首份CRISPR基因編輯的蔬菜大餐,你敢吃嗎？

首份CRISPR基因編輯的蔬菜大餐,你敢吃嗎？

2016年09月10日訊 在2014年8月13日，發(fā)表在Cell子刊《Trends in Biotechnology》的一項(xiàng)研究稱，基因組精確編輯技術(shù)的最新研究進(jìn)展，增加了這樣一種可能性：不需要引入外源基因，就可以對(duì)水果和其他作物進(jìn)行遺傳改良。

以快捷、簡(jiǎn)易且經(jīng)濟(jì)而著稱的CRISPR技術(shù)，正在農(nóng)業(yè)界引爆一場(chǎng)變革--多家公司已開始爭(zhēng)相種植基因編輯作物，以期這些農(nóng)作物最終能夠進(jìn)入市場(chǎng)。

最近，通過“基因剪刀”CRISPR-Cas9修飾的轉(zhuǎn)基因蔬菜已經(jīng)收獲并被烹飪，這可能是有史以來第一頓用基因編輯蔬菜烹制的大餐。瑞典于默奧大學(xué)（Ume? University）的植物細(xì)胞與分子生物學(xué)教授Stefan Jansson，向電臺(tái)展示了用“CRISPRy”蔬菜烹制的意大利面。雖然這頓飯只夠兩個(gè)人吃，但它仍然向著“未來科學(xué)可以更好地為世界各地的農(nóng)民和消費(fèi)者提供健康、美麗和耐寒的植物”，邁出了重要的第一步。

CRISPR-Cas9是一個(gè)復(fù)雜的名字，但是這項(xiàng)技術(shù)能夠容易地改變一個(gè)生物體的基因。這一決定性的發(fā)現(xiàn)由于默奧大學(xué)的研究人員發(fā)表在2012年，科學(xué)家預(yù)測(cè)，這把“遺傳工程的瑞士軍刀”可能會(huì)改變世界。有了CRISPR-Cas9技術(shù)，研究人員就可以將生物體基因組中存在的數(shù)十億個(gè)“字母”進(jìn)行替換（例如，由DNA組成的整個(gè)基因庫(kù)），或去除短的片段，就像你在文字處理器上編輯文字一樣。這一技術(shù)被稱為“基因編輯”或“基因組編輯”。

CRISPR的第一個(gè)臨床應(yīng)用正在進(jìn)行中；也許我們可以很快使用這種技術(shù)，來治愈遺傳性疾病。然而，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的情況則有所不同。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，問題不在于研究人員是否可以培育出某些作物，從而導(dǎo)致更加可持續(xù)發(fā)展的土地管理，而是，這些作物是否將被允許用于農(nóng)業(yè)種植。利用CRISPR-Cas9進(jìn)行基因組編輯的作物，是否應(yīng)該受到轉(zhuǎn)基因立法的調(diào)控呢？如果受轉(zhuǎn)基因立法調(diào)控，那么它們?cè)谑澜绺鞯氐姆N植就是非法的。如果不受轉(zhuǎn)基因立法調(diào)控，它們就會(huì)像其他植物一樣，農(nóng)民可以根據(jù)自己的判斷進(jìn)行種植。

歐盟（EU）一直回避回答這個(gè)問題，但在2015年十一月，瑞典農(nóng)業(yè)委員會(huì)解釋了相關(guān)法律，如果只有一部分DNA已被刪除，并沒有“外源DNA”被插入，那么它就不被視為一種轉(zhuǎn)基因生物（GMO）。這也意味著，即便沒有事先許可，這些作物也可以種植。在2016年春季，美國(guó)當(dāng)局表示他們同意這一說法。正在討論的生物是一種蘑菇，其失去了一部分DNA，這部分DNA能使它變成棕色。這開辟了“未來利用該技術(shù)來培育植物”的新局面。

