南京大學(xué)發(fā)布無序列限制的DNA編輯新工具

南京大學(xué)發(fā)布無序列限制的DNA編輯新工具

2016年09月15日訊 內(nèi)切酶經(jīng)過改造可以成為強(qiáng)大的DNA編輯工具，比如ZFN、TALEN、風(fēng)頭正勁的CRISPR-Cas系統(tǒng)和引起爭(zhēng)議的NgAgo技術(shù)。不過這些技術(shù)都是通過序列識(shí)別來實(shí)現(xiàn)靶向切割的，會(huì)受到序列偏好的限制。

南京大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)九月十五日在Genome Biology雜志上發(fā)表了一項(xiàng)突破性成果。他們開發(fā)了結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的DNA編輯新技術(shù)，不再受到靶序列的限制。這篇文章的通訊作者是南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院的周國(guó)華（Guohua Zhou）研究員、南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所的趙慶順（Qingshun Zhao）教授和朱敏生（Minsheng Zhu）教授。

FEN1（flap endonuclease-1）是一種識(shí)別3’ flap結(jié)構(gòu)的內(nèi)切酶。研究人員將FEN1與Fn1（Fok I）的剪切結(jié)構(gòu)域結(jié)合起來，制造了結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的DNA編輯工具--SGN。SGN（structure-guided endonuclease）能夠識(shí)別靶序列與向?qū)NA（gDNA）形成的3’ flap結(jié)構(gòu)，通過Fn1二聚化對(duì)靶序列進(jìn)行切割。研究顯示，一對(duì)gDNA可以引導(dǎo)SGN在斑馬魚胚胎的基因組中正確切割報(bào)告基因和內(nèi)源基因。這項(xiàng)研究指出，SGN能特異性識(shí)別和捕獲目標(biāo)，準(zhǔn)確切割任何DNA序列。

CRISPR-Cas原本是細(xì)菌抵御病毒的重要武器，現(xiàn)在它已經(jīng)成為了基因組編輯的強(qiáng)大工具。CRISPR-Cas不僅操作簡(jiǎn)便，而且還有著很強(qiáng)的可擴(kuò)展性，被廣泛應(yīng)用到各種生物中，催生了大量的研究成果。CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR抑制（CRISPRi）特別適合分析非編碼RNA的具體功能。前不久，The Scientist雜志聯(lián)合CRISPR的開發(fā)者和使用者共同編寫了使用CRISPRa和CRISPRi的入門指南，幫助研究者們更好的研究和調(diào)節(jié)基因組的編碼和非編碼區(qū)域。

Molecular Cell雜志此前曾推出技術(shù)特刊，介紹了生物學(xué)領(lǐng)域近年來出現(xiàn)的新興技術(shù)。其中一篇文章對(duì)RNAi、TALEN和CRISPR這三大基因組編輯工具的核心技術(shù)進(jìn)行了全面比較，并且為基因功能研究提供了一份實(shí)用指南。研究者們可以根據(jù)自己的需要，簡(jiǎn)單直觀的找到最適合自己的技術(shù)。

今年五月，河北科技大學(xué)的生物學(xué)家韓春雨（Chunyu Han）在Nature Biotechnology雜志上發(fā)布了一種可以替代CRISPR-Cas的基因組編輯技術(shù)，NgAgo。他的研究團(tuán)隊(duì)證實(shí)，NgAgo酶可以實(shí)現(xiàn)DNA引導(dǎo)的哺乳動(dòng)物基因組編輯。這項(xiàng)成果一經(jīng)發(fā)表就引起了國(guó)內(nèi)外的強(qiáng)烈關(guān)注，至今爭(zhēng)議不斷。

天津大學(xué)DNA存儲(chǔ)新算法可使信息保存千年萬年，會(huì)對(duì)哪些行業(yè)帶來利好？

天津大學(xué)DNA存儲(chǔ)新算法可使信息保存千年萬年，這會(huì)對(duì)DNA編輯以及信息存儲(chǔ)行業(yè)帶來非常大的利好，甚至?xí)钸h(yuǎn)的改變這兩個(gè)行業(yè)的格局 。

