日本研究人員發(fā)現(xiàn)防止iPS細(xì)胞癌變的方法(如何提高iPS細(xì)胞的制備效率)

日本研究人員發(fā)現(xiàn)防止iPS細(xì)胞癌變的方法

日本慶應(yīng)義塾大學(xué)日前發(fā)布公報(bào)稱，該校研究人員發(fā)現(xiàn)一種防止誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）在再生醫(yī)療應(yīng)用中發(fā)生癌變的方法，且已在脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)鼠身上確認(rèn)效果。這一研究有助于提高iPS細(xì)胞在再生醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用的安全性。

iPS細(xì)胞是體細(xì)胞經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)因子處理后轉(zhuǎn)化而成的干細(xì)胞，其功能與胚胎干細(xì)胞類似，具有發(fā)育成多種組織細(xì)胞的潛力，在再生醫(yī)療應(yīng)用中備受期待。例如，iPS細(xì)胞可分化為神經(jīng)干細(xì)胞，進(jìn)而分化成各種神經(jīng)細(xì)胞，可用于治療脊髓損傷。但在利用iPS細(xì)胞進(jìn)行再生移植的過(guò)程中，容易發(fā)生細(xì)胞過(guò)度增殖，導(dǎo)致癌變。

慶應(yīng)義塾大學(xué)醫(yī)學(xué)部教授岡野榮之等人發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)與細(xì)胞的多樣分化和自我復(fù)制能力有密切關(guān)系，因此他們?cè)跒榧顾钃p傷的實(shí)驗(yàn)鼠移植由iPS細(xì)胞分化的神經(jīng)干細(xì)胞前，利用一種名為γ－分泌酶抑制劑的藥物來(lái)抑制Notch信號(hào)，成功預(yù)防了移植細(xì)胞的癌變，幫助實(shí)驗(yàn)鼠重構(gòu)了脊髓神經(jīng)回路，并實(shí)現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)機(jī)能的恢復(fù)和維持。

同時(shí)，移植前沒(méi)有經(jīng)過(guò)上述藥物處理的對(duì)照組實(shí)驗(yàn)鼠，在移植后發(fā)生了細(xì)胞異常增殖，一度恢復(fù)的運(yùn)動(dòng)機(jī)能又再次下降。

研究人員認(rèn)為，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于實(shí)現(xiàn)來(lái)自iPS細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞移植臨床應(yīng)用具有重要意義，也有助于提高其他來(lái)自iPS細(xì)胞的細(xì)胞移植的安全性。相關(guān)研究成果已發(fā)表在美國(guó)專業(yè)期刊《干細(xì)胞報(bào)告》網(wǎng)頁(yè)版上。

如何提高iPS細(xì)胞的制備效率

經(jīng)過(guò)了漫長(zhǎng)又短暫的發(fā)展，iPS細(xì)胞技術(shù)已經(jīng)取得了舉世矚目的進(jìn)展。一個(gè)個(gè)突破性的成果既給我們帶來(lái)了喜悅，也帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)，細(xì)胞重編程有望迎來(lái)一個(gè)新的研究浪潮。盡管iPS細(xì)胞有著誘人的應(yīng)用前景，然而，未來(lái)iPS細(xì)胞的研究也面臨著許多亟需解決的問(wèn)題，首要就是制備效率。

1. 基因的阻斷
自從iPS細(xì)胞發(fā)現(xiàn)以來(lái)，科學(xué)家們已經(jīng)通過(guò)導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子成功地將多種體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞，但誘導(dǎo)效率很低一直是iPS技術(shù)的主要障礙。轉(zhuǎn)錄因子c-Myc是一種原癌基因，人們?cè)噲D將這一基因去除以降低致癌性，然而，c-Myc去除后致癌性雖然降低了，誘導(dǎo)效率卻更低了。2009年9月，Hong等H
J發(fā)現(xiàn)，去除c-Myc基因后用siRNA
阻斷一個(gè)名為p53的基因，可以將皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPS細(xì)胞的成功率提高至10％左右，大約是原有轉(zhuǎn)化率的百倍。研究證明，p53是調(diào)控細(xì)胞程序重排的關(guān)鍵因子，它關(guān)系到轉(zhuǎn)化效率的高低。DNA芯片的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小鼠和人的成纖維細(xì)胞中有34個(gè)與p53調(diào)節(jié)有關(guān)的基因，對(duì)這些基因的功能分析表明，阻斷p53—p21通路不僅提高了iPS細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，也降低了iPS
的致癌性。更為重要的是，沉默p53基因不僅可用于病毒載體誘導(dǎo)技術(shù)，而且對(duì)質(zhì)?；蚴堑鞍渍T導(dǎo)轉(zhuǎn)化的技術(shù)也同樣可行。

