RNA分子的選擇性剪接或可作為治療肥胖、癌癥的藥物的新靶點

RNA分子的選擇性剪接或可作為治療肥胖、癌癥的藥物的新靶點

2016年10月03日訊 近日，來自肯塔基大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員通過研究鑒別出了小核仁RNA（snoRNAs）的一種新功能，即其能夠調(diào)節(jié)一種名為選擇性剪接（alternative splicing）的基礎(chǔ)細(xì)胞過程，這項研究發(fā)現(xiàn)或?qū)椭_發(fā)治療肥胖和癌癥的新型療法。選擇性剪接能夠使得細(xì)胞通過單一基因制造多種蛋白質(zhì)。

在選擇性剪接過程中，一種名為前體信使RNA（pre-mRNA）（被拼接的分子）是DNA模板間的中間產(chǎn)物，而DNA模板中包含了多種能夠制造蛋白質(zhì)的指令，同時這種蛋白質(zhì)產(chǎn)物最終還能夠被這些指令所產(chǎn)生。在上述過程中，細(xì)胞中的剪接機(jī)器能夠切斷pre-mRNA的片段，隨后其能夠?qū)⑹Ｏ碌钠芜M(jìn)行拼接產(chǎn)生一種成熟的mRNA，而這種mRNA就能夠用來翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，許多pre-mRNA都能以多種方式來進(jìn)行拼接，而且產(chǎn)生的不同的mRNA都能夠用于產(chǎn)生獨特的突變體蛋白。

但大多數(shù)mRNA并不能產(chǎn)生蛋白質(zhì)，在這些所謂的非編碼RNAs中都是一些小核仁RNA，其能夠知道特定的RNA修飾蛋白進(jìn)入到自己的“工作崗位”，讓研究者好奇的是，有些小核仁RNA的缺失被認(rèn)為和某些疾病的發(fā)生有關(guān)，比如特定的癌癥或普拉德-威利綜合征等，普拉德-威利綜合征是一種遺傳性的肥胖疾病，這些關(guān)聯(lián)都表明，小核仁RNA所干的事情或許要比直接進(jìn)行RNA修飾要多得多。

文章中，研究者發(fā)現(xiàn)，某些小核仁RNA能夠與一些新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞伙伴來合作共同調(diào)節(jié)選擇性剪接過程，由于選擇性剪接能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能，因此研究者推測，小核仁RNA的角色或許就能夠解釋為何特定小核仁RNA的缺失會和疾病發(fā)生關(guān)聯(lián)。如果缺失小核仁RNA是引發(fā)某些疾病的原因，那么研究者就假設(shè)，如果能夠利用合成性的替代品來移除缺失的小核仁RNA或許就能夠有效治療某些疾病。此前研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)了一種名為SNORD115的小核仁RNA，其并不會在普拉德-威利綜合征患者機(jī)體中產(chǎn)生，但其卻能夠調(diào)節(jié)血清素2C受體的pre-mRNA進(jìn)行選擇性剪接，由于該受體參與了食欲的控制及飲食的攝入，因此研究者表示，選擇性剪接誘導(dǎo)的功能改變或許就能夠誘發(fā)普拉德-威利綜合征患者過度攝食，隨后研究者計劃深入研究來確定是否替代SNORD115就能夠成功治療患者的癥狀。

研究者Stamm表示，為了阻斷患者過度飲食的行為，我們尋找了一種方法來替代小核仁RNA，最終我們找到了一種寡核苷酸（斷鏈RNA），其能夠模擬自然發(fā)生的小核仁RNA的效應(yīng)。當(dāng)研究人員在動物模型中檢測這種寡核苷酸時，他們發(fā)現(xiàn)，接受寡核苷酸的動物攝食量相比對照組明顯減少了；這就表明，在選擇性剪接的水平下食物的消耗能夠被調(diào)節(jié)，而且研究者還能夠利用RNA寡核苷酸來干擾整個系統(tǒng)。

因此帕-魏二氏綜合征患者機(jī)體中缺失的小核仁RNA或許就能夠幫助研究人員開發(fā)新型療法來治療疾病，而且該研究還能夠幫助開發(fā)多種治療罕見遺傳障礙的策略；普拉德-威利綜合征是一種遺傳性疾病，該病是正常肥胖的“擴(kuò)大”版，基于本文研究結(jié)果，研究者希望后期通過更為深入的研究來開發(fā)出治療一般人群肥胖的新療法。

