhì)量的一個(gè)重要途徑
。跨國(guó)制藥企業(yè)為了增加高通量篩選的陽(yáng)性率
,已經(jīng)或正在尋求助買(mǎi)我國(guó)的天然產(chǎn)物單體

1.2 自動(dòng)操作系統(tǒng)
高通量藥物篩選每天要對(duì)數(shù)千化臺(tái)物樣品進(jìn)行檢測(cè)
,工作枯燥
、步驟單一
,人工操作容易疲勞、出錯(cuò)。自動(dòng)化操作系統(tǒng)采用微孔板作為反應(yīng)容器
,具有固定的分布模式(format)
;不同的微孔板通過(guò)條形碼加以標(biāo)記
。自動(dòng)化操作系統(tǒng)通過(guò)光電閱讀器對(duì)特定的微孔板上的特定位置進(jìn)行操作
,并將操作結(jié)果及相關(guān)數(shù)據(jù)存貯在計(jì)算機(jī)內(nèi),使篩選結(jié)果準(zhǔn)確
,實(shí)驗(yàn)過(guò)程快速

自動(dòng)化操作系統(tǒng)編程過(guò)程簡(jiǎn)潔明了,可操作性強(qiáng)
。自動(dòng)化操作系統(tǒng)的工作能力取決于系統(tǒng)的組成都分,根據(jù)需要可配置加樣
、沖洗
、溫解
、離心等設(shè)備以進(jìn)行相應(yīng)的工作

除了實(shí)驗(yàn)步驟的需要以外,自動(dòng)化的加樣方式是決定篩選速度的重要因素
。主要有單孔
、8孔
、96孔、384孔等幾種方式
。單孔一般用于對(duì)照樣品以及復(fù)篩中零散樣品的轉(zhuǎn)移
。96孔、384孔在酶活性檢測(cè)以及需同時(shí)開(kāi)始
、同時(shí)終止反應(yīng)的篩選模型中是必需的

自動(dòng)化操作系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分是堆棧(hotel)。所謂堆棧是指在操作過(guò)程中用來(lái)放置樣品板
、反應(yīng)板以及對(duì)它們進(jìn)行轉(zhuǎn)移所需的騰挪空間
。因此,高通量篩選的樣品數(shù)量取決于堆棧的容量。
由此可見(jiàn)
,高通量藥物篩選的自動(dòng)化操作系統(tǒng)由計(jì)算機(jī)及其操作軟件、自動(dòng)化加樣設(shè)備
、溫孵離心等設(shè)備、堆棧4個(gè)部分組成。不同的單位可根據(jù)主要篩選模型類(lèi)型
、篩選規(guī)模選購(gòu)不同的部分整合成為一個(gè)完整的操作系統(tǒng)

1.3 檢測(cè)系統(tǒng)
快速、高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)是高通量藥物篩選的關(guān)鍵技術(shù)之一
。檢測(cè)儀器靈敏度的不斷提高
,即使對(duì)微量樣品的檢測(cè)
,也可以得到很好的檢測(cè)效果

1.3.1 液閃計(jì)數(shù) 放射性同位素廣泛用于受體結(jié)合測(cè)定
、細(xì)胞毒性
、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、藥物代謝示蹤以及基因分析中
。由于采用了雙光電倍增管及時(shí)間分辨偶合回路(time-resolved coincidence circuit)技術(shù),有效地降低了背景信號(hào)的干擾
,使測(cè)定靈敏度提高
,同位素用量少
。在96孔板的分析檢測(cè)中
,背景信號(hào)可控制在10cpm左右