2. 協(xié)同作用
北京大學(xué)鄧宏魁教授在誘導(dǎo)人iPS細(xì)胞時(shí)，篩選了一系列的相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)p53基因的干涉小RNA和基因的導(dǎo)入可以協(xié)同作用，將iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率提高近100倍，即使不用原癌基因c-Myc，也能高效、穩(wěn)定地誘導(dǎo)人iPS細(xì)胞的形成。

3. 脂肪干細(xì)胞的誘導(dǎo)
斯坦福大學(xué)研究人員Sun等l5州發(fā)現(xiàn)，與皮膚成纖維細(xì)胞相比，脂肪干細(xì)胞(Humanadipose stem
cells，hASCs)更容易被誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞，且產(chǎn)生的iPS細(xì)胞安全性更高。他們發(fā)現(xiàn)，在脂肪干細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞中分別加人能夠編碼4種轉(zhuǎn)錄因子的基因后，約有萬(wàn)分之一的皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閕PS細(xì)胞，而轉(zhuǎn)變?yōu)閕PS細(xì)胞的脂肪干細(xì)胞比例達(dá)到2％。，是前者的20倍。誘導(dǎo)iPS細(xì)胞涉及的4種轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、Klf4和c—Myc)在皮膚成纖維細(xì)胞中基本不表達(dá)或表達(dá)水平很低。脂肪干細(xì)胞內(nèi)兩種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平高于皮膚成纖維細(xì)胞，這表明，在初始狀態(tài)下，脂肪干細(xì)胞更容易被誘導(dǎo)。利用脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞能夠分化成人體內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞以及腸上皮細(xì)胞等。此外，利用脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)iPS細(xì)胞不需要飼養(yǎng)細(xì)胞，這無(wú)疑提高了其安全性。因hASCs為iPS細(xì)胞提供了更好的體細(xì)胞來(lái)源，將來(lái)當(dāng)iPS細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療時(shí)，可選擇適當(dāng)?shù)墓w細(xì)胞種類，既保證了較高的誘導(dǎo)效率也提高iPS細(xì)胞的安全性。

4. iPS細(xì)胞誘導(dǎo)的氧環(huán)境
培養(yǎng)環(huán)境的氧濃度對(duì)iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率也有影響。Yamanaka等人發(fā)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)的干細(xì)胞總是集中于氧氣相對(duì)少的地方，于是，他們?cè)诶萌梭w皮膚細(xì)胞培養(yǎng)iPS細(xì)胞時(shí)把培養(yǎng)環(huán)境的氧濃度從通常的21％降到5％，發(fā)現(xiàn)iPS細(xì)胞的生成效率可提高到原來(lái)的2．5倍至4．2倍。但如果進(jìn)一步降低氧濃度到1％，就會(huì)適得其反導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡。誘導(dǎo)鼠的皮膚細(xì)胞時(shí)同樣也驗(yàn)證了5％的氧濃度是最合適的。因此，他們認(rèn)為，通過(guò)降低培養(yǎng)環(huán)境的氧濃度，并且使用細(xì)胞癌變可能性較小的培養(yǎng)方法，就可高效地獲取更高品質(zhì)的iPS細(xì)胞。2009年10月，美國(guó)斯克里普斯研究所丁盛博士領(lǐng)導(dǎo)的研究小組