9月17日，天津大學(xué)的合成生物學(xué)團(tuán)隊(duì)在元英進(jìn)教授的帶領(lǐng)下，突破了DNA存儲(chǔ)技術(shù)，創(chuàng)新DNA存儲(chǔ)算法， 并將十幅精選敦煌壁畫存入DNA中， 而且做到了在實(shí)驗(yàn)室常溫下存儲(chǔ)長(zhǎng)達(dá)千年時(shí)間之久，如果是在9.4℃下甚至可以保存兩萬年。 這無疑是一項(xiàng)非常重大的創(chuàng)新，人類進(jìn)入信息時(shí)代之后，每天產(chǎn)生需要存儲(chǔ)的數(shù)據(jù)量是非常龐大的，依靠人類目前的存儲(chǔ)手段，雖然在容量方面可以承受，但是由于磁存儲(chǔ)或者光存儲(chǔ)技術(shù)有一定的局限性，一些重要的資料需要在一定的時(shí)間后進(jìn)行轉(zhuǎn)移，否則就有丟失的危險(xiǎn)，而DNA存儲(chǔ)技術(shù)一旦得到應(yīng)用，那么人類將會(huì)獲得無限的存儲(chǔ)空間以及幾乎永恒的保存周期，這無疑是信息技術(shù)的一項(xiàng)重大突破。

就當(dāng)前來看，這項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用還有一定的限制，但是這無疑會(huì)對(duì)DNA編輯以及存儲(chǔ)行業(yè)帶來巨大的機(jī)遇，就像是新能源汽車電池方面的突破一樣，將會(huì)帶來巨大的財(cái)富，同時(shí)這對(duì)于信息存儲(chǔ)行業(yè)也非常具有顛覆性，畢竟有了更加廉價(jià)以及更安全的存儲(chǔ)空間，能夠極大的降低存儲(chǔ)行業(yè)的門檻以及成本，當(dāng)然這項(xiàng)技術(shù)距離實(shí)際應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路要走，就比如DNA容易遭到破壞，如何保障信息的安全等，不過這些問題相信遲早都會(huì)解決，甚至?xí)a(chǎn)生一個(gè)新的行業(yè)。