親和閃爍分析(scintil1ation proximity assay
,SPA)是一種新的液閃分析法
。該方法在細(xì)胞表面受體藥物篩選中應(yīng)用較為普遍。在高通量篩選測(cè)定細(xì)胞表面受體親合結(jié)合作用時(shí)
,放射配體標(biāo)記濾過(guò)分析技術(shù)由于需要進(jìn)行分離
,現(xiàn)已被親合閃爍分析所取代。親合閃爍分析技術(shù)通過(guò)親合結(jié)合
,將放射性配基結(jié)合到具有受體的閃爍球上
,從而產(chǎn)生光子
,減少了放射配體標(biāo)記分析中的游離配基與結(jié)合配基的分離過(guò)程,使得放射配基分析可完全以自動(dòng)化的方式進(jìn)行,適于進(jìn)行高通量篩選
。產(chǎn)生低能量放射粒子的同位素可被用來(lái)進(jìn)行放射性標(biāo)記
,而這種低能量放射粒子在短距離內(nèi)可被重吸收
,以確保只有結(jié)合到受體表面的配基才被檢測(cè)到。SPA技術(shù)被廣泛的應(yīng)用到激酶
、核酸處理酶分析以及受體配體的相互作用分析中

1.3.2 分光光度法 為了適應(yīng)高通量藥物篩選,許多公司都生產(chǎn)了具備計(jì)算機(jī)接口并能對(duì)多孔板進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的分光光度計(jì)
。以Molecular Device公司的spectra 190為例
,它采用8條光導(dǎo)纖維同時(shí)對(duì)8孔進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定波長(zhǎng)以2nm為間隔
,可以在190nm一850nm間進(jìn)行選擇
。對(duì)未知物質(zhì),可在該范圍內(nèi)進(jìn)行掃描以確定其特征吸收光譜
。因此
,大大增加了建立模型的多樣性
。檢測(cè)數(shù)據(jù)以不同文件格式輸出,可用隨機(jī)軟件或通用數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行處理
。方便
、快速、準(zhǔn)確
、自動(dòng)化程度高
。分光光度法高靈敏儀器同自動(dòng)化操作系統(tǒng)的連接,使得基于紫外
、可見(jiàn)光譜的高通量藥物篩選模型成為主要模型種類(lèi)

1.3.3 化學(xué)發(fā)光檢測(cè) 化學(xué)發(fā)光指生色物質(zhì)在酶促作用下,化學(xué)能以光子的形式釋放出來(lái)
?div id="d48novz" class="flower left">
;瘜W(xué)發(fā)光根據(jù)發(fā)光的形式和種類(lèi)分為輝光型和閃光型發(fā)光兩種。輝光型化學(xué)發(fā)光如以AMPPD
、CDPS
、ECL、Diagoxigein等為基礎(chǔ)的發(fā)光反應(yīng)
。其發(fā)光時(shí)間較長(zhǎng)且穩(wěn)定
。而以發(fā)光蛋白、ATP
、熒光素酶等為底物的發(fā)光反應(yīng)則是閃光型發(fā)光反應(yīng)
,其發(fā)光時(shí)間較短。由于時(shí)間分辨及偶合回路技術(shù)的使用
,對(duì)于背景的去除更為有效
,使得化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.1pg數(shù)量級(jí)。在單孔多點(diǎn)噴射技術(shù)中
,用于檢測(cè)化學(xué)發(fā)光的光導(dǎo)纖維末端帶有一噴頭
,用來(lái)加入反應(yīng)性底物。反應(yīng)性底物從100個(gè)小孔噴出
,使反應(yīng)性底物加入孔中后即可均勻混合
。發(fā)光反應(yīng)同時(shí)啟動(dòng)后,可立即進(jìn)行測(cè)定
,對(duì)于閃光性化學(xué)發(fā)光的測(cè)定更為有利。
1.3.4 激發(fā)熒光檢測(cè) 新型激發(fā)熒光檢測(cè)儀在傳統(tǒng)儀器的基礎(chǔ)上
,用連續(xù)的激發(fā)光諧和測(cè)定光譜取代固定光譜
,使模型的建立更具備靈活性。熒光檢測(cè)方法靈敏是因?yàn)槎鄶?shù)熒光基團(tuán)都有短暫的半衰期
,即使用較弱的激發(fā)光源也能獲得大量的光子流
。這種特性以及多種可采用的熒光模式
,使得熒光檢測(cè)技術(shù)成為高通量篩選必不可少的應(yīng)用手段。熒光技術(shù)在均相篩選分析中廣為應(yīng)用
。其中
,包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET),熒光偏振(FP)
,時(shí)間分辨熒光(TRET)以及熒光相關(guān)譜(FCS)等技術(shù)

