山中伸彌PNAS：提高干細胞重編程效率的新方法(誘導性多功能干細胞的研究歷史)

山中伸彌PNAS：提高干細胞重編程效率的新方法

2016年10月27日訊 最近在美國國家科學院學報PNAS上發(fā)表的一項研究中，諾獎得主、首次制備了誘導多功能干細胞（iPSCs）的山中伸彌（Shinya Yamanaka）博士，和他Gladstone研究所的同事，通過對一種罕見的遺傳性疾病進行研究，找到了一種方法來提高干細胞重編程的效率。

iPSCs--從皮膚細胞制備而來的干細胞，可以轉(zhuǎn)化成身體中任何類型的細胞，從而徹底改變了生物醫(yī)學科學。它們有助于再生醫(yī)學和藥物發(fā)現(xiàn)的突破，從而超越了研究人員曾經(jīng)想到的可能性。但是，就像任何新技術(shù)一樣，iPSCs也有需要改進的空間。例如，使用現(xiàn)有的技術(shù)，只有不到百分之一的成人皮膚細胞被重編程為iPSCs。

Gladstone研究所高級研究員、日本iPSC研究和應(yīng)用中心（CiRA）主任山中伸彌說：“iPSCs的制備效率低下，是將這一技術(shù)應(yīng)用于生物醫(yī)學的一個主要障礙。我們的研究發(fā)現(xiàn)了一種令人驚訝的方式，可增加我們生成的iPSCs的數(shù)量?！?/p>

科學家們以一個非常不同的目標開始：制備一個細胞模型來研究進行性骨化性纖維發(fā)育不良（FOP）。這種極為罕見的遺傳性疾病，可導致肌肉、肌腱和韌帶轉(zhuǎn)化成骨質(zhì)，因此綽號“石人綜合癥”。這種疾病是由ACVR1基因中的一個突變造成的，它能過度激活一個對于胚胎發(fā)育非常重要的細胞信號過程，并涉及一個稱為BMP的蛋白質(zhì)。

令人驚訝的是，科學家們發(fā)現(xiàn)，與健康者相比，他們用來自FOP患者的細胞制備出的iPSCs細胞更多。他們認為，這是因為BMP信號可促進細胞更新--一個細胞復(fù)制的能力，并使它們保持在一個多功能的狀態(tài)，能夠成為任何類型的細胞。這兩個特征是干細胞的關(guān)鍵特性。為了證實他們的預(yù)感，研究人員阻止BMP信號通路，這會導致FOP患者細胞產(chǎn)生更少的iPSCs。相反，激活這個信號通路可產(chǎn)生更多的iPSCs。

本文第一作者、山中伸彌以前的博士后Yohei Hayashi博士說：“最初，我們想建立一個FOP模型，也許可以幫助我們了解特定基因突變?nèi)绾斡绊懝切纬?。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，來自FOP患者的細胞比來自健康人的細胞能夠更高效地重編程。我們認為，這可能是因為導致骨細胞增殖的相同途徑，也有助于干細胞再生?！?/p>

本文共同作者、Gladstone研究所高級研究員Bruce Conklin補充說：“這項研究首次表明，一個自然發(fā)生的基因突變可提高iPSC生成的效率。用攜帶遺傳突變患者的細胞制備iPSCs不僅對疾病模型是有用的，而且也為重編程過程提供了新的見解?！?/p>

前不久，山中伸彌及其Gladstone心血管疾病研究所的科學家們用白血病抑制因子（LIF）、骨形成蛋白4（BMP4）、溶血磷脂酸（LPA）和抗壞血酸（AA）由小將小鼠始發(fā)態(tài)多能干細胞轉(zhuǎn)化為原始態(tài)多能干細胞。這項研究發(fā)表在十月十四日的美國國家科學院院刊PNAS雜志上。

另外，今年2月份，山中伸彌還在《Nature Reviews Molecular Cell Biology》雜志上發(fā)表綜述文章，全面回顧了iPS重編程的發(fā)展歷程。

