中科院科學(xué)家構(gòu)建空間轉(zhuǎn)錄組測序新方法(10X空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析梳理)

中科院科學(xué)家構(gòu)建空間轉(zhuǎn)錄組測序新方法

中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所景乃禾課題組新近創(chuàng)立了一種技術(shù)方法，可以獲得具有空間位置信息的少量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。相關(guān)研究成果日前在線發(fā)表于《自然-實(shí)驗(yàn)室指南》。

無論是體內(nèi)組織還是體外細(xì)胞系，不同細(xì)胞之間都存在著差異性，即細(xì)胞的異質(zhì)性。細(xì)胞的異質(zhì)性對解釋腫瘤的發(fā)生、干細(xì)胞或前體細(xì)胞的多能性與譜系分化、干細(xì)胞與微環(huán)境的相互作用等具有重要意義。近些年，單細(xì)胞測序技術(shù)迅速發(fā)展，使得研究細(xì)胞之間的異質(zhì)性成為可能。然而，目前單細(xì)胞測序的方法均會丟失細(xì)胞在體內(nèi)原有的位置信息，而對某些研究領(lǐng)域如發(fā)育生物學(xué)、腫瘤生物學(xué)而言，細(xì)胞來源的位置信息是十分關(guān)鍵的。

在景乃禾和彭廣敦的指導(dǎo)下，陳軍通過整合與優(yōu)化單細(xì)胞測序和激光顯微切割技術(shù)，構(gòu)建了一種能夠獲得少量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組信息，同時(shí)保留細(xì)胞原有位置信息的測序方法：Geo-seq。

Geo-seq是一種高效、高分辨率的空間轉(zhuǎn)錄組分析方案，既可用于轉(zhuǎn)錄圖譜的三維重建，也可用于研究具有特殊結(jié)構(gòu)的少量組織或細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息。利用Geo-seq技術(shù)，該課題組繪制了小鼠早期胚胎原腸運(yùn)動(dòng)中期精細(xì)的三維分子圖譜，并揭示了小鼠細(xì)胞譜系藍(lán)圖建立過程中的空間轉(zhuǎn)錄組特征、轉(zhuǎn)錄因子和信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

據(jù)悉，Geo-seq技術(shù)已成功應(yīng)用于小鼠大腦發(fā)育、肝臟腫瘤學(xué)以及人的精子發(fā)育等研究中。

10X空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析梳理

空間轉(zhuǎn)錄組學(xué) (ST) 技術(shù)正迅速成為單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNAseq) 的延伸，具有以單細(xì)胞分辨率分析基因表達(dá)的潛力，同時(shí)保持組織內(nèi)的細(xì)胞組成 。同時(shí)擁有表達(dá)譜和組織組織使研究人員能夠更好地了解細(xì)胞相互作用和異質(zhì)性，從而深入了解傳統(tǒng)測序技術(shù)無法實(shí)現(xiàn)的復(fù)雜生物過程。 ST 技術(shù)生成的數(shù)據(jù)本質(zhì)上是嘈雜的、高維的、稀疏的和多模態(tài)的（包括組織學(xué)圖像、計(jì)數(shù)矩陣等），因此需要專門的計(jì)算工具來進(jìn)行準(zhǔn)確和穩(wěn)健的分析 。然而，目前許多 ST 研究使用傳統(tǒng)的 scRNAseq 工具，這些工具不足以分析復(fù)雜的 ST 數(shù)據(jù)集。另一方面， 許多現(xiàn)有的特定于 ST 的方法都是建立在傳統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)或機(jī)器學(xué)習(xí)框架之上的，由于空間分辨數(shù)據(jù)的規(guī)模、多模態(tài)和限制，這些方法在許多應(yīng)用中都不是最優(yōu)的（如空間分辨率、靈敏度和基因覆蓋率）。鑒于這些復(fù)雜性，研究人員開發(fā)了基于深度學(xué)習(xí) (DL) 的模型來緩解 ST 特有的挑戰(zhàn) 。這些方法包括對齊、空間重建和空間聚類等新的最先進(jìn)模型。然而，用于 ST 分析的深度學(xué)習(xí)模型是新生的，并且在很大程度上仍未得到充分探索。在這篇綜述中，概述了用于分析空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)的現(xiàn)有最先進(jìn)工具，同時(shí)更深入地研究了基于 DL 的方法。討論了該領(lǐng)域的新前沿和未解決的問題，并強(qiáng)調(diào)了我們預(yù)計(jì)轉(zhuǎn)型 DL 應(yīng)用的領(lǐng)域。