1.4 數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)
高通量藥物篩選的特點(diǎn)是對(duì)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的化合物樣品進(jìn)行多模型的篩選。與高通量藥物篩選相適應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)主要承擔(dān)4個(gè)方面的功能

樣品庫(kù)的管理功能:化合物樣品庫(kù)對(duì)進(jìn)行高通量藥物篩選的化合物樣品的各種理化性質(zhì)進(jìn)行存儲(chǔ)管理
。對(duì)每一個(gè)新入庫(kù)的化合物進(jìn)行新穎性分析,排除結(jié)構(gòu)雷同的化合物
,避免不必要的篩選
。由于高度反應(yīng)性基團(tuán)增加了假陽(yáng)性出現(xiàn)的機(jī)率,樣品庫(kù)對(duì)新入庫(kù)的化合物進(jìn)行反應(yīng)基因檢測(cè)以去除這類(lèi)化合物

生物活性信息的管理功能:生物活性庫(kù)存貯每一化合物經(jīng)過(guò)不同模型檢測(cè)后的結(jié)果
,并根據(jù)多個(gè)模型的檢測(cè)結(jié)果對(duì)化合物的生物活性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。
對(duì)高通量藥物篩選的服務(wù)功能:高通量藥物篩選的工作量大
,自動(dòng)化程度高
,也涉及到許多繁瑣的工作。高通量藥物篩選數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)對(duì)與藥物篩選相關(guān)的業(yè)務(wù)往來(lái)通訊
、檔案管理以及各種樣品標(biāo)簽的打印進(jìn)行管理
,使高通量藥物篩選的各個(gè)環(huán)節(jié)程序化、標(biāo)準(zhǔn)化

藥物設(shè)計(jì)與藥物發(fā)現(xiàn)功能:高通量藥物篩選產(chǎn)生大量的化合物結(jié)構(gòu)信息
,隨著篩選的進(jìn)行,生物活性信息也特大幅度提高
。高通量藥物篩選數(shù)據(jù)庫(kù)管理系統(tǒng)通過(guò)對(duì)同一模型不同的呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析
,找出其構(gòu)效關(guān)系,從而為藥物設(shè)計(jì)提供參考

1.5 篩選模型
是指用于檢測(cè)藥物作用的實(shí)驗(yàn)方法
。由于高通量篩選要求反應(yīng)總體積小,而且
,反應(yīng)具有較高特異性和敏感性
,因此對(duì)于篩選模型也要求較高。這些模型主要集中在受體
、酶
、通道以及各種細(xì)胞反應(yīng)方面。基因水平的藥物篩選模型
,使藥物篩選模型的范圍更為廣泛

1.5.1 以酶為靶的高通量篩選 以酶為作用靶的高通量篩選方法,絕大多數(shù)是直接檢測(cè)酶活性
。具體方法根據(jù)酶的不同而不同
,主要有基于放射性的方法和基于比色、熒光的方法兩大類(lèi)

