劉澎濤博士Nature：?jiǎn)渭?xì)胞RNA-seq新成果

劉澎濤博士Nature：?jiǎn)渭?xì)胞RNA-seq新成果

2016年09月26日訊 在國(guó)際頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊《Nature》發(fā)表的一項(xiàng)研究中，來(lái)自英國(guó)威康信托基金會(huì)桑格研究所、香港中文大學(xué)、上海農(nóng)科院、上海交通大學(xué)、劍橋大學(xué)和墨爾本大學(xué)等處的研究人員，通過(guò)對(duì)骨髓（BM）先天淋巴細(xì)胞（ILCs）進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNAseq），確定了不同的ILC前體細(xì)胞亞群，描述了不同的ILC發(fā)育階段和途徑，并發(fā)現(xiàn)PD-1可以作為先天淋巴祖細(xì)胞和效應(yīng)物ILCs的一個(gè)新型標(biāo)記。這提供了新的治療機(jī)會(huì)，來(lái)操縱ILCs實(shí)現(xiàn)最佳的免疫反應(yīng)。

英國(guó)威康信托基金會(huì)桑格研究所資深研究員劉澎濤（Pentao Liu）博士是這篇文章的資深作者。劉博士早年畢業(yè)于河南師范大學(xué)，1998年博士畢業(yè)于美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院，之后在馬里蘭州弗雷德里克國(guó)家癌癥研究所工作。2003年加盟英國(guó)威康信托基金會(huì)桑格研究所研究員，2010年晉升為資深研究員和課題組長(zhǎng)，2011年起在劍橋大學(xué)干細(xì)胞研究所兼職。2005年至今擔(dān)任過(guò)包括輝瑞在內(nèi)多家生物醫(yī)藥公司之科學(xué)顧問(wèn)，擅長(zhǎng)化學(xué)基因組研究，先后發(fā)表學(xué)術(shù)論文70多篇。

2015年1月，劉澎濤博士帶領(lǐng)的一項(xiàng)新研究，確定了一個(gè)基因在侵襲性的乳腺癌亞型中尤其活躍。該研究表明，這一過(guò)度活化的BCL11A基因驅(qū)動(dòng)了三陰性乳腺癌的形成和發(fā)展。相關(guān)論文發(fā)表在《自然通訊》（Nature Communications）雜志上。

2015年9月，在國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊《Genome Biology》發(fā)表的一項(xiàng)研究中，劉澎濤博士聯(lián)手劍橋大學(xué)、上海交通大學(xué)等處的研究人員，采用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析來(lái)解析造血干細(xì)胞（HSCs）的分子異質(zhì)性。這項(xiàng)研究論證了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄學(xué)用于解析干細(xì)胞區(qū)室中的細(xì)胞過(guò)程和譜系異構(gòu)性的效用。

這項(xiàng)新研究指出，先天淋巴細(xì)胞（ILCs）在細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子生產(chǎn)方面與T淋巴細(xì)胞功能相似，但缺乏抗原特異性受體，是免疫反應(yīng)和組織體內(nèi)平衡中重要的調(diào)節(jié)因子。ILC是由常見的淋巴系祖細(xì)胞（CLPs）生成的，它們后來(lái)定向分化為α淋巴祖細(xì)胞（αLP）中的先天淋巴細(xì)胞譜系、早期先天性淋巴祖細(xì)胞（EILP）、一般輔助型先天淋巴樣祖細(xì)胞（CHILP）和先天淋巴樣細(xì)胞祖細(xì)胞（ILCP）。ILCs由常規(guī)的NK（cNK）和輔助樣細(xì)胞組成：ILC1、ILC2和ILC3。盡管最近的進(jìn)展，細(xì)胞的異質(zhì)性、生長(zhǎng)軌跡和ILC祖細(xì)胞的信號(hào)依賴性，仍然沒有得到全面的理解。

在這項(xiàng)研究中，研究人員通過(guò)對(duì)骨髓（BM）祖細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNAseq），來(lái)揭示先天淋巴細(xì)胞（ILCs）前體細(xì)胞亞群，描述不同的ILC發(fā)育階段和途徑，并發(fā)現(xiàn)程序性死亡1高表達(dá)（PD-1hi）標(biāo)志著一個(gè)基本上與ILCP相同的定向ILC祖細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)將PD-1hiIL-25Rhi定義為ILC2發(fā)育中一個(gè)早期檢查點(diǎn)，可通過(guò)Bcl11b-缺陷抑制，但是可通過(guò)IL-25R過(guò)表達(dá)而得以恢復(fù)。類似于T淋巴細(xì)胞，PD-1在激活的ILCs上是上調(diào)的。施用PD-1抗體可減少PD-1hi ILCs，并減少感冒病毒感染模型中的細(xì)胞因子水平，并阻斷木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的急性肺部炎癥。這些結(jié)果為探索免疫療法中的PD-1/PD-L1提供了新的視角，并使科學(xué)家能夠?qū)膊☆A(yù)防和治療的免疫系統(tǒng)進(jìn)行有效的操作。