生物電化學(xué)的研究領(lǐng)域

近幾十年來生物電化學(xué)發(fā)展非常迅速 ，其研究分別在分子、細(xì)胞和生物組織等三個不同層次上進(jìn)行。目前的研究領(lǐng)域主要有以下幾個方面：
1.生物膜與生物界面模擬研究
主要研究膜的電化學(xué)熱力學(xué)性質(zhì)、物質(zhì)的跨膜傳輸和生物電的傳遞等現(xiàn)象。
(1)SAM膜模擬生物膜的電化學(xué)研究
SAM是基于長鏈有機(jī)分子在基底材料表面的強烈化學(xué)結(jié)合和有機(jī)分子鏈間相互作用自發(fā)吸附在固/液或氣/固界面,形成的熱力學(xué)穩(wěn)定、能量最低的有序膜。在單分子層中分子定向、有序、緊密地排列在一起,并且膜的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)可以通過改變分子的頭基、尾基以及鏈的類型和長度來調(diào)節(jié)。因此，SAM成為研究各種復(fù)雜界面現(xiàn)象，如膜的滲透性、摩擦、磨損、濕潤、粘結(jié)、腐蝕、生物發(fā)酵、表面電荷分布以及電子轉(zhuǎn)移理論的理想模型體系。有關(guān)SAM的電化學(xué)主要是用電化學(xué)方法研究SAM的絕對覆蓋量、缺陷分布、厚度、離子通透性、表面電勢分布、電子轉(zhuǎn)移等。利用SAM可研究溶液中的氧化還原物種與電極間的跨膜(跨SAM)電子轉(zhuǎn)移,以及電活性SAM本身與電極間的電子轉(zhuǎn)移。在膜電化學(xué)中，硫醇類化合物在金電極表面形成的SAM是最典型的和研究最多的體系。因為長鏈硫醇類化合物在分子尺寸、組織模型和膜的自然形成三方面很類似于天然的生物雙層膜，同時它具有分子識別功能和選擇性響應(yīng),且穩(wěn)定性高。所以硫醇類化合物在金電極上形成的SAM對仿生研究有重要意義。例如可用SAM表面分子的選擇性來研究蛋白質(zhì)的吸附作用；以烷基硫醇化合物在金上的SAM膜為基體研究氧化還原蛋白質(zhì)中電子的長程和界面轉(zhuǎn)移機(jī)制等；在硫醇SAM上沉積磷脂可較容易地構(gòu)造雙層磷脂膜，以SAM來模擬雙層磷脂膜的準(zhǔn)生物環(huán)境和酶的固定化使酶進(jìn)行直接電子轉(zhuǎn)移已在生物傳感器的研究中得到應(yīng)用。如以胱氨酸或半胱氨酸為SAM,通過縮合反應(yīng)鍵合上媒介體(如TCNQ、二茂鐵、醌類等)和酶可構(gòu)成測葡萄糖、谷胱甘肽、膽紅素、蘋果酸等的多種生物傳感器。
(2)　液/液界面模擬生物膜的電化學(xué)研究
所謂液/液(L/L)界面是指在兩種互不相溶的電解質(zhì)溶液之間形成的界面,又稱為油/水(O/W)界面。有關(guān)L/L界面電化學(xué)的研究范圍很廣,包括L/L界面雙電層、L/L界面上的電荷轉(zhuǎn)移機(jī)理及動力學(xué)、生物膜模擬、以及電化學(xué)分析應(yīng)用等。L/L界面可以看作與周圍電解質(zhì)接觸的半個生物膜模型。生物膜是一種極性端分別朝細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外水溶液的磷脂自組裝結(jié)構(gòu),磷脂的親脂鏈形成像油一樣的膜內(nèi)層。因此,從某種意義上來說,吸附著磷脂單分子層的L/L界面非常接近于生物膜/水溶液界面。磷脂是非常理想的實驗材料,它能很好地吸附在L/L界面上。電荷或電勢和磷脂單分子層表面張力之間的偶聯(lián)作用被認(rèn)為是細(xì)胞和細(xì)胞中類脂質(zhì)運動的基本驅(qū)動力?？梢?L/L界面生物電化學(xué)是一很有生命力的研究領(lǐng)域,將繼續(xù)受到人們的廣泛重視。
生物細(xì)胞膜是一種特殊類型的半透膜。
細(xì)胞膜對K+Cl-Na+等離子的通透性也不相同。
細(xì)胞膜內(nèi)外的K+Cl-Na+等離子的濃度不同，因此產(chǎn)生的膜電勢稱為(細(xì)胞)生物膜電勢。
不同的電流通過動物細(xì)胞膜，死的細(xì)胞和活的細(xì)胞的表現(xiàn)不同。
2.生物電化應(yīng)用技術(shù)
由于生命現(xiàn)象與電化學(xué)過程密切相關(guān),因此電化學(xué)方法在生命科學(xué)中得到廣泛應(yīng)用，主要有：電脈沖基因直接導(dǎo)入、電場加速作物生長、癌癥的電化學(xué)療法、電化學(xué)控制藥物釋放、在體研究的電化學(xué)方法、生物分子的電化學(xué)行為、血栓和心血管疾病的電化學(xué)研究、骨骼的電生長、心電圖和腦電圖的研究、生物電池等。
電脈沖基因直接導(dǎo)入是基于帶負(fù)電的質(zhì)粒DNA或基因片斷在高壓脈沖電場的作用下被加速“射”向受體細(xì)胞,同時在電場作用下細(xì)胞膜的滲透率增加(介電擊穿效應(yīng)),使基因能順利導(dǎo)入受體細(xì)胞。由于細(xì)胞膜的電擊穿的可逆性,除去電場,細(xì)胞膜及其所有的功能都能恢復(fù)。此法已在分子生物學(xué)中得到應(yīng)用。細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率高，可達(dá)每微克DNA1010個轉(zhuǎn)化體,是用化學(xué)方法制備的感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率的10～20倍。
電場加速作物生長是很新的研究課題。Matsuzaki等報道過玉米和大豆苗在含0.5mmol/l K2SO4培養(yǎng)液中培養(yǎng),同時加上20Hz,3V或4V(峰 峰)的電脈沖，6天后與對照組相比，秧苗根須發(fā)達(dá)，生長明顯加速。其原因可能是電場激勵了生長代謝的離子泵作用。
癌癥的電化學(xué)療法是瑞典放射醫(yī)學(xué)家Nordenstrom開創(chuàng)的治療癌癥的新方法。其原理是:在直流電場作用下，引起癌灶內(nèi)一系列生化變化,使其組織代謝發(fā)生紊亂，蛋白質(zhì)變性、沉淀壞死，導(dǎo)致癌細(xì)胞破滅。一般是將鉑電極正極置于癌灶中心部位，周圍扎上1～5根鉑電極作負(fù)極，加上6～10V的電壓，控制電流為30～100mA，治療時間2～6小時，電量為每厘米直徑癌灶100～150庫侖。此療法已推廣用于肝癌、皮膚癌等的治療。對體表腫瘤的治療尤為簡便、有效。
控制藥物釋放技術(shù)是指在一定時間內(nèi)控制藥物的釋放速度、釋放地點，以獲得最佳藥效，同時緩慢釋放有利于降低藥物毒性。電化學(xué)控制藥物釋放是一種新的釋放藥物的方法，這種方法是把藥物分子或離子結(jié)合到聚合物載體上，使聚合物載體固定在電極表面，構(gòu)成化學(xué)修飾電極，再通過控制電極的氧化還原過程使藥物分子或離子釋放到溶液中。藥物在載體聚合物上的負(fù)載方式分為共價鍵合型和離子鍵合型負(fù)載兩類。共價鍵合負(fù)載是通過化學(xué)合成將藥物分子以共價鍵方式鍵合到聚合物骨架上，然后利用涂層法將聚合物固定在固體電極表面形成聚合物膜修飾電極，在氧化或還原過程中藥物分子與聚合物之間的共價鍵斷裂，使得藥物分子從膜中釋放出來。離子鍵合負(fù)載是利用電活性導(dǎo)電聚合物如聚吡咯、聚苯胺等在氧化或還原過程中伴隨有作為平衡離子的對離子的嵌入將藥物離子負(fù)載到聚合物膜中，再通過還原或氧化使藥物離子從膜中釋放出來。