基于放射性的方法多是將底物標(biāo)記
,測(cè)定放射性產(chǎn)物的生成。Taft等建立了(1,3)β-葡聚糖合酶抑制劑(抗真菌)的高通量篩選方法
。將含有酶的菌絲提取物
、α-淀粉酶和UDP-14C-葡萄糖加入96孔板的孔中,溫孵
、反應(yīng)
。終止反應(yīng)后,濾去未被合成進(jìn)入的底物
。閃爍計(jì)數(shù)檢測(cè)濾器上保留的(1,3)β-葡聚糖
,指示酶活性大小。
也有將酶標(biāo)記
,測(cè)定被特異結(jié)合的酶的方法
。Vollmer等建立了一種以青霉素結(jié)合蛋白(PBP)為靶的抗生素的高通量篩選方法。PBP既是糖基轉(zhuǎn)移酶又是肽轉(zhuǎn)移酶
,該法是篩選其糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域的活性位點(diǎn)上的可結(jié)合物
。將莫諾霉素(moenomycin)結(jié)合于一種小球上,制成混懸液
,加入96孔板
,然后加入3H標(biāo)記的PBP(細(xì)菌膜粗提物)和受試化合物,孵育
、過(guò)濾去掉非結(jié)合的放射性
,閃爍計(jì)數(shù)測(cè)得的放射性指示PBP與莫諾霉素結(jié)合的情況及受試化合物對(duì)其影響。
另外
,基于放射性而無(wú)需過(guò)濾分離的SPA也有應(yīng)用
。Brown等建立了內(nèi)源性肽酶的水解活性檢測(cè)方法,用以研究其抑制劑
。用3H標(biāo)記的肽底物
,通過(guò)生物素(biotin)與抗生物素蛋白(avidin)包裹的SPA閃爍球相連。酶解使3H隨肽的斷裂而離開(kāi)閃爍球
。測(cè)定3H放射性作用于閃爍球產(chǎn)生的閃爍信號(hào)的丟失量
,即指示酶活性大小

基于比色、熒光等的方法有一些報(bào)道
。Waslidge等建立了脂氧合酶抑制劑的篩選方法。酸性條件下
,脂的過(guò)氧化物能把Fe2+氧化為Fe3+
,然后氧化二甲酚橙(xylenol orange),產(chǎn)物在可見(jiàn)光區(qū)620nm有強(qiáng)烈吸收
。在96孔板上測(cè)定
。Zhang等建立了HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(抗病毒藥物)的高通量篩選方法。方法使用了“同質(zhì)時(shí)間分辨熒光”(homogenous time resolved fluorence
,HTRF)技術(shù)
,既實(shí)現(xiàn)了非分離操作(同質(zhì)),又避免了放射性同位素的使用
。該方法基于逆轉(zhuǎn)錄酶能很容易地將核苷酸類(lèi)似物(如生物素-11-dUTP)引入新生DNA鏈
。在96或384孔板上,將生物素化的引物/模板與抗生蛋白鏈菌素-銪在板孔中混合孵育
,加入逆轉(zhuǎn)錄酶
,再加入生物素-dUTP和d-TTP混合物啟動(dòng)反應(yīng)。反應(yīng)60min后
,加入鏈親和素-別藻藍(lán)蛋白(streptavidin-allophycocyanin)
,孵育,用HTRF分析儀讀取數(shù)據(jù)
。該法也可用于多種其他的核酸聚合酶

1.5.2 以受體為靶的高通量篩選 以受體為作用靶的高通量篩選方法。檢測(cè)功能反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)是易于區(qū)分激動(dòng)劑和拮抗劑
。經(jīng)典的功能檢測(cè)方法通量低
,而引入基于重組技術(shù)的報(bào)告基因檢測(cè)方法極大地提高了篩選通量,既高效且節(jié)省成本
。檢測(cè)第二信使或下游機(jī)制如磷酸化
,傳統(tǒng)方法也比較麻煩,不適于高通量檢測(cè)
,但將這些機(jī)制與報(bào)告基因相偶聯(lián)則能克服

1.5.3 以離子通道為靶的高通量篩選 Negri等建立了貝類(lèi)動(dòng)物毒素的高通量篩選方法。其作用靶為Na+通道上的蛤蚌毒素(STX)結(jié)合位點(diǎn)
,用放射性配體(3H-STX)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)考察受試樣品
。Yong等用酵母雙雜交的方法高通量篩選干擾N型鈣通道β3亞單位與α1β亞單位相互作用的小分子,尋找新型鈣通道拮抗劑

