我學(xué)者開發(fā)精確的CRISPR注釋程序(爭(zhēng)當(dāng)?shù)诙髡叩奶K爾斯頓如何獲得諾貝爾獎(jiǎng)？)

我學(xué)者開發(fā)精確的CRISPR注釋程序

2016年09月10日訊 CRISPR系統(tǒng)對(duì)于原核生物免疫系統(tǒng)對(duì)抗入侵元素發(fā)揮關(guān)鍵的作用，也被設(shè)計(jì)成促進(jìn)真核生物基因組的靶向基因編輯。近期，來自中科院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院、湖北工業(yè)大學(xué)和吉林大學(xué)等處的研究人員，在《Scientific Reports》發(fā)表一項(xiàng)研究，提出了一種精確的從頭CRISPR注釋程序--CRISPRdigger，可以將一部分組裝的基因組作為其輸入。

這項(xiàng)研究的通訊作者是吉林大學(xué)計(jì)算機(jī)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院的周豐豐教授，其2000年本科畢業(yè)于中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)少年班，2005年在中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)計(jì)算機(jī)學(xué)院獲博士學(xué)位，是吉林大學(xué)“唐敖慶”教授，博士生導(dǎo)師，中國(guó)科學(xué)院百人計(jì)劃，IEEE（美國(guó)電氣和電子工程師協(xié)會(huì)）高級(jí)會(huì)員，主要從事健康大數(shù)據(jù)挖掘核心算法的研究。

CRISPRs是原核生物基因組中的重要遺傳因素，可從外來元素（如噬菌體）積極獲取模板序列，用于隨后的序列特異性切割。這些外來模板序列的長(zhǎng)度從24到48?bp不等，其中穿插分布著保守的重復(fù)序列。一種CRISPR通常是由結(jié)合在其密切側(cè)翼區(qū)上的前導(dǎo)區(qū)的一個(gè)相鄰CRISPR相關(guān)（Cas）基因轉(zhuǎn)錄的。在超過40%的已測(cè)序的原核基因組中，CRISPR / CAS系統(tǒng)充當(dāng)一種反入侵的免疫機(jī)制。

作為一種真核生物基因組編輯技術(shù)，CRISPR/Cas系統(tǒng)吸引了相當(dāng)多的關(guān)注，因?yàn)樗汕懈钐囟ǖ男蛄行盘?hào)。發(fā)展最好的酶是來自化膿性鏈球菌的核酸酶Cas9，用一段合適的向?qū)NA片段，它可能在任何基因組的位置進(jìn)行切割。另一種廣泛使用的基因組編輯技術(shù)TALEN，需要研究人員為每個(gè)靶基因組位置合成一種核酸酶，比起只合成一種向?qū)NA，這成本更高，而且更費(fèi)時(shí)。隨著臨床應(yīng)用對(duì)靶專一性的要求越來越高，目前已經(jīng)推出了一些Cas9突變體，它們具有超過50倍的較高特異性。

目前，已經(jīng)開發(fā)出一些計(jì)算機(jī)程序，用于原核基因組中天然CRISPR的從頭檢測(cè)。自上世紀(jì)80年代被發(fā)現(xiàn)以來，研究人員已經(jīng)分析了2762個(gè)原核生物基因組，在47.14%的基因組中檢測(cè)到了CRISPRs，平均每個(gè)基因組有1.47個(gè)CRISPR。然而，原核生物的基因組測(cè)序在加速，在2015年9月，NCBI的微生物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中就包含了4278個(gè)基因組。因此，在一個(gè)新完成測(cè)序的原核生物基因組中從頭注釋CRISPRs，對(duì)于更好地了解這個(gè)免疫系統(tǒng)是必要的。PILER-CR來源于重復(fù)檢測(cè)程序PILER20，并在一個(gè)小的基因組中篩選CRISPRs。CRT篩選一個(gè)基因組中確切的k-mer / k-nucleotide重復(fù)序列，并將相鄰的重復(fù)序列連接到候選CRISPRs。CRISPRFinder使用Vmatch來檢測(cè)連續(xù)定位的重復(fù)序列，并能夠更好地注釋DR邊界和短CRISPRs。