在體研究是生理學(xué)研究的重要方法，其目的在于從整體水平上認(rèn)識細(xì)胞、組織、器官的功能機(jī)制及其生理活動規(guī)律。由于一些神經(jīng)活性物質(zhì)(神經(jīng)遞質(zhì))具有電化學(xué)活性,因此電化學(xué)方法首先被用于腦神經(jīng)系統(tǒng)的在體研究。當(dāng)采用微電極插入動物腦內(nèi)進(jìn)行活體伏安法測定獲得成功后，立即引起了人們的極大興趣。該技術(shù)經(jīng)過不斷的改善,被公認(rèn)為在正常生理狀態(tài)下跟蹤監(jiān)測動物大腦神經(jīng)活動最有效的方法。通常可檢測的神經(jīng)遞質(zhì)有多巴胺、去甲腎上腺素、5-羥色胺及其代謝產(chǎn)物。微電極伏安法成為連續(xù)監(jiān)測進(jìn)入細(xì)胞間液中原生性神經(jīng)遞質(zhì)的有力工具。在體研究一般采用快速循環(huán)伏安法(每秒上千伏)和快速計時安培法?？焖傺h(huán)伏安法還被用于研究單個神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)遞質(zhì)釋放的研究,發(fā)展成為所謂的“細(xì)胞電化學(xué)”。
生物分子的電化學(xué)行為的研究是生物電化學(xué)的一個基礎(chǔ)研究領(lǐng)域,其研究目的在于獲取生物分子氧化還原電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的機(jī)理,以及生物分子電催化反應(yīng)機(jī)理,為正確了解生物活性分子的生物功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。所研究的生物分子包括小分子如氨基酸、生物堿、輔酶、糖類等和生物大分子如氧化還原蛋白、RNA、DNA、多糖等。
3.電化學(xué)生物傳感器和生物分子器件 傳感器與通信系統(tǒng)和計算機(jī)共同構(gòu)成現(xiàn)代信息處理系統(tǒng)。傳感器相當(dāng)于人的感官,是計算機(jī)與自然界及社會的接口,是為計算機(jī)提供信息的工具。
傳感器通常由敏感(識別)元件、轉(zhuǎn)換元件、電子線路及相應(yīng)結(jié)構(gòu)附件組成。生物傳感器是指用固定化的生物體成分(酶、抗原、抗體、激素等)或生物體本身(細(xì)胞、細(xì)胞器、組織等)作為感元件的傳感器。電化學(xué)生物傳感器則是指由生物材料作為敏感元件，電極(固體電極、離子選擇性電極、氣敏電極等)作為轉(zhuǎn)換元件，以電勢或電流為特征檢測信號的傳感器。由于使用生物材料作為傳感器的敏感元件，所以電化學(xué)生物傳感器具有高度選擇性，是快速、直接獲取復(fù)雜體系組成信息的理想分析工具。一些研究成果已在生物技術(shù)、食品工業(yè)、臨床檢測、醫(yī)藥工業(yè)、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境分析等領(lǐng)域獲得實際應(yīng)用。
根據(jù)敏感元件所用生物材料的不同，電化學(xué)生物傳感器分為酶電極傳感器、微生物電極傳感器、電化學(xué)免疫傳感器、組織電極與細(xì)胞器電極傳感器、電化學(xué)DNA傳感器等。
(1)酶電極傳感器
以葡萄糖氧化酶(GOD)電極為例簡述其工作原理。在GOD的催化下，葡萄糖(C6H12O6)被氧氧化生成葡萄糖酸(C6H12O6)和過氧化氫。根據(jù)上述反應(yīng),顯然可通過氧電極(測氧的消耗)、過氧化氫電極(測H2O2的產(chǎn)生)和PH電極(測酸度變化)來間接測定葡萄糖的含量。因此只要將GOD固定在上述電極表面即可構(gòu)成測葡萄糖的GOD傳感器。這便是所謂的第一代酶電極傳感器。這種傳感器由于是間接測定法,故干擾因素較多。第二代酶電極傳感器是采用氧化還原電子媒介體在酶的氧化還原活性中心與電極之間傳遞電子。第二代酶電極傳感器可不受測定體系的限制,測量濃度線性范圍較寬,干擾少。現(xiàn)在不少研究者又在努力發(fā)展第三代酶電極傳感器,即酶的氧化還原活性中心直接和電極表面交換電子的酶電極傳感器。
目前已有的商品酶電極傳感器包括:GOD電極傳感器、L-乳酸單氧化酶電極傳感器、尿酸酶電極傳感器等。 (2)微生物電極傳感器
將微生物(常用的主要是細(xì)菌和酵母菌)作為敏感材料固定在電極表面構(gòu)成的電化學(xué)生物傳感器稱為微生物電極傳感器。其工作原理大致可分為三種類型：其一，利用微生物體內(nèi)含有的酶(單一酶或復(fù)合酶)系來識別分子，這種類型與酶電極類似；其二，利用微生物對有機(jī)物的同化作用，通過檢測其呼吸活性(攝氧量)的提高，即通過氧電極測量體系中氧的減少間接測定有機(jī)物的濃度；其三，通過測定電極敏感的代謝產(chǎn)物間接測定一些能被厭氧微生物所同化的有機(jī)物。
微生物電極傳感器在發(fā)酵工業(yè)、食品檢驗、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域都有應(yīng)用。例如；在食品發(fā)酵過程中測定葡萄糖的佛魯奧森假單胞菌電極；測定甲烷的鞭毛甲基單胞菌電極；測定抗生素頭孢菌素的Citrobacterfreudii菌電極等等。微生物電極傳感器由于價廉、使用壽命長而具有很好的應(yīng)用前景,然而它的選擇性和長期穩(wěn)定性等還有待進(jìn)一步提高。
(3)電化學(xué)免疫傳感器
抗體對相應(yīng)抗原具有唯一性識別和結(jié)合功能。電化學(xué)免疫傳感器就是利用這種識別和結(jié)合功能將抗體或抗原和電極組合而成的檢測裝置。電化學(xué)免疫傳感器從結(jié)構(gòu)上可分為直接型和間接型兩類。直接型的特點是在抗體與其相應(yīng)抗原識別結(jié)合的同時將其免疫反應(yīng)的信息直接轉(zhuǎn)變成電信號。這類傳感器在結(jié)構(gòu)上可進(jìn)一步分為結(jié)合型和分離型兩種。前者是將抗體或抗原直接固定在電極表面上，傳感器與相應(yīng)的抗體或抗原發(fā)生結(jié)合的同時產(chǎn)生電勢改變；后者是用抗體或抗原制作抗體膜或抗原膜，當(dāng)其與相應(yīng)的配基反應(yīng)時，膜電勢發(fā)生變化，測定膜電勢的電極與膜是分開的。間接型的特點是將抗原和抗體結(jié)合的信息轉(zhuǎn)變成另一種中間信息,然后再把這個中間信息轉(zhuǎn)變成電信號。這類傳感器在結(jié)構(gòu)上也可進(jìn)一步分為兩種類型：結(jié)合型和分離型。前者是將抗體或抗原固定在電極上；而后者抗體或抗原和電極是完全分開的。間接型電化學(xué)免疫傳感器通常是采用酶或其他電活性化合物進(jìn)行標(biāo)記，將被測抗體或抗原的濃度信息加以化學(xué)放大，從而達(dá)到極高的靈敏度。