這個(gè)夏天，使用CRISPR-Cas9進(jìn)行基因編輯的植物--以一種不會(huì)將植物分類為GMO的方式，已經(jīng)獲準(zhǔn)在實(shí)驗(yàn)室外面栽培。這在歐洲絕對(duì)是第一次，即使在世界其他地方有種植，也是保密的。這一次，瑞典廣播電臺(tái)園藝節(jié)目“Odla med P1”參加了一種圓白菜的作物收割，從而帶來了可能是有史以來第一頓CRISPR-Cas9基因組編輯蔬菜烹制的大餐。

植物科學(xué)家Stefan Jansson說：“正在討論的CRISPR蔬菜，生長(zhǎng)在于瑞典北部默奧大學(xué)外面花園的一個(gè)托盤里，既不是特別的與眾不同，也不比其他什么蔬菜更漂亮。”但它們代表了農(nóng)業(yè)的一個(gè)新階段，在這個(gè)階段，科學(xué)進(jìn)步將在新的植物物種中實(shí)現(xiàn)，到一個(gè)小或大的程度時(shí)，將提供給世界各地的農(nóng)民。

新手指南：如何設(shè)計(jì)CRISPR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行基因組編輯

十年前，當(dāng)研究人員開始解析細(xì)菌和古細(xì)菌中一個(gè)稱為 CRISPR 結(jié)構(gòu)的時(shí)候，他們并沒有預(yù)料到這會(huì)給基因編輯世界帶來一場(chǎng)風(fēng)暴。在過去的這一年半時(shí)間里，CRISPR 方法已迅速席卷了整個(gè)動(dòng)物王國(guó)，成為 DNA 突變和編輯的一種“馬上”技術(shù)——迄今為止在幾乎每種實(shí)驗(yàn)細(xì)胞類型中都能起作用，包括人類細(xì)胞，小鼠，斑馬魚和果蠅細(xì)胞；這種技術(shù)也易于操作，已經(jīng)有兩個(gè)研究組利用 CRISPR 分析了人類細(xì)胞中幾乎每個(gè)基因單突變（詳細(xì)報(bào)道 Science：CRISPR/Cas9加速基因挖掘；Science：張峰建立CRISPR/Cas9人細(xì)胞敲除體系）。就在最近，CRISPR 還幫助研究人員完成了攜帶特殊基因中斷（gene disruptions）的工程猴，這項(xiàng)壯舉此前曾在小鼠中實(shí)現(xiàn)過，但未在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中完成過（詳細(xì)報(bào)道 Cell：中國(guó)科學(xué)家利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建基因工程猴）。 CRISPR 本身是一種防御系統(tǒng)，用以保護(hù)細(xì)菌和古細(xì)菌細(xì)胞不受病毒的侵害。在這些生物基因組中的 CRISPR 位點(diǎn)能表達(dá)與入侵病毒基因組序列相匹配的小分子 RNA。當(dāng)微生物感染了這些病毒中的一種，CRISPR RNA 就能通過互補(bǔ)序列結(jié)合病毒基因組，并表達(dá) CRISPR 相關(guān)酶，也就是 Cas，這些酶都是核酸酶，能切割病毒 DNA，阻止病毒完成其功能。 將 CRISPR/Cas 系統(tǒng)用于其它非細(xì)菌細(xì)胞需要滿足兩個(gè)條件：一個(gè) Cas 酶，用于切斷靶標(biāo) DNA，比如目的基因中的 DNA 片段，另外一個(gè)就是稱為導(dǎo)向 RNA （gRNA）的 RNA 分子，這種分子能通過互補(bǔ)結(jié)合靶標(biāo)。gRNA 也就是細(xì)菌細(xì)胞中 CRISPR RNA 的一個(gè)更短的版本，它能與 Cas 形成復(fù)合物，指導(dǎo) Cas 到達(dá)正確的剪切位點(diǎn)。不過研究人員也可以通過結(jié)合其它元件，或者改變 Cas 活性，來調(diào)整這種工具在基因校正和基因調(diào)控方面的作用。 “目前，非傳統(tǒng)基因編輯應(yīng)用方面的生物學(xué)家利用一種新工具，分析細(xì)胞中，和整個(gè)生物機(jī)體中突變的作用”，來自加州大學(xué)伯克利分校的生物化學(xué)教授Jennifer Doudna 表示，她與她的同事解析了細(xì)菌細(xì)胞中 CRISPR 的作用機(jī)制。近期，Doudna 研究組利用這種工具，首次通過小鼠受精卵基因編輯構(gòu)建了敲除小鼠。 不過 CRISPR 技術(shù)也存在一個(gè)主要的缺點(diǎn)，那就是缺乏特異性：一些 gRNA 分子結(jié)合的 DNA 只是部分與 gRN 互補(bǔ)。在這一方面，其它基因編輯方法，如鋅指核酸酶（ZFN）和 TALENS 可能要比 Cas - gRNA 更為具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檫@兩者需要識(shí)別更長(zhǎng)的靶標(biāo) DNA 序列。但是 ZFN 和 TALENS 方法在克隆和細(xì)胞表達(dá)方面要比 gRNA 難得多，而且研究人員通常還需要驗(yàn)證十幾個(gè)不同的 TALENS，以及幾十個(gè)不同的 ZFNs，來證明其中一個(gè)有效。 近期《科學(xué)家》（The Scientist）雜志匯總了基因編輯過程中 Cas 和 gRNA 的處理過程及解決方案，用于幫助新接觸這一技術(shù)的研究人員熟悉這項(xiàng)熱門技術(shù)。 如何 CRISPR 我的靶標(biāo)？由于 CRISPR 系統(tǒng)并不復(fù)雜，因此我們所要做的就是將帶有質(zhì)粒（能表達(dá) Cas 和 gRNA）的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。研究人員可以采用一種 Cas 的變體，即 Cas9，這種酶來自于一種鏈球菌，由 RNA 進(jìn)行指引，能無需其他蛋白的幫助而切割 DNA （Science, 337:816-21, 2012）。Cas9 既能切斷與 gRNA 結(jié)合的 DNA 鏈，也能切斷其互補(bǔ)鏈。目前可以從 Addgene 購(gòu)買 Cas9 質(zhì)粒（65 美元），將其直接轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。