本研究提出了一種新的從頭CRISPR檢測(cè)程序--CRISPRdigger，并重點(diǎn)檢測(cè)弱的DR信號(hào)，在當(dāng)前的文獻(xiàn)中這通常是被錯(cuò)過了。從頭重復(fù)檢測(cè)程序RepeatScout被用來在一系列的序列長(zhǎng)度范圍內(nèi)找到重復(fù)拷貝。在這些重復(fù)拷貝被聚類之后，弱的DR副本被RepeatMasker注釋--通過將模板DRs映射到基因組中。與現(xiàn)有程序的比較是基于來自dbCRISPR數(shù)據(jù)庫(kù)的金標(biāo)準(zhǔn)CRISPR注釋，在2014四月14日進(jìn)行了更新。

研究人員發(fā)現(xiàn)，dbCRISPR包括DRs和間隔的所有的位置和序列信息。它比其他程序更方便和準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，CRISPRdigger可能是對(duì)現(xiàn)有工具的一個(gè)很好的補(bǔ)充。該論文對(duì)本研究所使用的數(shù)據(jù)和crisprdigger算法進(jìn)行了描述，接著對(duì)dbCRISPR中注釋的CRISPRs進(jìn)行了基本概述，并對(duì)CRISPRdigger與現(xiàn)有的程序進(jìn)行了綜合比較。

爭(zhēng)當(dāng)?shù)诙髡叩奶K爾斯頓如何獲得諾貝爾獎(jiǎng)？

蘇爾斯頓，圖片來自諾貝爾獎(jiǎng)官網(wǎng)

導(dǎo)語(yǔ)：

3月14日，76歲的霍金離開了，備受世人關(guān)注。而在上周的3月6日，76歲的諾獎(jiǎng)得主蘇爾斯頓也離開了人世，卻“走”得靜悄悄。

事實(shí)上，紀(jì)念偉大科學(xué)家最好的方式，是繼續(xù)他們未完成的事業(yè)。蘇爾斯頓可以說是細(xì)胞圖譜工程的先驅(qū)。他開拓了細(xì)胞譜系領(lǐng)域，過去數(shù)十年未有很大的突破，直到最近兩年有了重大進(jìn)展，西雅圖華盛頓大學(xué)的Jay Shendure結(jié)合最新的測(cè)序技術(shù)和CRISPR基因編輯技術(shù)，開發(fā)了高通量解析高等生物細(xì)胞譜系的辦法。在其他一些科學(xué)家的牽頭下，另一個(gè)可能給生命科學(xué)帶來巨變的科學(xué)大工程：人類細(xì)胞圖譜工程（Human Cell Atlas）也在近期展開。也許我們離解析生物發(fā)育的全部秘密，已經(jīng)不再遙遠(yuǎn)。

撰文孫夢(mèng)逸

責(zé)編葉水送

2018年3月6日，2002年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主約翰蘇爾斯頓（John Sulston）爵士與世長(zhǎng)辭，享年76歲。這一消息得到了蘇爾斯頓生前任職的桑格研究所（Sanger Institute）的確認(rèn)，死因是胃癌。

蘇爾斯頓爵士曾兩次撼動(dòng)世界：第一次是追蹤線蟲（C.elegans）的完整細(xì)胞譜系（cell lineage）；第二次是幫助并促成了人類歷史上最宏偉的國(guó)際合作項(xiàng)目之一——人類基因組計(jì)劃（HGP）。

1942年3月，蘇爾斯頓出生在英國(guó)白金漢郡富爾默小鎮(zhèn)。他的父親是一位基督教牧師，母親則是一位英語(yǔ)教師。盡管出生在一個(gè)基督教家庭（從小接受基督教教育），小時(shí)候的蘇爾斯頓就展現(xiàn)了對(duì)物理世界運(yùn)行規(guī)律的熱愛，并順理成章地把科學(xué)作為以后的發(fā)展方向。當(dāng)然，對(duì)科學(xué)的了解讓他幾乎是不可避免地同時(shí)失去了對(duì)基督教的信仰，這曾讓他的父母非?？鄲?。但蘇爾斯頓開明的父母最終還是選擇了尊重孩子的興趣和意志。

這里有個(gè)小插曲：蘇爾斯頓當(dāng)時(shí)出于一時(shí)沖動(dòng)選擇了攻讀生物學(xué)。和今天一樣，他的身邊充滿了勸退的人。盡管如此，蘇爾斯頓還是堅(jiān)持了自己的決定，修讀了生物、物理和化學(xué)。