電化學(xué)免疫傳感器的例子有：診斷早期妊娠的HCG免疫傳感器；診斷原發(fā)性肝癌的甲胎蛋白(AFP)免疫傳感器；測定人血清蛋白(HSA)免疫傳感器；還有IgG免疫傳感器、胰島素免疫傳感器等等。
(4)組織電極與細(xì)胞器電極傳感器
直接采用動植物組織薄片作為敏感元件的電化學(xué)傳感器稱組織電極傳感器，其原理是利用動植物組織中的酶，優(yōu)點是酶活性及其穩(wěn)定性均比離析酶高，材料易于獲取，制備簡單，使用壽命長等。但在選擇性、靈敏度、響應(yīng)時間等方面還存在不足。
動物組織電極主要有：腎組織電極、肝組織電極、腸組織電極、肌肉組織電極、胸腺組織電極等。 植物組織電極敏感元件的選材范圍很廣，包括不同植物的根、莖、葉、花、果等。植物組織電極制備比動物組織電極更簡單，成本更低并易于保存。 細(xì)胞器電極傳感器是利用動植物細(xì)胞器作為敏感元件的傳感器。細(xì)胞器是指存在于細(xì)胞內(nèi)的被膜包圍起來的微小“器官”，如線粒體、微粒體、溶酶體、過氧化氫體、葉綠體、氫化酶顆粒、磁粒體等等。其原理是利用細(xì)胞器內(nèi)所含的酶(往往是多酶體系)。
(5)電化學(xué)DNA傳感器
電化學(xué)DNA傳感器是近幾年迅速發(fā)展起來的一種全新思想的生物傳感器。其用途是檢測基因及一些能與DNA發(fā)生特殊相互作用的物質(zhì)。電化學(xué)DNA傳感器是利用單鏈DNA(ssDNA)或基因探針作為敏感元件固定在固體電極表面，加上識別雜交信息的電活性指示劑(稱為雜交指示劑)共同構(gòu)成的檢測特定基因的裝置。其工作原理是利用固定在電極表面的某一特定序列的ssDNA與溶液中的同源序列的特異識別作用(分子雜交)形成雙鏈DNA(dsDNA)(電極表面性質(zhì)改變)，同時借助一能識ssDNA和dsDNA的雜交指示劑的電流響應(yīng)信號的改變來達(dá)到檢測基因的目的。
4.生物能學(xué)和代謝過程
包括酶催化的氧化還原反應(yīng)的力能學(xué)、線粒體呼吸鏈、光氧化還原反應(yīng)和光合作用。光合作用作為整個過程，包括了吸收光子后的電子激發(fā)過程、膜電位的產(chǎn)生、電子和質(zhì)子的轉(zhuǎn)移過程，以及隨后的一系列代謝反應(yīng)。
生物電化學(xué)研究手段目前除了采用傳統(tǒng)的電化學(xué)方法外，電化學(xué)紫外可見光譜、電化學(xué)現(xiàn)場紅外光譜、電化學(xué)現(xiàn)場拉曼光譜、X射線衍射、掃描探針技術(shù)、電化學(xué)石英晶體微天平等方法得到廣泛應(yīng)用。
生物材料敏感元件+電極轉(zhuǎn)換元件
例如：酶電極傳感器
以葡萄糖氧化酶(GOD)電極為例
其工作原理為:在GOD的催化下，葡萄糖(C6H12O6)
被氧氧化，生成葡萄糖酸(C6H12O7)和過氧化氫。
反應(yīng)式
根據(jù)上述反應(yīng),可以通過測量氧的消耗(氧電極),或者過氧化氫的產(chǎn)生(過氧化氫電極)等,間接測量葡萄糖的含量。
這就是所謂的第一代酶電極傳感器，目前種類很多，包括用于檢測司機(jī)是否飲酒的。乙醇氧化酶電極傳感器。
專利技術(shù)：將乙醇氧化酶電極傳感器與汽車的點火裝置相連
細(xì)胞膜水通道，以及離子通道結(jié)構(gòu)和機(jī)理 2003年的NOBEL化學(xué)獎介紹
彼得·阿格雷：美國科學(xué)家。1949年生于美國明尼蘇達(dá)州小城諾斯菲爾德，1974年在巴爾的摩約翰斯·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院獲醫(yī)學(xué)博士學(xué)位，現(xiàn)為該學(xué)院生物化學(xué)教授和醫(yī)學(xué)教授。 羅德里克·麥金農(nóng)：美國科學(xué)家。1956年出生，在美國波士頓附近的小鎮(zhèn)伯靈頓長大，1982年在塔夫茨醫(yī)學(xué)院獲醫(yī)學(xué)博士學(xué)位，現(xiàn)為洛克菲勒大學(xué)分子神經(jīng)生物學(xué)和生物物理學(xué)教授。
生物電化學(xué)
科學(xué)貢獻(xiàn)
他們發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞膜水通道，以及對離子通道結(jié)構(gòu)和機(jī)理研究作出了開創(chuàng)性貢獻(xiàn)。這是個重大發(fā)現(xiàn)，開啟了細(xì)菌、植物和哺乳動物水通道的生物化學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)研究之門。
對生活的影響
水溶液占人體重量的70%。生物體內(nèi)的水溶液主要由水分子和各種離子組成。它們在細(xì)胞膜通道中的進(jìn)進(jìn)出出可以實現(xiàn)細(xì)胞的很多功能。水分子是如何進(jìn)出人體的細(xì)胞的？了解這一機(jī)理將極大地幫助人們更好地認(rèn)識許多疾病，比如心臟病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。他們的發(fā)現(xiàn)闡明了鹽分和水如何進(jìn)出組成活體的細(xì)胞。比如，腎臟怎么從原尿中重新吸收水分，以及電信號怎么在細(xì)胞中產(chǎn)生并傳遞等等，這對人類探索腎臟、心臟、肌肉和神經(jīng)系統(tǒng)等方面的諸多疾病具有極其重要的意義。
實際上，早在十九世紀(jì)中期，人們就猜想人體細(xì)胞一定存在用以傳輸水分的特別的通道。然而，直到1988年，才由阿格雷在分離一種膜蛋白上獲得成功，約一年后，他明白了這個蛋白一定就是長期以來所尋求的水通道。這一決定性的發(fā)現(xiàn)打開了通向細(xì)菌、植物及哺乳動物體內(nèi)水通道的生物化學(xué)、生理學(xué)以及遺傳學(xué)等完整的系列研究之門。今天，學(xué)者們詳知水分子通過細(xì)胞膜的方式并了解為何只有水分子能穿過而不是其他更小的分子或離子。
現(xiàn)代生物化學(xué)在求解生命過程的基本原理方面已經(jīng)深入到了原子的水平。 另一種類型的膜通道是離子通道。離子通道在神經(jīng)和肌肉應(yīng)激系統(tǒng)中具有重要意義。當(dāng)位于神經(jīng)細(xì)胞表面的離子通道在來自鄰近的神經(jīng)細(xì)胞的化學(xué)信號的作用下而開啟時，會產(chǎn)生一種被稱為神經(jīng)細(xì)胞電壓的作用，于是，一種電脈沖信號就會通過在數(shù)毫秒之內(nèi)開啟和關(guān)閉的離子通道而沿著神經(jīng)細(xì)胞的表面?zhèn)鬟f。麥金農(nóng)在1998年確定了鉀離子通道的空間結(jié)構(gòu)(高分辨率電子顯微鏡)而使整個學(xué)術(shù)界震驚。這項貢獻(xiàn)，使我們現(xiàn)在知道離子可以通過由不同的細(xì)胞信號控制其開啟和關(guān)閉的通道而流動。