將焦點(diǎn)集中在了可生成結(jié)締組織的成纖維細(xì)胞生成的自然過(guò)程一間質(zhì)一上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的研究上，他們發(fā)現(xiàn)兩種化學(xué)物質(zhì)的組合，在促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成干細(xì)胞方面的效用最高，比傳統(tǒng)方法的效率高100倍。隨后，研究人員又鎖定了一種名為Thiazovivi的新型化合物，可提高效率200倍，同時(shí)將轉(zhuǎn)化周期由原來(lái)的4周縮短到2周
。

5. 添加物的作用
2009年12月，中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院裴端卿帶領(lǐng)的研究小組另辟蹊徑，將研究方向放到細(xì)胞外環(huán)境一培養(yǎng)基成分上，通過(guò)在培養(yǎng)過(guò)程中添加維生素C可使iPS誘導(dǎo)效率提高10倍，并通過(guò)老鼠和人細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時(shí)添加維生素C可促進(jìn)相關(guān)基因表達(dá)推動(dòng)體細(xì)胞進(jìn)入重編程狀態(tài)。他們用縝密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)證明了外因在iPS中具有重要作用。此外，美國(guó)哈佛大學(xué)研究人員還發(fā)現(xiàn)，添加特殊的化合物可將體細(xì)胞誘導(dǎo)iPS的效率提高100多倍

。在誘導(dǎo)過(guò)程中，他們使用了4種遺傳基因，同時(shí)加入了7種包括可阻礙特定蛋白質(zhì)合成的化合物，結(jié)果顯示，沒(méi)有添加化合物時(shí)，遺傳基因的導(dǎo)入效率為0．01％～0.05％，而加入了一種叫“巴爾普羅酸”的蛋白質(zhì)合成阻礙劑之后，導(dǎo)人效率競(jìng)升至9．6％～14％。同時(shí)，最新的報(bào)道也發(fā)現(xiàn)，丁酸鹽處理可以顯著提高人iPS誘導(dǎo)效率。

誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞的特性和作用

iPS細(xì)胞同樣具有自我更新和分化的全能性，從日本科學(xué)家ShinyaYamanaka于2006年第一次發(fā)現(xiàn)這一技術(shù)到現(xiàn)在，科學(xué)家已經(jīng)成功從小鼠，大鼠，獼猴，豬和人的體細(xì)胞中誘導(dǎo)并獲得iPS細(xì)胞，而且誘導(dǎo)技術(shù)也產(chǎn)生了巨大的革新，減少外源轉(zhuǎn)錄因子，使用非整合病毒，質(zhì)粒法等等都能夠產(chǎn)生iPS細(xì)胞，最近，有報(bào)道稱利用純蛋白的方法也可以獲得iPS細(xì)胞。iPS技術(shù)具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值，利用iPS技術(shù)能夠獲得病人或者疾病特異的多能性干細(xì)胞，這樣可以避免移植過(guò)程中的免疫排斥問(wèn)題，也繞開(kāi)了人類胚胎干細(xì)胞研究所帶來(lái)的倫理問(wèn)題。
此外，掌握疾病特異性iPS細(xì)胞向相應(yīng)疾病中的功能細(xì)胞定向誘導(dǎo)的技術(shù)方法，以此作為模型研究這些疾病的發(fā)病機(jī)制，利用以上疾病模型，對(duì)現(xiàn)有藥物做出個(gè)體化的評(píng)估，并發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和篩選新的藥物，將為這些重大性疾病的基礎(chǔ)和臨床研究開(kāi)辟新的研究方法和技術(shù)平臺(tái)。
但是關(guān)于人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究還處于起步階段，所采用的供體細(xì)胞還僅僅局限在人包皮成纖維細(xì)胞，表皮細(xì)胞，毛囊細(xì)胞等少數(shù)細(xì)胞類型，更為棘手的是，這些細(xì)胞被重編程為iPS細(xì)胞所需要的時(shí)間比較長(zhǎng)（16-35天），效率很低，這大大增加了在這個(gè)過(guò)程中細(xì)胞的變異風(fēng)險(xiǎn)。因此如何找到一種理想的人類體細(xì)胞來(lái)源是所有科學(xué)家都重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。

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