1960年，在分子生物學(xué)開始興盛的年代，蘇爾斯頓來到了當(dāng)時(shí)分子生物學(xué)的中心——?jiǎng)虼髮W(xué)攻讀學(xué)士學(xué)位。和大多數(shù)年輕人一樣，蘇爾斯頓的大學(xué)生涯也經(jīng)歷過迷茫：不善交際的痛苦，去劇院追劇和課業(yè)的沖突，以及作為一個(gè)心靈手巧但讀書不好（“I'm not a books person but a hands person”）的少年，被充滿識(shí)記的生物學(xué)折騰得夠嗆。當(dāng)然在大學(xué)的最后一年，他幡然醒悟，回歸正途。

拿到學(xué)士學(xué)位之后，蘇爾斯頓繼續(xù)在劍橋大學(xué)攻讀博士學(xué)位，師從科林里斯（Colin Reese），研究多聚核酸的合成。那是他學(xué)術(shù)生涯的開始，也是他以后美滿人生的發(fā)端——在這里，他認(rèn)識(shí)了一生的摯愛，當(dāng)時(shí)在劍橋大學(xué)做助研的達(dá)芙妮芭特（Daphne Bate）。

蘇爾斯頓的博士階段過得十分愉快，加上沒有書本的束縛，他可以盡情地發(fā)揮自己動(dòng)手的特長(zhǎng)。三年內(nèi)，他就獲得了博士學(xué)位，并和芭特喜結(jié)連理。畢業(yè)之后，根據(jù)導(dǎo)師的建議，他把天賦帶到了美國(guó)的西海岸，地處圣地亞哥的Salk 研究所，跟從Leslie Orgel研究有關(guān)生命起源的化學(xué)機(jī)理。

在Salk的第二年，Leslie把他引薦給了分子生物學(xué)的泰斗，當(dāng)時(shí)還在劍橋大學(xué)的弗朗西斯克里克（Francis Crick）和悉尼布倫納（Sydney Brenner）。那時(shí)的分子生物學(xué)可謂如日中天，風(fēng)頭無兩。然而幾位分子生物學(xué)的開山之祖，卻在這時(shí)悄然轉(zhuǎn)變了方向?？死锟撕臀髂緷桑⊿eymour Benzer）都轉(zhuǎn)向了神經(jīng)科學(xué)，而布倫納在那時(shí)鼓搗起了不被人看好的新模式生物——線蟲。

線蟲，圖片來源 sanger.ac.uk

這是一種通體透明、體長(zhǎng)僅一毫米左右的蠕蟲。因?yàn)橥w透明，所以易于在顯微鏡下觀察，飼養(yǎng)起來也非常方便，給它們喂大腸桿菌就成了。線蟲的繁殖周期也短，大約3天左右，這讓線蟲成為十分理想的模式動(dòng)物。然而，這些都是后見之明，當(dāng)時(shí)的學(xué)界對(duì)布倫納的選擇充滿了嘲諷，有的學(xué)者甚至把線蟲和一種扁蟲搞混。蘇爾斯頓卻因此對(duì)布倫納的工作產(chǎn)生了強(qiáng)烈的興趣：好的科學(xué)就是要做別人都不在做的事情（“there's little point in doing what everybody else is doing”）。在布倫納的勸說下，蘇爾斯頓回到了夢(mèng)開始的地方——?jiǎng)虼髮W(xué)，加入了布倫納的研究組。這兒又有一個(gè)小插曲：回到劍橋之前，蘇爾斯頓機(jī)緣湊巧，參加了一個(gè)暑期項(xiàng)目，學(xué)到了一種觀察神經(jīng)遞質(zhì)在組織分布中的小技巧。

這一技巧讓蘇爾斯頓在繁忙的線蟲分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)之余，開啟了一個(gè)小項(xiàng)目：觀察線蟲的神經(jīng)元。這個(gè)小項(xiàng)目倒沒讓他發(fā)現(xiàn)什么重要的神經(jīng)元。然而，敏銳的蘇爾斯頓注意到一件事情：比起剛孵化的線蟲，成體線蟲似乎多了幾對(duì)神經(jīng)元。這是個(gè)讓人驚訝的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)樵诋?dāng)時(shí)大多數(shù)人都認(rèn)為線蟲的發(fā)育在孵化出來之后就停止了。于是蘇爾斯頓有了觀察線蟲孵化后的細(xì)胞發(fā)育譜系樹（cell lineage）的想法。