RNA干擾的原理是什么？最好有原理圖？

作用機(jī)制：病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時，常產(chǎn)生一些dsRNA。宿主細(xì)胞對這些dsRNA迅即產(chǎn)生反應(yīng)，其胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA，即siRNA。

siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等）結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物。

RISC與外源性基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對這些mRNA的降解反應(yīng)。

siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完全降解。

RNAi的臨床應(yīng)用

RNAi 機(jī)制可作為真核生物的基因組免疫系統(tǒng) , 抑制外源和內(nèi)源有害基因的表達(dá)。人類目前對病毒 ( 如 HIV) 所致疾病缺乏理想的治療方法 , 如果利用 RNAi 技術(shù)把與病毒基因具同源性的 siRNA 引入感染細(xì)胞將會抑制病毒的增殖 , 這為病毒相關(guān)疾病的治療提供了新的思路。

另外 , 利用 RNAi 技術(shù)還可以高效、特異、快速的抑制細(xì)胞內(nèi)癌基因的表達(dá) , 人類的許多癌癥是由于少數(shù)癌基因超表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖所致 , 如果利用 RNAi 技術(shù)抑制過度表達(dá)的癌基因?qū)拱┌Y表型逆轉(zhuǎn)或病程得以控制。

可以預(yù)測 , RNAi 技術(shù)將會很快應(yīng)用于癌癥和病毒疾病的治療 , 并可能會為這些疾病治療帶來突破。

測序相關(guān)知識總結(jié)

高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing，HTS）是對傳統(tǒng)Sanger測序（稱為一代測序技術(shù)）革命性的改變,一次對幾十萬到幾百萬條核酸分子進(jìn)行序列測定, 因此在有些文獻(xiàn)中稱其為下一代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS )足見其劃時代的改變, 同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能, 所以又被稱為深度測序(Deep sequencing)。

Sanger法測序利用一種DNA聚合酶來延伸結(jié)合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應(yīng)構(gòu)成，每個反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團(tuán)，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產(chǎn)物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測。

全基因組重測序是對基因組序列已知的個體進(jìn)行基因組測序，并在個體或群體水平上進(jìn)行差異性分析的方法。隨著基因組測序成本的不斷降低，人類疾病的致病突變研究由外顯子區(qū)域擴(kuò)大到全基因組范圍。通過構(gòu)建不同長度的插入片段文庫和短序列、雙末端測序相結(jié)合的策略進(jìn)行高通量測序，實現(xiàn)在全基因組水平上檢測疾病關(guān)聯(lián)的常見、低頻、甚至是罕見的突變位點，以及結(jié)構(gòu)變異等，具有重大的科研和產(chǎn)業(yè)價值。

de novo測序也稱為從頭測序：其不需要任何現(xiàn)有的序列資料就可以對某個物種進(jìn)行測序，利用生物信息學(xué)分析手段對序列進(jìn)行拼接，組裝，從而獲得該物種的基因組圖譜。獲得一個物種的全基因組序列是加快對此物種了解的重要捷徑。隨著新一代測序技術(shù)的飛速發(fā)展，基因組測序所需的成本和時間較傳統(tǒng)技術(shù)都大大降低，大規(guī)?；蚪M測序漸入佳境，基因組學(xué)研究也迎來新的發(fā)展契機(jī)和革命性突破。利用新一代高通量、高效率測序技術(shù)以及強大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地測定并分析所有生物的基因組序列。

外顯子組測序是指利用序列捕獲技術(shù)將全基因組外顯子區(qū)域DNA捕捉并富集后進(jìn)行高通量測序的基因組分析方法。外顯子測序相對于基因組重測序成本較低，對研究已知基因的SNP、Indel等具有較大的優(yōu)勢，但無法研究基因組結(jié)構(gòu)變異如染色體斷裂重組等。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）是在基因組學(xué)后新興的一門學(xué)科，即研究特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA（包括mRNA和非編碼RNA）的類型與拷貝數(shù)。Illumina提供的mRNA測序技術(shù)可在整個mRNA領(lǐng)域進(jìn)行各種相關(guān)研究和新的發(fā)現(xiàn)。mRNA測序不對引物或探針進(jìn)行設(shè)計，可自由提供關(guān)于轉(zhuǎn)錄的客觀和權(quán)威信息。研究人員僅需要一次試驗即可快速生成完整的poly-A尾的RNA完整序列信息，并分析基因表達(dá)、cSNP、全新的轉(zhuǎn)錄、全新異構(gòu)體、剪接位點、等位基因特異性表達(dá)和罕見轉(zhuǎn)錄等最全面的轉(zhuǎn)錄組信息。簡單的樣品制備和數(shù)據(jù)分析軟件支持在所有物種中的mRNA測序研究。

Small RNA（micro RNAs、siRNAs和 pi RNAs）是生命活動重要的調(diào)控因子，在基因表達(dá)調(diào)控、生物個體發(fā)育、代謝及疾病的發(fā)生等生理過程中起著重要的作用。Illumina能夠?qū)?xì)胞或者組織中的全部Small RNA進(jìn)行深度測序及定量分析等研究。實驗時首先將18-30 nt范圍的Small RNA從總RNA中分離出來，兩端分別加上特定接頭后體外反轉(zhuǎn)錄做成cDNA再做進(jìn)一步處理后，利用測序儀對DNA片段進(jìn)行單向末端直接測序。通過Illumina對Small RNA大規(guī)模測序分析，可以從中獲得物種全基因組水平的miRNA圖譜，實現(xiàn)包括新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的預(yù)測和鑒定、樣品間差異表達(dá)分析、miRNAs聚類和表達(dá)譜分析等科學(xué)應(yīng)用。

成熟的microRNA（miRNA）是17~24nt的單鏈非編碼RNA分子，通過與mRNA相互作用影響目標(biāo)mRNA的穩(wěn)定性及翻譯，最終誘導(dǎo)基因沉默，調(diào)控著基因表達(dá)、細(xì)胞生長、發(fā)育等生物學(xué)過程?；诘诙鷾y序技術(shù)的microRNA測序，可以一次性獲得數(shù)百萬條microRNA序列，能夠快速鑒定出不同組織、不同發(fā)育階段、不同疾病狀態(tài)下已知和未知的microRNA及其表達(dá)差異，為研究microRNA對細(xì)胞進(jìn)程的作用及其生物學(xué)影響提供了有力工具。

染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）也稱結(jié)合位點分析法，是研究體內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的有力工具，通常用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究。將ChIP與第二代測序技術(shù)相結(jié)合的ChIP-Seq技術(shù)，能夠高效地在全基因組范圍內(nèi)檢測與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段。

ChIP-Seq的原理是：首先通過染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，并對其進(jìn)行純化與文庫構(gòu)建；然后對富集得到的DNA片段進(jìn)行高通量測序。研究人員通過將獲得的數(shù)百萬條序列標(biāo)簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內(nèi)與組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等互作的DNA區(qū)段信息。

CHIRP-Seq( Chromatin Isolation by RNA Purification )是一種檢測與RNA綁定的DNA和蛋白的高通量測序方法。方法是通過設(shè)計生物素或鏈霉親和素探針，把目標(biāo)RNA拉下來以后，與其共同作用的DNA染色體片段就會附在到磁珠上，最后把染色體片段做高通量測序，這樣會得到該RNA能夠結(jié)合到在基因組的哪些區(qū)域，但由于蛋白測序技術(shù)不夠成熟，無法知道與該RNA結(jié)合的蛋白。

RNA Immunoprecipitation是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具，能幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)靶點。這種技術(shù)運用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA進(jìn)行測序分析。

RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應(yīng)用，但由于研究對象是RNA-蛋白復(fù)合物而不是DNA-蛋白復(fù)合物，RIP實驗的優(yōu)化條件與ChIP實驗不太相同（如復(fù)合物不需要固定，RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶，抗體需經(jīng)RIP實驗驗證等等）。RIP技術(shù)下游結(jié)合microarray技術(shù)被稱為RIP-Chip，幫助我們更高通量地了解癌癥以及其它疾病整體水平的RNA變化。