1.5.4 以核酸為靶的高通量篩選 Hamasaki等建立了以16S rRNA編碼區(qū)結(jié)構(gòu)和HIV-RRE RNA結(jié)構(gòu)為靶的抑制劑的高通量篩選方法
。尋找類(lèi)似氨基糖甙類(lèi)抗生素而親和力更高或作用于相同核酸的其他位點(diǎn)的新化合物
,以及不易被代謝失活的新化合物。方法基于當(dāng)含芘的氨基甙類(lèi)似物結(jié)合于RNA時(shí)
,芘的熒光被淬滅的原理
。在96孔板上,將芘碳酰巴龍霉素(PCP)
,RNA結(jié)構(gòu)配成溶液后加入有受試化合物的板孔中
,用熒光讀板器考察熒光恢復(fù)的程度。
1.5.5 以細(xì)胞功能為基礎(chǔ)的高通量篩選
1.5.5.1 內(nèi)皮細(xì)胞激活 內(nèi)皮細(xì)胞激活是急慢性炎癥過(guò)程中重要的組成環(huán)節(jié)
。Rice等以E選擇蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)作為標(biāo)志
,建立了內(nèi)皮細(xì)胞激活抑制劑的高通量篩選方法。建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)
。IL-1刺激下
,E選擇蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞表面的表達(dá)用ELISA方法定量。方法包括細(xì)胞固定
、加液
、加受試化合物等操作,能保持細(xì)胞完整
,不昂貴
,可重復(fù),篩選速度可達(dá)每星期1000種化合物
。適用化合物范圍很寬
,并且方法用細(xì)胞作為檢測(cè)對(duì)象,使能夠較早地發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)化合物的攝取及化合物的細(xì)胞毒性

1.5.5.2 細(xì)胞凋亡 Erusalimsky等建立了新型細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)物的高通量篩選方法
。細(xì)胞預(yù)先用3H 胸苷標(biāo)記,與凋亡誘導(dǎo)物孵育后
,連續(xù)經(jīng)過(guò)兩種玻璃濾器
。一個(gè)是中性的,捕獲完整的染色質(zhì)和高分子量DNA
。另一個(gè)裝有DEAE活性基團(tuán)
,捕獲低分子量DNA碎片。通過(guò)對(duì)濾器上放射性的測(cè)量
,可以對(duì)DNA的破碎情況定量

1.5.5.3 抗腫瘤活性 Lu等建立了用高通量“生物活性指紋”篩選抗肺癌藥物的方法,考察受試分子(類(lèi)維生素A及類(lèi)維生素A相關(guān)分子)對(duì)許多不同細(xì)胞系的效應(yīng)特點(diǎn)
。檢測(cè)指標(biāo)包括:(1)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制檢測(cè)
。選擇了約50種腫瘤和非腫瘤細(xì)胞,包括了大量不同的組織和(或)腫瘤來(lái)源
。細(xì)胞暴露于受試化合物5d后
,用標(biāo)準(zhǔn)比色法測(cè)定存活細(xì)胞百分率
。20%生長(zhǎng)抑制率指示有活性。(2)集落形成抑制檢測(cè)
,用以區(qū)分細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用和細(xì)胞殺傷作用
。6孔板上加NCI-H292非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞,暴露于受試物一定時(shí)間
。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗
,植于無(wú)受試物的培養(yǎng)介質(zhì)共7d。用結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞染色
,考察集落形成情況。(3)凋亡檢測(cè)
,用ELISA方法測(cè)量細(xì)胞DNA破碎
。(4)轉(zhuǎn)錄調(diào)控檢測(cè),用以考察受試化合物是否有類(lèi)維生素A受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制作用
。方法是將HeLa TK-細(xì)胞用73Col-CAT報(bào)告基因連同受體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染
,與受試物一起培養(yǎng),用ELISA方法檢測(cè)CAT活性