盡管多細(xì)胞生物在其細(xì)胞內(nèi)包含一個(gè)共同的基因組， 但細(xì)胞的形態(tài)和基因表達(dá)模式在很大程度上是不同的和動(dòng)態(tài)的 。 這些差異源于內(nèi)部基因調(diào)控系統(tǒng)和外部環(huán)境信號。 細(xì)胞在組織中增殖、分化和發(fā)揮作用，同時(shí)從周圍環(huán)境發(fā)送和接收信號 。 這些環(huán)境因素導(dǎo)致細(xì)胞命運(yùn)高度依賴于它所處的環(huán)境。 因此， 研究細(xì)胞在駐留組織中的行為對于了解細(xì)胞功能及其過去和未來的命運(yùn)至關(guān)重要 。

單細(xì)胞測序的進(jìn)步已經(jīng)改變了基因組學(xué)和生物信息學(xué)領(lǐng)域。單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNAseq) 的出現(xiàn)使研究人員能夠分析各種組織和器官的基因表達(dá)水平，從而使他們能夠創(chuàng)建不同物種的綜合圖譜 。此外，scRNAseq 能夠檢測組織內(nèi)存在的不同亞群；這對于發(fā)現(xiàn)新的生物過程、疾病的內(nèi)部運(yùn)作和治療的有效性至關(guān)重要。然而，實(shí)體組織的高通量測序需要組織解離，導(dǎo)致空間信息的丟失。為了充分了解細(xì)胞相互作用，需要組織形態(tài)和空間信息的數(shù)據(jù)，而單靠 scRNAseq 無法提供這些數(shù)據(jù)。 從發(fā)育階段（例如母細(xì)胞和子細(xì)胞的不對稱細(xì)胞命運(yùn)）到細(xì)胞分化（例如細(xì)胞功能、對刺激的反應(yīng)和組織穩(wěn)態(tài)），細(xì)胞在組織內(nèi)的放置至關(guān)重要。這些限制將通過可以在單細(xì)胞水平測量基因表達(dá)的同時(shí)保留空間信息的技術(shù)得到緩解 。

Spatial Transcriptomics (ST) provide an unbiased view of tissue organization crucial in understanding cell fate, delineating heterogeneity, and other applications 。然而，與 scRNAseq 相比，當(dāng)前許多 ST 技術(shù)的靈敏度較低，同時(shí)缺乏 scRNAseq 提供的單細(xì)胞分辨率。靶向原位技術(shù)試圖解決分辨率和靈敏度的問題，但在基因通量方面受到限制，并且通常需要對靶基因的先驗(yàn)知識。更具體地說，原位技術(shù)（例如原位測序、單分子熒光原位雜交（smFISH）、靶向擴(kuò)增測序、環(huán)狀銜尾蛇smFISH（osmFISH）、多重抗錯(cuò)熒光原位雜交（MERFISH）、序列 FISH (seqFISH+) 和空間分辨轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增子讀數(shù)映射 (STARmap) 通常僅限于數(shù)百個(gè)數(shù)量級的預(yù)選基因，隨著更多探針的添加，準(zhǔn)確性可能會下降。 將參考這些方法稱為基于圖像的技術(shù) 。

另一方面，基于下一代測序 (NGS) 的技術(shù)（例如 10x Genomics 的 Visium 及其前身 Slide-Seq、HDST）對整個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行條形碼化，但捕獲率有限，分辨率大于單個(gè)細(xì)胞（ Visium 為 50 μm - 100 μm，Slide-Seq 為 10 μm）。 此外， 與基于圖像的技術(shù)不同，基于 NGS 的方法允許對大型組織切片進(jìn)行無偏見的分析，而無需一組靶基因 。 然而，基于 NGS 的技術(shù)不具有單細(xì)胞分辨率，需要使用計(jì)算方法推斷細(xì)胞特征或?qū)⑵渑c組織學(xué)尺度相關(guān)聯(lián)。 許多當(dāng)前算法使用需要人工監(jiān)督的傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)或醫(yī)學(xué)圖像處理框架，這對于大規(guī)模分析來說并不理想。 此外， 許多算法無法在不同的測序平臺上推廣，這限制了它們的實(shí)用性并限制了多組學(xué)集成工作 。

深度學(xué)習(xí) (DL) 方法可以使用原始數(shù)據(jù)來提取執(zhí)行任務(wù)所需的有用表示（或信息），例如分類或檢測 。這種質(zhì)量使得此類機(jī)器學(xué)習(xí) (ML) 算法非常適合可用數(shù)據(jù)量大、維數(shù)更高且嘈雜的應(yīng)用，例如單細(xì)胞組學(xué)。 DL 模型已廣泛用于 scRNAseq 研究（例如預(yù)處理、聚類、細(xì)胞類型識別和data augmentation），并且已顯示出對傳統(tǒng)方法的顯著改進(jìn) 10，表明此類方法在 ST 分析中的潛力。此外，DL 模型可以利用多個(gè)數(shù)據(jù)源（例如圖像和文本數(shù)據(jù)）來學(xué)習(xí)一組任務(wù)。鑒于空間分辨的轉(zhuǎn)錄組學(xué)本質(zhì)上是多模態(tài)的（即它們由圖像和基因表達(dá)計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)組成）并且下游分析由多個(gè)任務(wù)組成（例如聚類和細(xì)胞類型檢測）， 研究人員一直在尋求開發(fā) ST 特定的 DL 算法 。