天津大學(xué)DNA存儲(chǔ)新算法可使信息保存千年萬年，你覺得這會(huì)對(duì)哪些行業(yè)帶來利好？歡迎留言討論。

Indel誘變假說的基因突變

2008年7月20日，南大教授經(jīng)過多年研究在《自然》發(fā)表的《真核生物中插入/缺失增加其周圍序列的突變率》這篇論文中大膽提出“Indel誘變假說”。
2005年起，他們通過生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)人、黑猩猩、恒河猴、小鼠、果蠅、水稻和釀酒酵母等不同類別生物的基因組序列進(jìn)行了比對(duì)分析。研究后發(fā)現(xiàn)，DNA的插入/缺失(Indel)會(huì)引起其周圍一系列的變異。在此基礎(chǔ)上，他們提出了“Indel誘導(dǎo)自發(fā)突變機(jī)制假說”，從源頭上回答了“遺傳變異究竟是如何形成的”這一生命科學(xué)面臨的基本問題。
基因突變主要是指 DNA中核苷酸順序、種類和數(shù)量的改變。突變又分為自發(fā)突變和誘發(fā)突變。長(zhǎng)期以來，學(xué)術(shù)界對(duì)自發(fā)突變機(jī)制的經(jīng)典認(rèn)識(shí)是，自發(fā)突變具有隨機(jī)性和稀有性。但隨著上個(gè)世紀(jì)90年代以來DNA測(cè)序技術(shù)的突破性進(jìn)展，研究者們對(duì)自發(fā)突變?cè)诨蚪M中的數(shù)量和分布有了精確估計(jì)，并普遍認(rèn)為“自發(fā)突變?cè)诨蚪M中不是隨機(jī)分布的，突變熱點(diǎn)普遍存在于基因組中”。這一結(jié)論對(duì)傳統(tǒng)的自發(fā)突變隨機(jī)性和稀有性的認(rèn)識(shí)形成巨大挑戰(zhàn)，世界科學(xué)界至今沒有找到一種普遍的機(jī)制來解釋這一重大的科學(xué)疑問。
田大成教授 等發(fā)現(xiàn)的遺傳突變新機(jī)制成功破解了這一懸念：第一，基因組各區(qū)域的突變率很不相同，自發(fā)突變的數(shù)量是由Indel的數(shù)量和密度所決定，自發(fā)突變的數(shù)量在Indel附近并不稀有。但I(xiàn)ndel本身是一種點(diǎn)突變，其發(fā)生有一定的隨機(jī)性，因而其誘發(fā)的突變也有一定的隨機(jī)性；第二，找到了多數(shù)自發(fā)突變的發(fā)生根源，也就是說，生物多樣性的最初變異來源，主要是由Indel誘導(dǎo)產(chǎn)生；第三，自然選擇在很大程度上是通過對(duì) Indel 的選擇而實(shí)現(xiàn)，而自發(fā)突變率的高低很大程度上也是自然選擇的結(jié)果；第四，生物通過調(diào)節(jié)自身變異能力而適應(yīng)環(huán)境的能力，比人們?cè)认胂蟮囊蟮枚?，即突變?cè)谶M(jìn)化中的作用相當(dāng)巨大。
該研究成果不僅回答了大量科學(xué)問題，在解開腫瘤發(fā)生機(jī)制、作物遺傳育種等方面也具有重大潛在應(yīng)用價(jià)值。
《自然》評(píng)審專家Kondrashov在他對(duì)此論文的實(shí)名評(píng)價(jià)中這樣寫道：“這是一個(gè)非常有趣、富有啟迪的發(fā)現(xiàn)，將會(huì)在科學(xué)界引起強(qiáng)烈反響?！?br>在豐富多彩的生命世界，究竟是什么造就了誘人的生命多樣性？南京大學(xué)教授經(jīng)過多年潛心研究大膽提出“Indel誘變假說”，用新發(fā)現(xiàn)的“遺傳突變的普遍機(jī)制”破解了生物學(xué)上的諸多懸念。7月20日，最新出版的國(guó)際頂尖雜志《自然》介紹了南大自主完成的這一

基因編輯如何換藥不換湯

To destroy is easier than to create ，摧毀總比創(chuàng)造要簡(jiǎn)單，這句話轉(zhuǎn)換到基因編輯上就是：knockout比knock in容易。因?yàn)閗nockout只要摧毀基因，而knockin則是要?jiǎng)?chuàng)造一個(gè)新的“基因”，這個(gè)新”基因“不僅僅正確表達(dá)，還需要有相應(yīng)的功能。換言之，knockout是non-specific，而knockin則是specific。

對(duì)于干細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、原代細(xì)胞以及靜息狀態(tài)的細(xì)胞而言，轉(zhuǎn)染已經(jīng)相當(dāng)困難，基于轉(zhuǎn)染方式的knockout則是難上加難，而knockin則是上下左右為難。假如你的課題需要knockin一些特殊標(biāo)記，而且不止一次需要knockin一次，那么有沒有什么討巧的辦法既可以減輕工作量，又可以specific？今天我們就來講 重組酶介導(dǎo)的盒式交換 （recombinase-mediated cassette exchange，RMCE） ，個(gè)人關(guān)于這個(gè)技術(shù)的描述是： 換藥不換湯 。

本文的1、2點(diǎn)是基因重組背景知識(shí)和gateway重組的介紹， 如不需要，可直接跳到第3點(diǎn)，直達(dá)RMCE（寧可不看一二，也絕不能錯(cuò)過三） 。