1.5.5.4 G2檢查點(diǎn)(G2 checkpoint) Roberge等建立了G2期檢查點(diǎn)抑制劑的高通量篩選方法
。將MCF-7m p53細(xì)胞培養(yǎng),種在96孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)板上
。照射使細(xì)胞進(jìn)入G2靜止期
,加入受試化合物用ELISA方法檢測(cè)核仁蛋白(nucleolin)的磷酸化形式,從而得到從G2期釋放進(jìn)入M期的細(xì)胞數(shù)量
,即抑制G2檢查點(diǎn)程度

1.5.5.5 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 Su等建立了TGFβ3通路作用物的高通量篩選方法。構(gòu)建融合報(bào)告基因
,轉(zhuǎn)染細(xì)胞
,選擇蟲(chóng)熒光素酶表達(dá)能被TGFβ高誘導(dǎo)的克隆。將細(xì)胞植于96孔板
,與受試化合物孵育后
,稀釋并加入Steady-Glo底物測(cè)蟲(chóng)熒光素酶活力,與對(duì)照比較
,計(jì)算相對(duì)酶活性增加值

1.5.5.6 細(xì)菌蛋白分泌 Alksne等建立了以抑制細(xì)菌蛋白分泌為作用方式的新型抗生素的高通量篩選方法。該方法基于SecA-lacZ融合報(bào)告基因
。SecA是一種自我調(diào)控翻譯的蛋白
,當(dāng)細(xì)菌蛋白分泌被干擾時(shí),該報(bào)告基因被誘導(dǎo)

1.5.5.7 細(xì)菌生長(zhǎng) Chung等建立了抑制分枝桿菌生長(zhǎng)化合物的高通量篩選方法
。選擇了一種腐生性分枝桿菌代替結(jié)核分枝桿菌
,因其具有生長(zhǎng)迅速以及非感染性的特點(diǎn)。通過(guò)測(cè)定細(xì)胞攝入放射性標(biāo)記的尿嘧啶
,考察受試化合物對(duì)分枝桿菌活力的作用
。用96孔板的形式,1d內(nèi)可以測(cè)試數(shù)千個(gè)樣品

2.生藥活性成分的高通量篩選
樣品是高通量藥物篩選的物質(zhì)基礎(chǔ)
,樣品庫(kù)來(lái)源的化學(xué)多樣性是決定高通量篩選技術(shù)能否成功的關(guān)鍵因素之一。前面我們談到
,化合物樣品主要有常規(guī)化學(xué)合成
、組合化學(xué)合成和從天然產(chǎn)物中分離純化幾個(gè)來(lái)源。而從天然產(chǎn)物中分離出來(lái)的化合物
,由于其母核結(jié)構(gòu)和活性基團(tuán)是長(zhǎng)期的自然選擇形成的
,它們具有人工合成化合物所不能比擬的優(yōu)勢(shì)。
我國(guó)擁有非常豐富的藥材資源
,幾十年來(lái)
,我們應(yīng)用藥理學(xué)手段,對(duì)我國(guó)的傳統(tǒng)藥物進(jìn)行了大規(guī)模的研究和篩選
,取得了巨大成就
。但是,僅僅依靠傳統(tǒng)的藥理實(shí)驗(yàn)方法
,既耗時(shí)
,勞動(dòng)強(qiáng)度又大,還需要使用大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
,顯然不能適應(yīng)大量樣品的同時(shí)篩選
。雖然經(jīng)過(guò)努力,已從生藥中分離
、提取
、純化出大量化合物,但由于研究手段的落后
,使大量分離出的化合物得不到充分的利用
,造成了化合物資源的極大浪費(fèi)。
因此
,將高通量篩選技術(shù)應(yīng)用于生藥的活性成分研究
,既是對(duì)高通量篩選技術(shù)的不斷完善,又是將這一技術(shù)應(yīng)用于中藥現(xiàn)代化研究的有益嘗試