CLIP-seq,又稱為HITS-CLIP，即紫外交聯(lián)免疫沉淀結(jié)合高通量測序(crosslinking-immunprecipitation and high-throughput sequencing), 是一項在全基因組水平揭示RNA分子與RNA結(jié)合蛋白相互作用的革命性技術(shù)。其主要原理是基于RNA分子與RNA結(jié)合蛋白在紫外照射下發(fā)生耦聯(lián)，以RNA結(jié)合蛋白的特異性抗體將RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體沉淀之后，回收其中的RNA片段，經(jīng)添加接頭、RT-PCR等步驟，對這些分子進(jìn)行高通量測序，再經(jīng)生物信息學(xué)的分析和處理、總結(jié)，挖掘出其特定規(guī)律，從而深入揭示RNA結(jié)合蛋白與RNA分子的調(diào)控作用及其對生命的意義。

什么是metagenomic（宏基因組）：

Magenomics研究的對象是整個微生物群落。相對于傳統(tǒng)單個細(xì)菌研究來說，它具有眾多優(yōu)勢，其中很重要的兩點：(1)微生物通常是以群落方式共生于某一小生境中，它們的很多特性是基于整個群落環(huán)境及個體間的相互影響的，因此做Metagenomics研究比做單個個體的研究更能發(fā)現(xiàn)其特性；(2) Metagenomics研究無需分離單個細(xì)菌，可以研究那些不能被實驗室分離培養(yǎng)的微生物。

宏基因組是基因組學(xué)一個新興的科學(xué)研究方向。宏基因組學(xué)（又稱元基因組學(xué)，環(huán)境基因組學(xué)，生態(tài)基因組學(xué)等），是研究直接從環(huán)境樣本中提取的基因組遺傳物質(zhì)的學(xué)科。傳統(tǒng)的微生物研究依賴于實驗室培養(yǎng)，元基因組的興起填補了無法在傳統(tǒng)實驗室中培養(yǎng)的微生物研究的空白。過去幾年中，DNA測序技術(shù)的進(jìn)步以及測序通量和分析方法的改進(jìn)使得人們得以一窺這一未知的基因組科學(xué)領(lǐng)域。

10 .什么是SNP、SNV（單核苷酸位點變異）

單核苷酸多態(tài)性singlenucleotide polymorphism，SNP 或單核苷酸位點變異SNV。個體間基因組DNA序列同一位置單個核苷酸變異(替代、插入或缺失)所引起的多態(tài)性。不同物種、個體基因組DNA序列同一位置上的單個核苷酸存在差別的現(xiàn)象。有這種差別的基因座、DNA序列等可作為基因組作圖的標(biāo)志。人基因組上平均約每1000個核苷酸即可能出現(xiàn)1個單核苷酸多態(tài)性的變化，其中有些單核苷酸多態(tài)性可能與疾病有關(guān)，但可能大多數(shù)與疾病無關(guān)。單核苷酸多態(tài)性是研究人類家族和動植物品系遺傳變異的重要依據(jù)。在研究癌癥基因組變異時，相對于正常組織，癌癥中特異的單核苷酸變異是一種體細(xì)胞突變（somatic mutation），稱做SNV。

基因組上小片段（>50bp）的插入或缺失，形同SNP/SNV。

基因組拷貝數(shù)變異是基因組變異的一種形式，通常使基因組中大片段的DNA形成非正常的拷貝數(shù)量。例如人類正常染色體拷貝數(shù)是2，有些染色體區(qū)域拷貝數(shù)變成1或3，這樣，該區(qū)域發(fā)生拷貝數(shù)缺失或增加，位于該區(qū)域內(nèi)的基因表達(dá)量也會受到影響。如果把一條染色體分成A-B-C-D四個區(qū)域，則A-B-C-C-D/A-C-B-C-D/A-C-C-B-C-D/A-B-D分別發(fā)生了C區(qū)域的擴(kuò)增及缺失，擴(kuò)增的位置可以是連續(xù)擴(kuò)增如A-B-C-C-D也可以是在其他位置的擴(kuò)增，如A-C-B-C-D。

染色體結(jié)構(gòu)變異是指在染色體上發(fā)生了大片段的變異。主要包括染色體大片段的插入和缺失（引起CNV的變化），染色體內(nèi)部的某塊區(qū)域發(fā)生翻轉(zhuǎn)顛換，兩條染色體之間發(fā)生重組（inter-chromosome trans-location）等。一般SV的展示利用Circos 軟件。

15.什么是Segment duplication

一般稱為SD區(qū)域，串聯(lián)重復(fù)是由序列相近的一些DNA片段串聯(lián)組成。串聯(lián)重復(fù)在人類基因多樣性的靈長類基因中發(fā)揮重要作用。在人類染色體Y和22號染色體上，有很大的SD序列。

既基因型與表型；一般指某些單核苷酸位點變異與表現(xiàn)形式間的關(guān)系。

17.什么是soft-clipped reads

當(dāng)基因組發(fā)生某一段的缺失，或轉(zhuǎn)錄組的剪接，在測序過程中，橫跨缺失位點及剪接位點的reads回帖到基因組時，一條reads被切成兩段，匹配到不同的區(qū)域，這樣的reads叫做soft-clipped reads，這些reads對于鑒定染色體結(jié)構(gòu)變異及外源序列整合具有重要作用。

由于大部分測序得到的reads較短，一個reads能夠匹配到基因組多個位置，無法區(qū)分其真實來源的位置。一些工具根據(jù)統(tǒng)計模型，如將這類reads分配給reads較多的區(qū)域。

21.什么是Contig N50？

Reads拼接后會獲得一些不同長度的Contigs。將所有的Contig長度相加，能獲得一個Contig總長度。然后將所有的Contigs按照從長到短進(jìn)行排序，如獲得Contig 1，Contig 2，Contig 3...………Contig 25。將Contig按照這個順序依次相加，當(dāng)相加的長度達(dá)到Contig總長度的一半時，最后一個加上的Contig長度即為Contig N50。舉例：Contig 1+Contig 2+ Contig 3+Contig 4=Contig總長度 1/2時，Contig 4的長度即為Contig N50。Contig N50可以作為基因組拼接的結(jié)果好壞的一個判斷標(biāo)準(zhǔn)。值越大，contig越長組裝效果越好，測序效率也就越好了.
給定一組具有其自身長度的重疊群，L50計數(shù)被定義為長度總和占基因組大小一半的重疊群的最小數(shù)量。
21.1 什么是Scaffold N50？
Scaffold N50與Contig N50的定義類似。Contigs拼接組裝獲得一些不同長度的Scaffolds。將所有的Scaffold長度相加，能獲得一個Scaffold總長度。然后將所有的Scaffolds按照從長到短進(jìn)行排序，如獲得Scaffold 1，Scaffold 2，Scaffold 3...………Scaffold 25。將Scaffold按照這個順序依次相加，當(dāng)相加的長度達(dá)到Scaffold總長度的一半時，最后一個加上的Scaffold長度即為Scaffold N50。舉例：Scaffold 1+Scaffold 2+ Scaffold 3 +Scaffold 4 +Scaffold 5=Scaffold總長度 1/2時，Scaffold 5的長度即為Scaffold N50。Scaffold N50可以作為基因組拼接的結(jié)果好壞的一個判斷標(biāo)準(zhǔn)。
22.什么是測序深度和覆蓋度？
測序深度是指測序得到的總堿基數(shù)與待測基因組大小的比值。假設(shè)一個基因大小為2M，測序深度為10X，那么獲得的總數(shù)據(jù)量為20M。覆蓋度是指測序獲得的序列占整個基因組的比例。由于基因組中的高GC、重復(fù)序列等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在，測序最終拼接組裝獲得的序列往往無法覆蓋有所的區(qū)域，這部分沒有獲得的區(qū)域就稱為Gap。例如一個細(xì)菌基因組測序，覆蓋度是98%，那么還有2%的序列區(qū)域是沒有通過測序獲得的。