在動(dòng)筆寫這篇文章RMCE之前，突然發(fā)現(xiàn)目前我們用到的幾乎所有基因編輯手段，都是一種特定生物學(xué)過程的結(jié)果，那就是-- 重組（Recombination） 。例如我們?cè)谇懊娴奈恼轮杏刑岬竭^ HDR（Homology directed repair）介導(dǎo)的CRISPR-Cas9技術(shù)，就是依賴基因的同源重組，將供體片段替換到基因組中 ；此外，在piggyBac文章中提到的基因 轉(zhuǎn)座 （Transposition ）*：DNA從某一位置移動(dòng)到基因組上另一位置，也屬于基因重組的范疇，并且是一種高度特異的基因重組。因此，在我們了解RMCE之前，需要加強(qiáng)一遍重組在我們基因編輯技術(shù)知識(shí)譜系的重要程度。

一類：自然發(fā)生的重組類型至少有以下四種：

（1） General or homologous recombination（常規(guī)/同源重組）： 發(fā)生在序列非常相似的DNA分子之間，如二倍體生物中的同源染色體。同源重組是TELEN以及HDR介導(dǎo)的CRISPR-Cas9的基因編輯的基礎(chǔ)，由于這種方法需要供體包含有非常長(zhǎng)的同源臂，從而可以達(dá)到精準(zhǔn)的效果，但精準(zhǔn)度越高，其成功率又隨之降低。

（2） Illegitimate or nonhomologous（不合理/非同源重組）： 由于這種重組方法并不需要有長(zhǎng)同源序列，看起來“不合理”， 所以被稱之為不合理（非法）重組。這種重組可造成隨機(jī)突變，在科學(xué)研究中也有用到。

（3） Site-specific recombination（位點(diǎn)特異性重組）： 顧名思義，就是需要有特定的識(shí)別位點(diǎn)才能開啟的重組方式，而這些特定的識(shí)別位點(diǎn)通常長(zhǎng)度在幾十bp左右， gateway recombination和今天我們要講的RMCE則屬于這種，由此可以想象一下RMCE也需要獨(dú)特的識(shí)別位點(diǎn) 。

（4） Replicative recombination： 可以看到復(fù)制性轉(zhuǎn)座屬于這種類型。

二類：人為改造/創(chuàng)造的重組類型：

（1） Plasmid Insertion Recombination（質(zhì)粒插入重組）： 在體外使用核酸酶可對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切，使用連接酶可將質(zhì)粒和DNA片段重組連接。其人為性不僅僅是因?yàn)檫@是體外實(shí)驗(yàn)，同時(shí)人類也可以使用PCR的方式合成出相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，從而增加質(zhì)粒的可編輯性，這對(duì)于大家來說就是家常便飯。

（2） Gene Gun Recombination（基因槍重組）： 主要用于植物工程，將包裹在金粒子上的DNA分子轟入活細(xì)胞中，最后該DNA溶液就可并入細(xì)胞的基因組中。這是一種物理改變DNA傳遞方法，同時(shí)基因傳遞的方法有以下幾個(gè)分類：

從基因槍的原理我們理解到， 改變DNA的傳遞方法，也是一種人為的重組方式 。因此上圖還將（3） Virus Replication Recombination（病毒復(fù)制重組） 和（4）電轉(zhuǎn)等等重組方式展現(xiàn)出來，這里就不再細(xì)說。

Gateway重組是常用質(zhì)粒元件置換方案 ，主要用于將目的元件在不依賴于核酸酶的方式，置換到想要的backbone上。前面說到，CRISPR-Cas9是從噬菌體侵入細(xì)菌時(shí)細(xì)菌的抵抗得到啟發(fā)，而gateway重組也是一個(gè)向自然界學(xué)習(xí)的典型例子。λ噬菌體在整合因子（IFN，Int）的幫助下， 將自身的attP位點(diǎn)和大腸桿菌的attB位點(diǎn)進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組，從而將自身的基因組整合到大腸桿菌中，此時(shí)attB & P產(chǎn)生兩個(gè)新位點(diǎn)：attL & R 。因此人們從這上得到啟發(fā)，將att位點(diǎn)克隆到質(zhì)粒中，這樣就可以輕松置換兩質(zhì)粒的原件，從而達(dá)到“換藥不換湯”的目的。