誘導性多功能干細胞的研究歷史

誘導多能干細胞最初是日本人山中伸彌（ShinyaYamanaka）于2006年利用病毒載體將四個轉(zhuǎn)錄因子的組合轉(zhuǎn)入分化的體細胞中，使其重編程而得到的類似胚胎干細胞的一種細胞類型。隨后世界各地不同科學家陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其他方法同樣也可以制造這種細胞。
2007年11月20日，美國威斯康星大學詹姆斯·湯姆森的研究小組在<科學>雜志發(fā)表體細胞轉(zhuǎn)變成“誘導性多能干細胞”（iPS細胞）的成果，而日本京都大學教授山中申彌領(lǐng)導的研究小組也于同日在《細胞》雜志發(fā)表類似的研究結(jié)果。緊接著皮膚細胞轉(zhuǎn)為干細胞后，美國馬薩諸塞州懷德海特生物醫(yī)學研究所的雅各布·漢納的小組用來自患病小鼠尾巴的皮膚細胞產(chǎn)生了誘導性多能干細胞。
2008年4月，美國加利福尼亞大學科學家報告稱，他們將實驗鼠皮膚細胞改造成iPS細胞，然后成功使其分化成心肌細胞、血管平滑肌細胞及造血細胞。
2009年2月，日本東京大學科學家宣布，成功利用人類皮膚細胞制成的iPS細胞培育出血小板，而且從技術(shù)上說用iPS細胞培育人類紅細胞和白細胞都是可能的；緊接著，日本慶應(yīng)大學科學家又宣布，成功用實驗鼠的iPS細胞培育出鼠角膜上皮細胞。
2009年3月伊始，iPS細胞研究便相繼迎來兩項重大突破。英國和加拿大科學家發(fā)現(xiàn)了不借助病毒、安全將普通皮膚細胞轉(zhuǎn)化為iPS細胞的方法；美國科學家則在<細胞>雜志上宣布，他們可以將iPS細胞中因轉(zhuǎn)化需要而植入的有害基因移除，且保證由此獲得的神經(jīng)元細胞的基本功能不受影響。
2009年7月，iPS細胞研究在臨床應(yīng)用道路上又邁出非常重要的一步。據(jù)英國《自然》雜志網(wǎng)站報道，中國科學家周琪和高紹榮等人利用iPS細胞克隆出活體實驗鼠，首次證明iPS細胞與胚胎干細胞一樣具有全能性。該成果讓人們看到了iPS細胞具有實用性。

我國科學家在干細胞制備技術(shù)上取得新突破，該技術(shù)可以應(yīng)用于哪些臨床實驗？

多潛能干細胞具有無限增殖特性和分化成生物體所有功能細胞類型的能力，因此被稱為“種子細胞”，但其只短暫存于胚胎發(fā)育的早期階段，隨后便會分化為各種類型的成體細胞。

近年來，誘導多能干細胞技術(shù)的建立，在細胞治療、藥物篩選和疾病模型等領(lǐng)域產(chǎn)生了廣泛的應(yīng)用價值，尤其是為患者構(gòu)建自體特異性干細胞系，大大加速了干細胞臨床應(yīng)用的進程。

在哺乳動物自然發(fā)育過程中，多潛能干細胞只短暫存在于胚胎發(fā)育的早期階段，隨后便會分化為構(gòu)成生物體的各種類型的成體細胞，喪失其“種子細胞”的特性。如何逆轉(zhuǎn)這一自然發(fā)育過程，使高度分化的成體細胞重新獲得類似胚胎發(fā)育早期的多潛能狀態(tài)，一直是干細胞與再生醫(yī)學領(lǐng)域最重要的科學問題之一。

多潛能干細胞具有無限增殖的特性和分化成生物體所有功能細胞類型的能力。這些神奇的特質(zhì)，使其在細胞治療、藥物篩選和疾病模型等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值，是再生醫(yī)學領(lǐng)域最為關(guān)鍵的“種子細胞”。

為了讓干細胞誘導更安全、更有效率，鄧宏魁團隊十幾年來持續(xù)開展小分子的尋找工作。受低等動物再生過程啟發(fā)，團隊發(fā)現(xiàn)高度分化的人成體細胞在特定化學小分子組合的誘導下，可以發(fā)生類似低等動物細胞可塑性變化。

干細胞歸巢是指干細胞在多種因素的影響下，從原位定向遷移至靶組織并定植存活的過程。干細胞具有很強的歸巢能力，其歸巢到靶組織分為3步：首先識別微內(nèi)皮血管，然后透過內(nèi)皮，最后進入靶組織再生。