RPKM,Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads, is defined in thisway [Mortazavi etal., 2008]: 每1百萬個map上的reads中map到外顯子的每1K個堿基上的reads個數(shù)。 假如有1百萬個reads映射到了人的基因組上，那么具體到每個外顯子呢，有多少映射上了呢，而外顯子的長度不一，那么每1K個堿基上又有多少reads映射上了呢，這大概就是這個RPKM的直觀解釋。

如果對應(yīng)特定基因的話，那么就是每1000000 mapped到該基因上的reads中每kb有多少是mapped到該基因上的exon的read Total exon reads:This is the number in the column with header Total exonreads in the row for the gene. This is the number of reads that have beenmapped to a region in which an exon is annotated for the gene or across theboundaries of two exons or an intron and an exon for an annotated transcript ofthe gene. For eukaryotes, exons and their internal relationships are defined byannotations of type mRNA.映射到外顯子上總的reads個數(shù)。這個是映射到某個區(qū)域上的reads個數(shù)，這個區(qū)域或者是已知注釋的基因或者跨兩個外顯子的邊界或者是某個基因已經(jīng)注釋的轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子、外顯子。對于真核生物來說，外顯子和它們自己內(nèi)部的關(guān)系由某類型的mRNA來注釋。

Exonlength: This is the number in the column with the header Exon length inthe row for the gene, divided by 1000. This is calculated as the sum of thelengths of all exons annotated for the gene. Each exon is included only once inthis sum, even if it is present in more annotated transcripts for the gene.Partly overlapping exons will count with their full length, even though theyshare the same region.外顯子的長度。計算時，計算所有某個基因已注釋的所有外顯子長度的總和。即使某個基因以多種注釋的轉(zhuǎn)錄本呈現(xiàn)，這個外顯子在求和時只被包含一次。即使部分重疊的外顯子共享相同的區(qū)域，重疊的外顯子以其總長來計算。 Mapped reads: The sum of all the numbers in the column with header Totalgene reads. The Total gene reads for a gene is the total number ofreads that after mapping have been mapped to the region of the gene. Thus thisincludes all the reads uniquely mapped to the region of the gene as well asthose of the reads which match in more places (below the limit set in thedialog in figure18.110) that have been allocated tothis gene's region. A gene's region is that comprised of the flanking regions(if it was specified in figure 18.110), the exons, the introns andacross exon-exon boundaries of all transcripts annotated for the gene. Thus,the sum of the total gene reads numbers is the number of mapped reads for thesample (you can find the number in the RNA-Seq report).map的reads總和。映射到某個基因上的所有reads總數(shù)。因此這包含所有的唯一映射到這個區(qū)域上的reads。

舉例：比如對應(yīng)到該基因的read有1000個，總reads個數(shù)有100萬，而該基因的外顯子總長為5kb，那么它的RPKM為：10 9*1000(reads個數(shù))/10 6(總reads個數(shù)) 5000(外顯子長度)=200或者：1000(reads個數(shù))/1(百萬) 5(K)=200這個值反映基因的表達(dá)水平。

FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped). FPKM與RPKM計算方法基本一致。不同點就是FPKM計算的是fragments，而RPKM計算的是reads。Fragment比read的含義更廣，因此FPKM包含的意義也更廣，可以是pair-end的一個fragment，也可以是一個read。

什么是轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)

用測序的數(shù)據(jù)組裝成轉(zhuǎn)錄本。有兩種組裝方式：1，de-novo構(gòu)建； 2，有參考基因組重構(gòu)。其中de-novo組裝是指在不依賴參考基因組的情況下，將有overlap的reads連接成一個更長的序列，經(jīng)過不斷的延伸，拼成一個個的contig及scaffold。常用工具包括velvet，trans-ABYSS，Trinity等。有參考基因組重構(gòu)，是指先將read貼回到基因組上，然后在基因組通過reads覆蓋度，junction位點的信息等得到轉(zhuǎn)錄本，常用工具包括scripture、cufflinks。

什么是genefusion

將基因組位置不同的兩個基因中的一部分或全部整合到一起，形成新的基因，稱作融合基因，或嵌合體基因。該基因有可能翻譯出融合或嵌合體蛋白。

什么是表達(dá)譜

基因表達(dá)譜(geneexpression profile)：指通過構(gòu)建處于某一特定狀態(tài)下的細(xì)胞或組織的非偏性cDNA文庫,大規(guī)模cDNA測序,收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群體組成,從而描繪該特定細(xì)胞或組織在特定狀態(tài)下的基因表達(dá)種類和豐度信息,這樣編制成的數(shù)據(jù)表就稱為基因表達(dá)譜

什么是功能基因組學(xué)

功能基因組學(xué)（Functuionalgenomics）又往往被稱為后基因組學(xué)（Postgenomics），它利用結(jié)構(gòu)基因組所提供的信息和產(chǎn)物，發(fā)展和應(yīng)用新的實驗手段，通過在基因組或系統(tǒng)水平上全面分析基因的功能，使得生物學(xué)研究從對單一基因或蛋白質(zhì)得研究轉(zhuǎn)向多個基因或蛋白質(zhì)同時進(jìn)行系統(tǒng)的研究。這是在基因組靜態(tài)的堿基序列弄清楚之后轉(zhuǎn)入對基因組動態(tài)的生物學(xué)功能學(xué)研究。研究內(nèi)容包括基因功能發(fā)現(xiàn)、基因表達(dá)分析及突變檢測?；虻墓δ馨ǎ荷飳W(xué)功能，如作為蛋白質(zhì)激酶對特異蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化修飾；細(xì)胞學(xué)功能，如參與細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)信號傳遞途徑；發(fā)育上功能，如參與形態(tài)建成等。采用的手段包括經(jīng)典的減法雜交，差示篩選，cDNA代表差異分析以及mRNA差異顯示等，但這些技術(shù)不能對基因進(jìn)行全面系統(tǒng)的

分析，新的技術(shù)應(yīng)運而生，包括基因表達(dá)的系統(tǒng)分析（serial analysis of gene expression,SAGE），cDNA微陣列（cDNA microarray），DNA 芯片（DNA chip）和序列標(biāo)志片段顯示（sequence tagged fragmentsdisplay。

什么是比較基因組學(xué)

比較基因組學(xué)(ComparativeGenomics)是基于基因組圖譜和測序基礎(chǔ)上，對已知的基因和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，來了解基因的功能、表達(dá)機(jī)理和物種進(jìn)化的學(xué)科。利用模式生物基因組與人類基因組之間編碼順序上和結(jié)構(gòu)上的同源性，克隆人類疾病基因，揭示基因功能和疾病分子機(jī)制，闡明物種進(jìn)化關(guān)系，及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。

什么是表觀遺傳學(xué)