如何看待中國(guó)科學(xué)家基因編輯人類胚胎引起的爭(zhēng)議

　　1. 如何看待這次基因編輯人類胚胎這個(gè)工作？
　　首先這個(gè)工作從技術(shù)原理上來說沒有什么突破。
　　crispr這個(gè)蛋白在2002年被發(fā)現(xiàn)，而由于2012年在《科學(xué)》雜志上發(fā)表的一篇文章(1)而開始大紅大紫，且形成了一定會(huì)得諾貝爾獎(jiǎng)的技術(shù)：crispr-cas9。它的原理簡(jiǎn)單來說，可以看作剪切DNA的一把“剪刀”。它可以在DNA的特定位置上剪一個(gè)缺口，這個(gè)里面有兩個(gè)非常重要的特點(diǎn)，一個(gè)是在特定位置剪，另一個(gè)是能形成缺口，所有的對(duì)這個(gè)技術(shù)的應(yīng)用和后續(xù)文章都是利用這兩個(gè)特性。這篇文章中的修復(fù)DNA簡(jiǎn)單來說就是將基因組的對(duì)應(yīng)位置剪開，然后用一段好的DNA把之前錯(cuò)誤的DNA給替換掉。
　　以前也有一些DNA操作的“剪刀”，但剪起來非常復(fù)雜，而這次的“剪刀”太方便了，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)門檻大大降低。以前這個(gè)基因操作非常困難，代價(jià)也很大。所以很長(zhǎng)一段時(shí)間實(shí)驗(yàn)用的基因操作過的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室都傾向于找做過的實(shí)驗(yàn)室去要而不是自己做。
　　而現(xiàn)在基本上只要一個(gè)掌握完善細(xì)胞、分子操作的實(shí)驗(yàn)室就可以完成這個(gè)工作，這個(gè)技術(shù)讓基因操作平民化了。
　　這個(gè)從2012年開始發(fā)展的技術(shù)經(jīng)過了幾年發(fā)展，技術(shù)已經(jīng)相對(duì)完善了，從13年開始就不斷有文章對(duì)各種動(dòng)物植物的細(xì)胞進(jìn)行編輯。2014年猴子的胚胎也能夠編輯并能夠生出基因編輯過的猴子。(2)而人的細(xì)胞的編輯甚至胚胎干細(xì)胞的編輯也實(shí)現(xiàn)了。(3)因此可以說，對(duì)人胚胎的操作從技術(shù)上來說并不難。所以這片文章也確實(shí)做到了。
　　這篇文章做的不好的地方是沒有嘗試更好地去解決問題，只是想發(fā)個(gè)大新聞（笑）。這篇文章目的是想修復(fù)人胚胎里的錯(cuò)誤DNA導(dǎo)致的遺傳性疾病。
　　之前說crispr-cas9其實(shí)有一個(gè)問題，就是這個(gè)“剪刀”去剪基因組的時(shí)候會(huì)剪錯(cuò)地方，形成“脫靶效應(yīng)”，這個(gè)是需要避免的。文章中發(fā)現(xiàn)他們的實(shí)驗(yàn)存在比較高的，然后就下了這么個(gè)結(jié)論，而不是想著如何對(duì)能夠真的去修復(fù)這樣一個(gè)疾病。這其實(shí)是可以優(yōu)化的，而且之前已經(jīng)有文獻(xiàn)介紹了一些方法來抑制(4)。而且對(duì)于脫靶效應(yīng)的檢測(cè)如果真的嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑掃€是需要做全基因組測(cè)序而不是文章中用的外顯子測(cè)序，這樣才能比較全面評(píng)估。