從上圖可知：

（1）att位點(diǎn)的相關(guān)特性。

（2）以右圖為例，現(xiàn)想要 將左邊紫色骨架質(zhì)粒的CaMPARI原件置換到右邊黃色骨架質(zhì)粒上 ，由于兩個(gè)骨架質(zhì)粒有可以互相重組的 attL1 & attL2位點(diǎn) 。將兩種質(zhì)粒放在同一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中，使用LR clonase，即可輕松將CaMPAR從紫色骨架轉(zhuǎn)移到黃色骨架上，從而得到一個(gè)新質(zhì)粒。而 ccdB是一個(gè)自殺基因 ，當(dāng)細(xì)胞被轉(zhuǎn)入帶有ccdB的質(zhì)粒后，大腸桿菌將不再生長(zhǎng)，因此平板/培養(yǎng)基 只剩下含有目標(biāo)質(zhì)粒 的大腸桿菌。attL1 & L2重組后形成attP1 & P2的新位點(diǎn)。

（3）這種元件置換的方法，歸根結(jié)底就在于供體和受體之間具有可重組的識(shí)別位點(diǎn)，按照這樣的思路，人們可以將多種特殊的識(shí)別位點(diǎn)包裝為元件置換系統(tǒng)。

目的：給質(zhì)粒插入RFP標(biāo)簽

（1）挑選質(zhì)粒

供體質(zhì)粒： mRFP1Rab5 ；

目標(biāo)質(zhì)粒：pDONR-P2r-P3

（2）使用snapGene完成模擬

終于回到開頭，在knockin本身就很難的情況下，課題設(shè)計(jì)還需要多個(gè)knockin。如何做到只knockin一次，后面的”knockin“全部由RMCE完成。以上gateway recombination只是開胃小菜，gateway主要用于體外構(gòu)建載體，而 RMCE則可在體內(nèi)達(dá)成元件轉(zhuǎn)換 的作用。上一節(jié)我們了解到元件置換的基本原理就是：需要特點(diǎn) 識(shí)別位點(diǎn)+特定的重組酶 ?；罴?xì)胞及生物體內(nèi)用到的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)就是大名鼎鼎的 Cre-loxP、Flp-FRT以及Dre-rox 。以Cre-loxP系統(tǒng)為例:

看到上面的圖是不是感覺很混亂并不好記憶，為什么loxP方向相同是倒置，相反是敲除或者移位。很多文章會(huì)告訴上圖的內(nèi)容，但根本的原因是loxP相當(dāng)于影子分身，每個(gè)之間都可以互換，而且換的時(shí)候要求完全一樣（影子分身能不一樣？）。

我們想象一下上圖deletion的狀況，loxP-gene-loxP片段被Cre酶切除出來后可能出現(xiàn)的結(jié)果：

（1）左右兩個(gè)loxP由于還可以和切除位點(diǎn)互補(bǔ)重組，因此，切出來的loxP-gene-loxP片段再次被重組回去，其結(jié)果就是，切了跟沒切一樣。因此，再次印證了一句話，切開只是第一步，DNA repair才是決定結(jié)果的關(guān)鍵一步

（2）按道理左邊loxP被Cre切開后，重組時(shí)應(yīng)該結(jié)合自己原來殘留的缺口，但正是因?yàn)殚L(zhǎng)得一樣，它認(rèn)錯(cuò)了，把右邊loxp剩下的缺口給占用了，導(dǎo)致gene-loxP片段被擠出基因組，此時(shí)就達(dá)到了敲除的效果。