表觀遺傳學(xué)是研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)了可遺傳的變化的一門遺傳學(xué)分支學(xué)科。表觀遺傳的現(xiàn)象很多，已知的有DNA甲基化（DNAmethylation），基因組印記（genomicimpriting），母體效應(yīng)（maternaleffects），基因沉默（genesilencing），核仁顯性，休眠轉(zhuǎn)座子激活和RNA編輯（RNA editing）等。

什么是計算生物學(xué)

計算生物學(xué)是指開發(fā)和應(yīng)用數(shù)據(jù)分析及理論的方法、數(shù)學(xué)建模、計算機(jī)仿真技術(shù)等。當(dāng)前，生物學(xué)數(shù)據(jù)量和復(fù)雜性不斷增長，每14個月基因研究產(chǎn)生的數(shù)據(jù)就會翻一番，單單依靠觀察和實驗已難以應(yīng)付。因此，必須依靠大規(guī)模計算模擬技術(shù)，從海量信息中提取最有用的數(shù)據(jù)。

什么是基因組印記

基因組印記(又稱遺傳印記)是指基因根據(jù)親代的不同而有不同的表達(dá)。印記基因的存在能導(dǎo)致細(xì)胞中兩個等位基因的一個表達(dá)而另一個不表達(dá)。基因組印記是一正常過程，此現(xiàn)象在一些低等動物和植物中已發(fā)現(xiàn)多年。印記的基因只占人類基因組中的少數(shù)，可能不超過5%，但在胎兒的生長和行為發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用?；蚪M印記病主要表現(xiàn)為過度生長、生長遲緩、智力障礙、行為異常。目前在腫瘤的研究中認(rèn)為印記缺失是引起腫瘤最常見的遺傳學(xué)因素之一。

什么是基因組學(xué)

基因組學(xué)（英文genomics），研究生物基因組和如何利用基因的一門學(xué)問。用于概括涉及基因作圖、測序和整個基因組功能分析的遺傳學(xué)分支。該學(xué)科提供基因組信息以及相關(guān)數(shù)據(jù)系統(tǒng)利用，試圖解決生物，醫(yī)學(xué)，和工業(yè)領(lǐng)域的重大問題。

什么是DNA甲基化

DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價鍵結(jié)合一個甲基基團(tuán)。正常情況下，人類基因組“垃圾”序列的CpG二核苷酸相對稀少，并且總是處于甲基化狀態(tài)，與之相反，人類基因組中大小為100—1000 bp左右且富含CpG二核苷酸的CpG島則總是處于未甲基化狀態(tài)，并且與56％的人類基因組編碼基因相關(guān)。人類基因組序列草圖分析結(jié)果表明，人類基因組CpG島約為28890個，大部分染色體每1 Mb就有5—15個CpG島，平均值為每Mb含10．5個CpG島，CpG島的數(shù)目與基因密度有良好的對應(yīng)關(guān)系[9]。由于DNA甲基化與人類發(fā)育和腫瘤疾病的密切關(guān)系，特別是CpG島甲基化所致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活問題，DNA甲基化已經(jīng)成為表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)的重要研究內(nèi)容。

什么是基因組注釋？

基因組注釋(Genomeannotation) 是利用生物信息學(xué)方法和工具,對基因組所有基因的生物學(xué)功能進(jìn)行高通量注釋,是當(dāng)前功能基因組學(xué)研究的一個熱點?；蚪M注釋的研究內(nèi)容包括基因識別和基因功能注釋兩個方面?；蜃R別的核心是確定全基因組序列中所有基因的確切位置。

什么是Q30？

Q30是指一個堿基的識別可靠性等于99.9%，或者說出錯可能性是0.1%。Q20則是指堿基識別的可靠性等于99%。

Q30數(shù)據(jù)量是指一批數(shù)據(jù)中，質(zhì)量高于等于Q30的數(shù)據(jù)的量的總和。

測序數(shù)據(jù)的PF data/PF reads是什么意思？

PF是pass filter的意思。也就是質(zhì)量合格的意思。Illumina的測儀序會自動地對一個read(序列)的質(zhì)量可靠性進(jìn)行打分。

對于前25個堿基中的是否有兩個堿基的識別可靠性低于0.6，是PF的判斷標(biāo)準(zhǔn)。這句話翻譯成較容易理解的話: 就是前25個堿基中，如果低質(zhì)量的數(shù)據(jù)有2個或更多，則這條read被判定為不合格，PF就不通過。反之，則質(zhì)檢通過。

PF是國際公認(rèn)的質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)。

你們給的數(shù)據(jù)是什么質(zhì)量的？

對于哺乳動物基因組重測序、外顯子測序，我們保證數(shù)據(jù)質(zhì)量是Q30的比例高于80%。對于mRNA測序，smRNA測序，我們保證對照Lane的數(shù)據(jù)質(zhì)是Q30的比例高于80%。

一般情況下:

哺乳動物基因組重測序、外顯子測序，GC比例在40%左右，Q30的比例是80~95%

RNA-seq，GC比例在50%左右，Q30的比例是~80%。如果Poly(A)特別多的情況下，Q30會更低一些

SmRNA-seq，因為有許多的read讀通之后，只剩下一串的A，質(zhì)量會更低，我們的實驗結(jié)果%Q30在70~75%

測序中的Duplication是什么，如何避免，一般會有多少Duplication?

所謂Duplication是指起始與終止位置完全一致的片段。

引起Duplication的主要原因是因為在測序中有PCR過程，來源于同一個DNA片段PCR的產(chǎn)物被重復(fù)測序，就會是Duplication。次要原因是正巧兩個片段的頭和尾的位置完全一致。

一般通過控制PCR的循環(huán)數(shù)來控制Duplication。我們一般控制PCR的循環(huán)次數(shù)在10~12個循環(huán)。

在藥明康德外顯子測序中，如果用illumina的捕獲試劑盒Duplication的比例約為10%，如果用Nimblegen的捕獲試劑盒Duplication的比例波動較大，在5~50%范圍 ，平均為30%。

在RNA-seq中，Duplication的比例約為40%。RNA-seq中，因為高豐度的mRNA集中在幾個基因上，集中度很高，所以Duplication的比例也就高。

測序的插入片段一般是多長？

測序的插入片段一般是100bp到600bp.

因為Hiseq測序過程中有一個橋式PCR的過程。如果插入片段過長，測橋式PCR產(chǎn)生的Cluster就會太大，而且光強也會減弱。所以插入片段的長度是有限制的。

PhiX文庫有什么用？

PhiX文庫是一種用病毒基因組做的文庫。其基因序列已精確知曉，GC比例約為40%，與人類、哺乳類的基因組的GC比例接近。其基因序列又與人類的基因序列相去甚遠(yuǎn)，在與哺乳類基因組一些測序時，可以輕松地通過基因序列比對而將之去除。

在測四種堿基不平衡（A、G、C、T四種堿基的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)偏離25%）的樣本時，可以加入大量的PhiX文庫，以部分抵消樣本的不平衡性。例如ChIPed DNA測序，或者亞硫酸氫鹽處理過的DNA文庫，或者擴(kuò)增子測序（PCR樣測序），都可以加入PhiX，以部分彌補堿基不平衡性。

也可以少量地加入樣本，以作為control library來驗證測序質(zhì)量。

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