什么是細(xì)胞發(fā)育譜系呢？多細(xì)胞生物的發(fā)育，都是從單個(gè)細(xì)胞（受精卵）開始的。通過細(xì)胞分裂和分化，一變二，二變四，最終形成整個(gè)組織分明秩序井然的生物體。這個(gè)過程可形象地描繪成一棵倒置的樹。

細(xì)胞譜系樹簡(jiǎn)圖，圖片來源Aaron et al,2016

樹的頂端是受精卵，每一次分叉代表一次細(xì)胞分裂事件，而樹的終端（底部）代表的是成體生物的每一個(gè)細(xì)胞。這棵樹就是細(xì)胞譜系樹。如果我們能夠知道這棵樹的全貌，相當(dāng)于知道了生物的整個(gè)發(fā)育過程。想知道人類的肝臟是如何發(fā)育過來的？查查人類細(xì)胞譜系樹（如果有的話）里對(duì)應(yīng)的肝細(xì)胞，往上回溯到頂點(diǎn)，你就知道了這個(gè)器官發(fā)育的整個(gè)過程。

除此之外，如果能夠知道譜系樹上每一個(gè)節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生的分子事件，比如哪些基因在這個(gè)節(jié)點(diǎn)被激活或沉默，我們就掌握了細(xì)胞類型切換的鑰匙。掌握了這把鑰匙，也許有一天我們可方便地制造出各種各樣的健康器官，用于替換病變或衰老的人體器官，人類的壽命也將會(huì)大大延長(zhǎng)。

可以說，發(fā)育生物學(xué)的全部問題，就是繪制和注釋這棵細(xì)胞譜系樹。布倫納早有做線蟲的細(xì)胞譜系樹的想法。不過，當(dāng)時(shí)大家都認(rèn)為線蟲在孵化之后就停止發(fā)育了，研究的重點(diǎn)一直在胚胎產(chǎn)生到孵化前的階段。但觀察這一階段的細(xì)胞譜系極其困難。原因是在胚胎發(fā)育早期，大量細(xì)胞會(huì)發(fā)生重排，這讓細(xì)胞追蹤起來極具挑戰(zhàn)。當(dāng)線蟲孵化之后，定位細(xì)胞就容易得多了。然而，孵化之后的線蟲觀察起來也有其他的困難：線蟲會(huì)到處爬。最后蘇爾斯頓采用了一個(gè)巧妙的辦法：在視野的中心放置一盤美味的大腸桿菌。這樣線蟲就會(huì)在視野的中央緩緩蠕動(dòng)，觀察就變得容易多了。大約在蘇爾斯頓研究出怎樣觀察線蟲孵化后的發(fā)育的同時(shí)，另一位日后獲得諾貝爾獎(jiǎng)的科學(xué)家羅伯特霍維茨（Robert Horvitz），加入了布倫納實(shí)驗(yàn)室。兩人通力合作，共同把線蟲孵化后的發(fā)育樹繪制了出來，論文發(fā)表在Developmental Biology雜志上（影響因子：2.944）。發(fā)表的時(shí)候還有一件趣事：兩人據(jù)說爭(zhēng)當(dāng)?shù)诙髡?，都想把credit給對(duì)方。最后是霍維茨爭(zhēng)贏了：他知道蘇爾斯頓并不喜歡寫作，于是提出自己來寫文章，蘇爾斯頓由此被列為第一作者。這之后，兩人分別轉(zhuǎn)向了不同的方向：霍維茨轉(zhuǎn)而研究在觀察細(xì)胞譜系發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，而蘇爾斯頓則再接再厲，和約翰懷特（John White）、朱迪思金布爾（Judith Kimble）等人把孵化前的細(xì)胞譜系也繪制出來了。下圖就是線蟲的完整細(xì)胞譜系樹：

線蟲的完整細(xì)胞譜系樹，圖片來源：Sulston JE,2003

這也是迄今為止唯一的細(xì)胞譜系樹。憑借這個(gè)工作，蘇爾斯頓獲得了2002年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。與他一同獲獎(jiǎng)的是他的搭檔：霍維茨和他的老師布倫納，霍維茨主要貢獻(xiàn)是細(xì)胞凋亡機(jī)制，而布倫納是這一切工作的開始。