CITE-seq：同時(shí)測(cè)細(xì)胞表面蛋白和RNA的單細(xì)胞測(cè)序

單細(xì)胞測(cè)序方法和原理系列：

CITE-seq是一種能夠同時(shí)測(cè)定數(shù)千個(gè)細(xì)胞的無(wú)偏差轉(zhuǎn)錄圖譜和基于抗體檢測(cè)的蛋白標(biāo)記物的技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，這種方法可以同時(shí)適用于兩種不同的高通量單細(xì)胞測(cè)序，并通過(guò)實(shí)例顯示出，該方法比單獨(dú)的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)能夠得到更加詳細(xì)的細(xì)胞表型特征。
CITE-seq這個(gè)方法在2017年的時(shí)候發(fā)表在nature methods上。作者還建了一個(gè)網(wǎng)站： www.cite-seq.com

ADT (antibody derived tags) 概念：被測(cè)序測(cè)到的“從抗體衍生出來(lái)的標(biāo)簽”的數(shù)量。可以近似地認(rèn)為， ADT就是抗體所對(duì)應(yīng)的蛋白在一個(gè)細(xì)胞上的表達(dá)量 。但要注意的是，這里只是一個(gè)近似值，因?yàn)椴煌贵w對(duì)抗原的親和力是不一樣的。

CITE-seq由mRNA測(cè)序和對(duì)帶標(biāo)簽的抗體測(cè)序組成。單細(xì)胞測(cè)序的部分和10X的原理是一樣的，參考： 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)原理：SMART、TargetAmp和10X genomics 。只是CITE-seq在原有單細(xì)胞測(cè)序的基礎(chǔ)上加了抗體，抗體可以結(jié)合到細(xì)胞表面相應(yīng)的蛋白上，抗體上帶有特殊的DNA標(biāo)簽。

帶有DNA標(biāo)簽的抗體：
抗體的設(shè)計(jì)使得它1）能夠被基于寡聚dT建庫(kù)的RNA文庫(kù)所捕獲；2）含有用于區(qū)分抗體條形碼序列；3）能夠進(jìn)行后續(xù)的PCR特異擴(kuò)增。
使用鏈霉素-生物素親和反應(yīng)將抗體與寡核苷酸的5’端連接起來(lái)，同時(shí)還包含了一個(gè)二硫鍵，于是在還原條件下寡核苷酸便能夠從抗體上釋放出來(lái)。

首先將抗體和單細(xì)胞懸液一起孵育（和流式類似），抗體和細(xì)胞結(jié)合后洗去未結(jié)合的抗體，隨后樣本即可對(duì)接10x技術(shù)被分成油包水小液滴。

細(xì)胞裂解后，mRNA和與抗體結(jié)合的寡核苷酸通過(guò)它們3’端的polyA尾巴，同時(shí)與含有polyT的微珠發(fā)生退火而結(jié)合在一起。在反轉(zhuǎn)錄時(shí)，與微珠結(jié)合的一段特殊的條形碼序列能夠區(qū)分來(lái)自于不同細(xì)胞的mRNA和與抗體結(jié)合的寡核苷酸序列。而擴(kuò)增了的來(lái)源于抗體的序列（ADTs）和cDNA分子能夠通過(guò)大小區(qū)分開，并將其構(gòu)建為獨(dú)立的Illumina測(cè)序文庫(kù)。

需要注意的是，兩個(gè)文庫(kù)類型是可以同時(shí)進(jìn)行測(cè)序的，但考慮到測(cè)序深度問(wèn)題，由于它們是單獨(dú)構(gòu)建的，因此可以將它們合并在單一泳道中并調(diào)整它們的相對(duì)比例，以確保每個(gè)文庫(kù)都能獲得適當(dāng)?shù)臏y(cè)序深度。
文庫(kù)制備好之后就可以進(jìn)行測(cè)序了

1. 同時(shí)測(cè)mRNA+蛋白信息，數(shù)據(jù)更豐富，對(duì)細(xì)胞的注釋更準(zhǔn)確，有助于發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型。
2. 由于barcode的存在，CITE-seq檢出的mRNA+蛋白是可以對(duì)應(yīng)的，可就是說(shuō)是可以同時(shí)得到每個(gè)細(xì)胞的mRNA+蛋白表達(dá)量。
3. 與流式細(xì)胞相比，CITE-seq又可以不受抗體之間信號(hào)干擾的影響，大大增加了表面蛋白標(biāo)記的數(shù)量(一次可以檢出多達(dá)100個(gè)的蛋白)，從而可以一次性獲得多種由抗體蛋白指示的免疫表型的信息。甚至，如果關(guān)注點(diǎn)在細(xì)胞蛋白上，ADTs可以獨(dú)立于細(xì)胞的mRNA而單獨(dú)測(cè)序、分析，即已報(bào)到的Abseq。
4. CITE-seq能夠與10X Genomics無(wú)縫銜接，方便易操作。

參考：
CITE-seq可以同時(shí)測(cè)細(xì)胞表面蛋白和RNA的單細(xì)胞測(cè)序
Total-seq的前世今生——前世：CITE-seq

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