如何對(duì)生藥的活性成分進(jìn)行高通量篩選呢
?其原理、方法和人工合成化合物的高通量篩選基本一致
,區(qū)別主要在于篩選前需要從生藥中將化合物提取出來(lái)并進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆蛛x和化學(xué)多樣性的評(píng)價(jià)
。相同的就不再贅述
,這里主要談一下提取、分離和多樣性評(píng)價(jià)的問(wèn)題

2.1 提取 由于高通量篩選需要大量的樣品來(lái)源
,所以常規(guī)的提取方法顯然不能滿足這一要求。尋找一個(gè)快速
、高效
、連續(xù)、自動(dòng)化的提取方法顯得迫在眉睫
。加速溶劑提取技術(shù)是一個(gè)新的提取技術(shù)
,在準(zhǔn)備好樣品和對(duì)提取方法(或程序)進(jìn)行設(shè)定后,自動(dòng)進(jìn)樣和自動(dòng)收集裝置就可以連續(xù)對(duì)最多24個(gè)不同樣品自動(dòng)完成樣品的提取和提取液的收集
,簡(jiǎn)單方便
。應(yīng)用這一技術(shù),可以得到大量的生藥的提取物

2.2 分離及化學(xué)多樣性評(píng)價(jià) 我們都知道,生藥的化學(xué)成分相當(dāng)復(fù)雜
,通過(guò)提取得到的提取物往往是大量單體組成的混合物
,所以篩選前需要對(duì)生藥的提取物進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆蛛x。在眾多的分離手段中
,制備型HPLC應(yīng)該是最為理想的
,它具有快速、高效
、自動(dòng)化等諸多優(yōu)點(diǎn)

分離完成后還需要對(duì)分離的物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)多樣性的評(píng)價(jià),以提高高通量篩選的效率
。以前
,這種評(píng)價(jià)多是基于物種的地理分布、生物學(xué)分類(lèi)
、化學(xué)分類(lèi)以及基源等關(guān)系
,隨著科技的進(jìn)步,多種現(xiàn)代化手段開(kāi)始應(yīng)用于化學(xué)多樣性的評(píng)價(jià)
。其中
,色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-ESI-MS)技術(shù)在這方面做出了有力的嘗試。首先
,它做出成分的離子信號(hào)(m/z)對(duì)保留時(shí)間的平面圖
,然后對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的相似度評(píng)估從而對(duì)樣品的多樣性進(jìn)行定量的評(píng)價(jià)。接著
,三維的HPLC數(shù)據(jù)被轉(zhuǎn)換為CDF文件格式并傳輸?shù)経NIX工作站
。數(shù)據(jù)文件中的每一個(gè)離子(包括保留時(shí)間
、質(zhì)量、離子強(qiáng)度等數(shù)據(jù))被定位在一個(gè)二維圖譜中
,保留時(shí)間和質(zhì)量分占一個(gè)軸
,離子強(qiáng)度數(shù)據(jù)儲(chǔ)存在位點(diǎn)中。濾除噪聲以后
,離子的中心時(shí)間和中心質(zhì)量被計(jì)算出來(lái)
。根據(jù)對(duì)LCMS的數(shù)據(jù)處理,混合物間的相似度被定量地計(jì)算出來(lái)
。這種數(shù)據(jù)處理基于以下的一種關(guān)系
,這種關(guān)系表征了樣品1中的離子i和樣品2中的離子j的“化學(xué)空間”距離。
其中
,ti表示離子i的色譜保留時(shí)間
,mi表示離子i的質(zhì)荷比(m/z),wt是保留時(shí)間的權(quán)重系數(shù)
,wm是質(zhì)量的權(quán)重系數(shù)
。dij是離子i和離子j的歐幾里的距離,n1和n2分別是樣品1和樣品2中確認(rèn)的離子數(shù)
。sij是離子i和離子j之間的相似度(0-1)
,相似度值為1表明是相同樣品,相反
,相似度值接近0則表明樣品具有很高的化學(xué)多樣性
。通過(guò)這種方法,可以很好的解決樣品化學(xué)多樣性的評(píng)價(jià)問(wèn)題

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