專家經(jīng)驗談之如何用CRISPR編輯iPS細胞

2016年09月12日訊 CRISPR基因編輯和iPS重編程是生命科學(xué)領(lǐng)域近十年最熱門的兩大技術(shù)。現(xiàn)在，科學(xué)家們正在撮合它們聯(lián)姻。人們普遍認(rèn)為，iPS與CRISPR的結(jié)合會起到一加一大于二的效果。舉例來說，CRISPR用于人類iPSC可以揭示基因在特定疾病中所起的作用，甚至可以校正患者細胞的基因缺陷。雖然CRISPR-Cas9和人類iPSC在實驗室中已經(jīng)相當(dāng)普及了，但二者相結(jié)合并沒有想象中那么容易。The Scientist雜志與多位正在使用這兩個工具的專家聯(lián)系，推出了在人類干細胞中使用CRISPR的基礎(chǔ)指南。這份指南對人iPSC和人胚胎干細胞同樣適用。

敲除VS精確編輯

當(dāng)你用CRISPR-Cas9切割基因的時候，主要有兩個分子通路在執(zhí)行DNA修復(fù)。這兩個同時發(fā)生的通路決定了基因編輯的精確性。非同源末端連接（NHEJ）負(fù)責(zé)敲除基因，制造破壞基因功能的小插入/缺失。同源介導(dǎo)修復(fù)（HDR）根據(jù)供體DNA精確改變核苷酸序列。

不少研究者在進行基因組編輯的時候使用偏向HDR的條件。他們發(fā)現(xiàn)，人多能干細胞的編輯效果比傳統(tǒng)永生細胞系差，轉(zhuǎn)染100個iPSC只能引入一個正確的改變。這是CRISPR基因組編輯面臨的一個主要挑戰(zhàn)，不過Hockemeyer覺得自己的團隊還能應(yīng)付?！叭绻阌泻芎玫亟M織培養(yǎng)流程，那么挑200個克隆就能獲得2個正確克隆。一個學(xué)生在三小時內(nèi)就能搞定，”他介紹道。

Hockemeyer及其同事正在開發(fā)新策略，試圖讓天平向HDR傾斜，比如采用特殊化合物或者其他物種的Cas9?！拔艺J(rèn)為這個問題很可能未來幾年內(nèi)就能得到解決，”Hockemeyer表示。

Conklin團隊開發(fā)了一種快速數(shù)字PCR測試，用來定量HDR和NHEJ的修復(fù)效率。他們的研究顯示，在人iPSC和其他一些細胞中，HDR和NHEJ效率之間并沒有什么關(guān)系。

驗證你的基因組編輯

如何證明CRISPR系統(tǒng)完成了正確的切割呢？你可以給細胞提供與編輯基因互補的DNA，這些DNA應(yīng)該能夠挽救相應(yīng)的細胞表型。如果細胞表型變化很小難以觀察，你可以嘗試再次編輯這個基因，看看能否使其恢復(fù)成野生型，Hocke?meyer說。

研究者們也會抽查自己的基因組，比如對編輯區(qū)域進行PCR和Sanger測序。免費算法TIDE可以在PCR和Sanger測序數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上鑒定目標(biāo)突變及其發(fā)生的頻率。

外顯子組測序?qū)⒊蔀轵炞C基因組編輯的首選方法?！皽y序可能是對你整個系統(tǒng)最完全的分析。如果這個細胞系要用上十年，那么測序就是你應(yīng)該做的投資。你需要確保一切都盡善盡美，”Mali指出。同時我們也應(yīng)當(dāng)請牢記，遺傳學(xué)差異會隨著時間的推移慢慢累積，任何細胞系都不例外。

脫靶效應(yīng)并非大問題

針對同一個位點設(shè)計兩個以上有充分差異的向?qū)NA，這是防止脫靶編輯一個主要途徑?？偟膩碚f，脫靶效應(yīng)對于絕大多數(shù)基礎(chǔ)研究者來說并不是什么特別大的問題，Cowan認(rèn)為。CRISPR系統(tǒng)在人多能干細胞中的脫靶效應(yīng)比癌細胞系少得多，Cheng也表示。但如果真的很擔(dān)心脫靶，全外顯子測序?qū)⑹悄阕詈玫倪x擇。

用CRISPR調(diào)控基因表達

如果你指望在多能干細胞中敲除多能性必需基因，那你肯定要失望了。因為敲除這些基因會導(dǎo)致細胞死亡。在這種情況下，我們只能選擇下調(diào)（或上調(diào)）基因的表達水平。研究者們?yōu)榇舜蛟炝耸ゴ呋钚缘膁Cas9，dCas9能到達向?qū)NA指定的位點，但無力對DNA進行剪切。用dCas9抑制轉(zhuǎn)錄的策略被稱為CRISPRi，用dCas9激活轉(zhuǎn)錄的策略被稱為CRISPRa。

今年三月Cell Stem Cell雜志發(fā)表的一項研究顯示，對iPSC進行功能缺失篩選的時候，CRISPRi比傳統(tǒng)CRISPR更為有效。CRISPRi在95%的細胞中沉默目的基因，CRISPR-Cas9只能在60-70%的細胞中關(guān)閉目的基因，而且CRISPRi沒有發(fā)生脫靶。

基因表達控制和基因編輯之前的主要區(qū)別在于，基因表達控制并非永久性改變基因組。你可以干擾細胞沉默基因，然后再逆轉(zhuǎn)這種抑制。此外，與CRISPR-Cas9相比，CRISPRi和CRISPRa的脫靶效應(yīng)更小。

CRISPR調(diào)控基因表達也存在一定的挑戰(zhàn)。舉例來說，設(shè)計一組可靠的向?qū)NA很難，Mali說。在理想情況下，向?qū)NA應(yīng)當(dāng)避開緊緊纏繞核小體的基因組區(qū)域。但有時候我們想要靶標(biāo)的位點就在這些區(qū)域里。

將CRISPRa和CRISPRi送入人多能干細胞也比較復(fù)雜?！笆笴RISPRa和CRISPRi進入70-80%的細胞依然很難，除非你使用病毒來遞送。通常我們說的都是30-40%的細胞，”Cowen指出，他正在用CRISPRa激活和驗證報告基因。這種方法對他很有幫助，因為iPSC很難分化成他想要的腎內(nèi)皮細胞。

我們基因組的80%會轉(zhuǎn)錄成RNA，但這些轉(zhuǎn)錄本大多不生成蛋白質(zhì)。近年來人們發(fā)現(xiàn)非編碼RNA往往與人類疾病有關(guān)，不過絕大多數(shù)非編碼RNA的功能還是未知的。CRISPRa和CRISPRi特別適合分析非編碼RNA的具體功能。前不久，The Scientist雜志聯(lián)合CRISPR的開發(fā)者和使用者共同編寫了使用CRISPRa和CRISPRi的入門指南，幫助研究者們更好的研究和調(diào)節(jié)基因組的編碼和非編碼區(qū)域。

在CRISPR系統(tǒng)的基礎(chǔ)上使用sgRNA文庫進行遺傳篩選，是鑒定基因調(diào)控子的一種有效方法。研究者們可以通過CRISPR篩選在基因組非編碼區(qū)域中尋找功能性元件。不過這樣的應(yīng)用需要高度覆蓋又簡單實用的自定義sgRNA文庫。耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員開發(fā)了一個名為Molecular Chipper的新技術(shù)。該技術(shù)能夠針對指定基因組區(qū)域生成密集覆蓋的sgRNA文庫。

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