根據(jù)以上描述，我們想知道，怎樣才能解決，切了相當(dāng)于沒切的問題呢？

在gateway中我們學(xué)到，att位點(diǎn)可有多種變體，同樣 loxP位點(diǎn)也是 ，如下圖所示， 不同loxP位點(diǎn)之間也有特定的重組方式和親和力 [2]。可以看到：

（1）野生型loxP可以和包括自己在內(nèi)的所有l(wèi)oxP突變體進(jìn)行重組。

（2）大部分loxP變體只能和少數(shù)loxP變體進(jìn)行重組，例如：loxP66可以和loxP71、511等進(jìn)行重組，最后形成相應(yīng)的loxP位點(diǎn)。

（3）少部分loxP變體只能和自己進(jìn)行重組，例如lox2272，每一種loxP變體的出現(xiàn)，都是在完善和擴(kuò)大Cre-loxP系統(tǒng)，使之可使用性更強(qiáng)、更廣。

目的：通過元件替換方式將細(xì)胞顏色熒光標(biāo)簽由綠色改為紅色

Case 1

可以看到：loxP66-GFP-loxP71元件在Cre重組酶的幫助下，被替換為loxP66-DsRed-loxP71，由此，細(xì)胞的熒光顏色由紅色轉(zhuǎn)為綠色。但這個(gè)系統(tǒng)的效果看似并不那么好，只有少數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為紅色，而大部分仍然是綠色的，而造成這個(gè)結(jié)果的原因是什么？歡迎留言給出自己的答案，下周我會(huì)將自己的解讀放上來。

在TELEN、ZFN和CRISPR-Cas9技術(shù)的出現(xiàn)，使得knockin所需的同源臂長(zhǎng)度從原來的十幾kb，縮小到1 kb以內(nèi)，大大降低了knockin的難度。然而即使是新技術(shù)的出現(xiàn)，knockin仍然具有較大的難度，尤其是knockin的效率會(huì)隨著插入片段的長(zhǎng)度增加而降低，超過3kb的knockin難度大大增加。個(gè)人小小整理RMCE使用情況如下：

（1） 早期RMCE技術(shù)主要和慢病毒、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)結(jié)合 ：使用慢病毒或轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)（睡美人SB或piggyBac）將master載體整合到基因組中， 構(gòu)建出master cell line，之后在Cre重組酶的幫助下，將目標(biāo)序列置換到master line中，從而一步得到新的細(xì)胞系。 慢病毒和轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)有高效的特點(diǎn)，但其機(jī)制是隨機(jī)整合，因此當(dāng)課題需要精確編輯時(shí)，這種整合方式則無法被采用。

（2）使用TELEN、ZFN技術(shù)將master載體質(zhì)粒knockin到細(xì)胞中，構(gòu)建master line，隨后的故事同上。這個(gè)方案運(yùn)用了精準(zhǔn)敲入，因此難度增加不少，但系統(tǒng)成熟不少。 有人可能會(huì)說，knockin我不怕難，我可以一個(gè)一個(gè)的knockin，不需要使用RMCE系統(tǒng) 。但需要考慮到同一個(gè)細(xì)胞系， 隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞系內(nèi)異質(zhì)性也會(huì)增加 。有些課題對(duì)基因背景的均勻性有著變態(tài)的需求，此時(shí) 使用RMCE系統(tǒng)置換元件的方式，可以得到幾乎一致的基因背景，但knockin序列不同的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系，從而提供更均勻穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)背景 。