免疫是人體抵擋疾病，尤其是鏟除進入人體的病原微生物(細菌、病菌、寄生蟲等)和監(jiān)控、殺滅腫瘤細胞的關(guān)鍵因素。因而，免疫系統(tǒng)是人體的防衛(wèi)部隊，免疫細胞則是這個防衛(wèi)部隊中的戰(zhàn)斗員。

老年人因為免疫細胞削減，免疫細胞活性下降，抗病才調(diào)下降，因而容易發(fā)生腫瘤和其它疾病。免疫功用闌珊是變老的重要標志之一，而干細胞移植能夠有用跋涉人的免疫功用，因而，干細胞移植是保護人身體健康和變老的較有用實施之一。

誘導性多能干細胞的新方法

研究人員用來產(chǎn)生誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的方法既花時間而且效率又低。按照當前的方法，當把四種轉(zhuǎn)錄因子導入成體細胞如皮膚細胞中時，利用上千個皮膚細胞最終只能獲得幾個iPSCs。為此，在這項新的研究中，來自美國桑福德-伯納姆醫(yī)學研究所(Sanford-Burnham Medical Research Institute)的研究人員尋求激酶抑制劑的幫助，其中這些抑制劑阻斷激酶---一類在細胞通信、存活和生長等方面發(fā)揮著重要作用的酶---的活性。他們發(fā)現(xiàn)幾個激酶抑制劑當加入到起始細胞(如皮膚細胞)時，有助于產(chǎn)生比標準方法還要多的iPSCs。這些發(fā)現(xiàn)將可能加快很多領(lǐng)域的研究，和更好地能夠讓全世界的科學家們研究人類疾病和開發(fā)出新的治療方法。相關(guān)研究結(jié)果于9月25日刊登在Nature Communications期刊上。
論文通信作者Tariq Rana博士解釋道，“獲得iPSCs依賴于調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的通信網(wǎng)絡(luò)。因此，當開始操作細胞中哪些基因開啟或關(guān)閉來產(chǎn)生多能性干細胞時，人們很可能激活了許多激酶。因為許多活性的激酶可能抑制iPSCs產(chǎn)生，所以對我們而言，加入激酶抑制劑來降低這種障礙可能就有意義?！?br>根據(jù)未參與這項研究的沙克生物研究所(Salk Institute for Biological Studies)癌癥中心主任Tony Hunter博士的說法，鑒定出改善產(chǎn)生iPSCs效率的小分子為在治療上能夠使用這些細胞邁出重要的一步，而且Tariq Rana的這項新研究發(fā)現(xiàn)了一類蛋白激酶抑制劑能夠有效地促進iPSCs形成，因此這些抑制劑在產(chǎn)生用于實驗研究和治療目的的iPSCs中應(yīng)當是非常有用的。
在這項研究中，Rana實驗室研究生Zhonghan Li著手尋找可能加快產(chǎn)生iPSCs過程的激酶抑制劑。利用斯坦福-伯納姆醫(yī)學研究所康拉德-普利貝斯化學基因組中心(Conrad Prebys Center for Chemical Genomics)提供的240多種抑制激酶的化合物，Li費力地將它們一個接一個地加入到他培養(yǎng)的細胞中然后等待觀察會有什么發(fā)生。幾種激酶抑制劑產(chǎn)生更加多的iPSCs，在某些情形下，對于培養(yǎng)它們的小盤子而言，能夠產(chǎn)生太多的iPSCs。特別地，最為強效的抑制劑靶向三種激酶：AurkA、P38和IP3K。
在其他同事的幫助下，Rana和Li還證實了這些發(fā)現(xiàn)的特異性，甚至確定了一種抑制劑發(fā)揮有益作用背后的機制。
Rana說，“我們發(fā)現(xiàn)操縱這些激酶的活性能夠顯著性地增加細胞重編程效率。不過，更重要的是，我們也對重編程的分子機制提供了新的深入認識，并且揭示出這些激酶的新功能。我們希望這些發(fā)現(xiàn)將促進人們進一步篩選可能在iPSC療法中有用的小分子?！?/p>

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