常興團(tuán)隊(duì)Nature,Methods發(fā)布CRISPR新工具

2016年10月05日訊 人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量與人類疾病有關(guān)的單核苷酸變異，其中許多是功能獲得性突變，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氨基酸置換或者形成轉(zhuǎn)錄因子的新結(jié)合位點(diǎn)。然而現(xiàn)有篩選方法（包括CRISPR、CRISPRi和RNAi）只能破壞一個(gè)基因或者改變其表達(dá)水平，難以引入一系列功能獲得性突變進(jìn)行高通量篩選，亟需能有效作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的遺傳多樣化工具。

中科院上海生命科學(xué)院/上海交大醫(yī)學(xué)院健康科學(xué)研究所的研究團(tuán)隊(duì)在Nature Methods雜志上發(fā)表了一項(xiàng)重要研究成果。他們將活化誘導(dǎo)胞嘧啶核苷脫氨酶（AID）與CRISPR-dCas9融合起來，打造了有效的遺傳多樣化工具，以便對(duì)功能性變異進(jìn)行高通量篩選。這篇文章的通訊作者是健康科學(xué)研究所的常興（Xing Chang）研究員。

細(xì)菌一直在與病毒或入侵核酸進(jìn)行斗爭(zhēng)，為此它們演化出了多種防御機(jī)制，CRISPR-Cas9適應(yīng)性免疫系統(tǒng)就是其中之一。規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)CRISPR與內(nèi)切酶Cas9的組合，可以在引導(dǎo)RNA的指引下，靶標(biāo)并切割入侵者的遺傳物質(zhì)。2012年研究者們利用這一特點(diǎn)，將CRISPR系統(tǒng)制成了強(qiáng)大的基因組編輯工具。該系統(tǒng)使用簡(jiǎn)單而且擴(kuò)展性強(qiáng)，很快便受到了研究者們的廣泛歡迎。

喪失核酸酶活性的dCas9依然可以到達(dá)目的地，只是無法進(jìn)行剪切。研究顯示，dCas9-AIDx會(huì)在sgRNA的引導(dǎo)下把胞嘧啶或鳥嘌呤直接變成其它堿基，在指定位點(diǎn)形成一系列變異。與尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑聯(lián)合使用，dCas9-AIDx能將胞嘧啶特異性轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，制造特定點(diǎn)突變。

研究人員在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中用dCas9-AIDx靶標(biāo)BCR-ABL，有效鑒定了賦予細(xì)胞伊馬替尼抗性的已知突變和新突變。研究表明，dCas9-AIDx是一種相當(dāng)實(shí)用的遺傳學(xué)工具，可以在單堿基水平上篩選功能獲得性變異。

上個(gè)月Nature Methods雜志同時(shí)發(fā)表了兩篇精彩的CRISPR研究論文。其中，深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院深圳市第二人民醫(yī)院開發(fā)的CRISPR“信號(hào)傳導(dǎo)器”特別引人注目。深圳大學(xué)的研究人員給sgRNA帶上能識(shí)別特定信號(hào)的改良版核糖開關(guān)，構(gòu)建了基于CRISPR-Cas9的“信號(hào)傳導(dǎo)器”。這種“信號(hào)傳導(dǎo)器”可以根據(jù)外界或內(nèi)部信號(hào)調(diào)控內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路和復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)的定向控制。

PRKAG2心臟綜合征是由PRKAG2基因突變?cè)斐傻某Ｈ旧w顯性遺傳疾病。武漢大學(xué)、中科院和復(fù)旦大學(xué)的研究人員建立了PRKAG2心臟綜合征小鼠模型，并通過CRISPR/Cas9基因組編輯成功校正了小鼠的PRKAG2突變。這項(xiàng)研究于八月三十日發(fā)表在Cell Research雜志上。

內(nèi)切酶經(jīng)過改造可以成為強(qiáng)大的DNA編輯工具，比如ZFN、TALEN、風(fēng)頭正勁的CRISPR-Cas系統(tǒng)和充滿爭(zhēng)議的NgAgo技術(shù)。不過這些技術(shù)都是通過序列識(shí)別來實(shí)現(xiàn)靶向切割的，會(huì)受到序列偏好的限制。南京大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)九月十五日在Genome Biology雜志上發(fā)表了一項(xiàng)突破性成果。他們開發(fā)了結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的DNA編輯新技術(shù)，不再受到靶序列的限制。

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