crispr cas9怎么達(dá)到基因敲除的

近日，中國(guó)科學(xué)家利用基因編輯技術(shù)——CRISPR/Cas9，對(duì)抑制狗骨骼肌生長(zhǎng)的基因（MSTN）進(jìn)行了敲除，培育出兩只肌肉發(fā)達(dá)的“大力神”狗，成功構(gòu)建了世界首個(gè)基因敲除狗模型。

科研人員所使用的“基因編輯技術(shù)”，顧名思義，能夠讓人類對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術(shù)自問世以來，就有著其它基因編輯技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢(shì)，技術(shù)不斷改進(jìn)后，更被認(rèn)為能夠在活細(xì)胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。

一、與諾獎(jiǎng)“擦肩而過”的CRISPR/Cas9技術(shù)

這不是CRISPR/Cas9這項(xiàng)明星技術(shù)第一次得到人們的關(guān)注。在此之前，有著“豪華版”諾獎(jiǎng)之稱的“2015年度生命科學(xué)突破獎(jiǎng)”頒發(fā)給了發(fā)現(xiàn)基因組編輯工具“CRISPR/Cas9”的兩位美女科學(xué)家——珍妮弗·杜德娜和艾曼紐·夏邦杰。二人更是獲得了2015年度化學(xué)領(lǐng)域的引文桂冠獎(jiǎng)——素有諾獎(jiǎng)“風(fēng)向標(biāo)”之稱，曾被認(rèn)為是今年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的最有力競(jìng)爭(zhēng)者。

那CRISPR/Cas9到底是一項(xiàng)什么技術(shù)，為何能夠獲得如此這般青睞，又何以在短短兩三年時(shí)間內(nèi)，發(fā)展成為生物學(xué)領(lǐng)域最炙手可熱的研究工具之一，并有近700篇相關(guān)論文發(fā)表？它將來又會(huì)如何影響到我們的生活？

CRISPR/Cas9是繼“鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）”、“類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）”之后出現(xiàn)的第三代“基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)”。與前兩代技術(shù)相比，其成本低、制作簡(jiǎn)便、快捷高效的優(yōu)點(diǎn)，讓它迅速風(fēng)靡于世界各地的實(shí)驗(yàn)室，成為科研、醫(yī)療等領(lǐng)域的有效工具。

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