（3）敲入短片段master載體，通過Cre將長(zhǎng)片段置換到master line中，完美避開長(zhǎng)片段敲入極其困難的困境。

（4）對(duì)于基因編輯困難的細(xì)胞，能獲取一個(gè)master line，會(huì)讓整個(gè)課題組的工具系統(tǒng)上升一個(gè)等級(jí)。做過knockin的人都知道這個(gè)過程的困難。以TELEN系統(tǒng)為例，需要共轉(zhuǎn)至少3個(gè)質(zhì)粒：含有TELEN同源臂的+目的基因的載體，TELEN導(dǎo)航質(zhì)粒Left + Right。以干細(xì)胞為例，轉(zhuǎn)染效率是1%，那么一百萬個(gè)細(xì)胞可獲得約1萬個(gè)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，而被共轉(zhuǎn)的細(xì)胞則可能只有500個(gè)，這500個(gè)細(xì)胞中，真正被純合knockin的細(xì)胞可能只有幾個(gè)。按照傳統(tǒng)挑單克隆的方式，那么很有可能就是培養(yǎng)了100個(gè)單克隆細(xì)胞系，最后只有1個(gè)是真正需要的，這個(gè)工作量想起來都讓人覺得害怕。不過一般使用藥物篩選方式，可最后篩出抗藥生長(zhǎng)的單克隆團(tuán)，但分離出單克隆的步驟仍不可少。

RMCE可以提供更為均勻穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)背景，但其優(yōu)勢(shì)也限制了其應(yīng)用，因?yàn)閙aster line敲入的位點(diǎn)限制了后續(xù)的應(yīng)用。例如master line敲入位置是AAVS1位點(diǎn)，而其實(shí)課題需要的多個(gè)knockin是在多個(gè)不同位點(diǎn)的。此時(shí)RMCE系統(tǒng)則起不到作用。是的，RMCE是基因編輯技術(shù)的補(bǔ)充，不能要求其完成一切需求，但有了它，我們能用的工具就更多了。個(gè)人覺得， AAVS1 knockin的master line非常實(shí)用，可以輕松構(gòu)建熒光標(biāo)簽細(xì)胞系，同時(shí)更多的inducible細(xì)胞系也更容易獲取 。單獨(dú)把RMCE拿出來講，它可能不夠出彩，它只是一個(gè)默默的扳手，看起來不起眼，但在關(guān)鍵時(shí)刻，還真香。

Reference：

[1] Araki, Kimi, Masatake Araki, and Ken‐ichi Yamamura. "Site‐directed integration of the cre gene mediated by Cre recombinase using a combination of mutant lox sites." Nucleic acids research 30.19 (2002): e103-e103.

基因靶向的技術(shù)發(fā)展

基因打靶技術(shù)是從20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的，是建立在對(duì)同源重組不斷了解的基礎(chǔ)之上。首先是以酵母這種較為簡(jiǎn)單的真核模式生物為基礎(chǔ)，來對(duì)相關(guān)技術(shù)進(jìn)行研究。隨著外源DNA導(dǎo)入酵母細(xì)胞方法的建立、標(biāo)記基因有效選擇的利用、同源重組轉(zhuǎn)化子篩選系統(tǒng)的建立、載體同源序列DNA（靶標(biāo)）雙鏈斷裂提高同源重組效率的利用，使得基因打靶技術(shù)逐漸成熟起來。而對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，由于其基因組比酵母細(xì)胞要大且復(fù)雜，基因打靶的成功率很低。因此要將基因打靶技術(shù)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物，還需要新的策略。1989年，利用胚胎干細(xì)胞，美國(guó)科學(xué)家馬里奧·卡佩奇和奧利弗·史密斯與英國(guó)科學(xué)家馬丁·埃文斯，將基因打靶技術(shù)成功地應(yīng)用于小鼠；他們也因此獲得了2007年諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
2013年3月，云南中科靈長(zhǎng)類生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中科院昆明動(dòng)物研究所、南京醫(yī)科大學(xué)、南京大學(xué)、同濟(jì)大學(xué)等多家單位合作，利用目前世界最新的基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9和TALENs實(shí)現(xiàn)獼猴和食蟹猴兩個(gè)物種的靶向基因修飾，同年10月和11月分別獲得世界首例經(jīng)過CRISPR/Cas9基因靶向修飾及TALENs基因靶向修飾的兩只小猴。

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