隨著現(xiàn)在定義的技術(shù)， 接下來描述用于分析 ST 數(shù)據(jù)的常見機(jī)器學(xué)習(xí) (ML) 方法 。 首先討論 ML 和深度學(xué)習(xí) (DL) 模型的算法開發(fā)，然后討論用于空間解析轉(zhuǎn)錄組學(xué)（和 scRNAseq 數(shù)據(jù)）的常見架構(gòu)。

原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通常包含噪聲或其他不需要的特征，這對 ML 算法提出了許多挑戰(zhàn) 。因此，通常需要仔細(xì)預(yù)處理數(shù)據(jù)或依賴特定領(lǐng)域的專業(yè)知識，以便將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為 ML 模型可以從中學(xué)習(xí)的某種內(nèi)部表示。然而， 深度學(xué)習(xí) (DL) 算法旨在僅使用原始數(shù)據(jù)來自動(dòng)提取和構(gòu)建學(xué)習(xí)手頭任務(wù)所需的有用表示 。從廣義上講，DL 模型能夠通過構(gòu)建概念層次結(jié)構(gòu)從觀察中學(xué)習(xí)，其中每個(gè)概念都由其與更簡單概念的關(guān)系來定義。概念（和學(xué)習(xí)）層次結(jié)構(gòu)的圖形表示將由許多層組成，許多節(jié)點(diǎn)和邊連接頂點(diǎn)，有點(diǎn)類似于人類的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。該圖被稱為 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (ANN) 。 ANN 由相互連接的節(jié)點(diǎn)（“人工神經(jīng)元”）組成，這些節(jié)點(diǎn)類似于并模仿我們大腦的神經(jīng)元功能。如果一個(gè)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)由許多層組成——通常超過三層，則它被認(rèn)為是一個(gè)深度學(xué)習(xí)模型，因此被稱為深度模型。

ST 領(lǐng)域正在迅速發(fā)展，每周都會發(fā)布新的數(shù)據(jù)集和分析管道。 生物方法的創(chuàng)新將繼續(xù)激發(fā)算法開發(fā)的創(chuàng)造力，重點(diǎn)是基于 ML 的框架。 盡管目前用于 ST 分析的 DL 模型的空間很小，但預(yù)計(jì)該領(lǐng)域?qū)⒔?jīng)歷向深度學(xué)習(xí)模型的范式轉(zhuǎn)變 。

這里 概述了當(dāng)前基于 DL 的技術(shù)，用于 ST 數(shù)據(jù)的對齊和整合、空間聚類、點(diǎn)反卷積、推斷細(xì)胞間通信，以及使用 scRNAseq 數(shù)據(jù)（有限或沒有空間參考）重建空間坐標(biāo)的方法地圖集） 。與傳統(tǒng)方法相比，提出的 DL 方法具有準(zhǔn)確性和可擴(kuò)展性優(yōu)勢。然而，DL 方法并不總是首選，因?yàn)樗鼈兊挠?jì)算成本很高，并且可能缺乏生物學(xué)可解釋性。隨著更多 ST 分析方法的開發(fā)，我們相信用于對新模型進(jìn)行基準(zhǔn)測試的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)集以及對現(xiàn)有技術(shù)的全面準(zhǔn)確性和效率分析將對該領(lǐng)域具有重要價(jià)值。盡管現(xiàn)有方法在各自的類別中設(shè)置了新的最先進(jìn)技術(shù)，但改進(jìn)的空間仍然很大。在 ST 下游分析中，DL 算法在研究細(xì)胞間通訊和空間可變基因鑒定中的應(yīng)用仍然大多未得到充分探索。鑒于 DL 模型能夠從原始數(shù)據(jù)中提取復(fù)雜模式， 預(yù)計(jì) DL 方法將在解開復(fù)雜的生物過程中證明是有用的，有助于在空間環(huán)境中識別細(xì)胞相互作用和高度可變的基因 。

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空間轉(zhuǎn)錄組如何圈出特定細(xì)胞

空間轉(zhuǎn)錄組是一種用于從空間層面上解析RNA-seq數(shù)據(jù)的技術(shù),從而解析單個(gè)組織切片中的所有mRNA?？臻g條形碼逆轉(zhuǎn)錄oligo(dT)引物在顯微鏡載玻片表面的有序附著,使得在mRNA樣品處理和后續(xù)測序過程中位置信息的編碼和獲取成為可能。

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