在完成細(xì)胞譜系的工作之后，蘇爾斯頓又一次展現(xiàn)了他不凡的眼光。所有人都認(rèn)為，蘇爾斯頓應(yīng)該接下去研究那些可導(dǎo)致細(xì)胞譜系變化的基因突變。蘇爾斯頓的想法是：這個(gè)分析已有不少人在著手做了，參與進(jìn)去還有什么意義？他把眼光轉(zhuǎn)向了對(duì)線蟲基因組進(jìn)行測(cè)序的可能性。他也是第一批嘗試用生物信息的方式組裝基因測(cè)序片段的人，還自學(xué)當(dāng)時(shí)常用的編程語(yǔ)言：Fortran，寫了一個(gè)半自動(dòng)的組裝小程序。

與此同時(shí)，在蘇爾斯頓的共同倡議和推動(dòng)下，生命科學(xué)研究史上第一個(gè)國(guó)際合作的大工程——人類基因組計(jì)劃啟動(dòng)。蘇爾斯頓的工作主要是募集資金和組織合作，這里不再細(xì)表。值得一提的是，在推動(dòng)人類基因組計(jì)劃的同時(shí)，蘇爾斯頓和當(dāng)時(shí)的測(cè)序競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手、私人公司塞雷拉基因組公司（Celera Genomics）的領(lǐng)頭人克雷格文特爾（Craig Venter）對(duì)基因組測(cè)序結(jié)果是否應(yīng)該商業(yè)化，有過著名的論爭(zhēng)，它也是科學(xué)家參與公眾議題的典范。

2018年3月6日，蘇爾斯頓因胃癌去世，結(jié)束了他傳奇的一生。

參考文獻(xiàn)

[1] Sulston, John E."NOBEL LECTURE: C. elegans: The Cell Lineage and Beyond." Bioscience reports 23.2-3(2003):49-66.

[2] Brenner, Sydney."Nobel lecture: nature's gift to science." Bioscience reports 23.5-6(2003):225-237.

[3] Horvitz, H. Robert."Worms, life, and death (Nobel lecture)." Chembiochem 4.8(2003):697-711.

[4] Brenner, Sydney."In the beginning was the worm?." Genetics 182.2(2009):413-415.

[5] McKenna, Aaron, et al."Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing." Science 353.6298(2016): aaf7907.

[6] Regev, Aviv, et al."Science forum: the human cell atlas." Elife 6(2017): e27041.

[7]https://www.nobelprize.org/nobelprizes/medicine/laureates/2002/sulston-bio.html

斑馬魚基因敲除常規(guī)流程及關(guān)鍵步驟質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)及注釋

一、設(shè)計(jì)方案

1.1 基因的基本信息

確認(rèn)基因的基本信息，包括名稱ID號(hào)等，一般會(huì)在NCBI等查詢。

1.2?分析基因結(jié)構(gòu)、氨基酸序列等做生物學(xué)信息的分析

1.3分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)功能域

通過綜合考慮，設(shè)計(jì)最佳的KO靶點(diǎn)。

1.4分析并設(shè)計(jì)CRISPR，分析其效率及脫靶的情況

一般使用CCTOP，少數(shù)物種如沒有可找其它專業(yè)網(wǎng)站。

二、CRISPR活性驗(yàn)證

2.1分析并確認(rèn)基因組序列

設(shè)計(jì)Genotyping引物，確認(rèn)實(shí)際基因組序列與理論匹配情況，如CRISPR靶點(diǎn)驗(yàn)證與理論序列存在出入，需回到1.4重做。

該步驟還需要確認(rèn)引物擴(kuò)增條件，以備后用，如不能正常擴(kuò)增需要重新設(shè)計(jì)，并且不能進(jìn)行下一步操作。

2.2合成sgRNA

使用Thermo轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄，完成后需測(cè)定濃度（不得低于400 ng/μl）和OD值（260/280需在1.8~2.2）。

2.3顯微注射

將上述合成好的sgRNA按照一定的比例與Cas9蛋白預(yù)混，使用顯微注射技術(shù)將其注入斑馬魚早起胚胎中。

2.4活性驗(yàn)證

隨機(jī)選取8~24 hpf的8枚注射后的胚胎通過PCR后將其產(chǎn)物送商業(yè)公司sanger測(cè)序，需要看到至少有一組在靶向位置存在Indel突變。

[if !supportLists]1）?[endif]如有，挑取存在Indel突變的亞克隆確認(rèn)；

[if !supportLists]2）?[endif]如沒有，回到2.3或2.2或1.4（具體回到哪一步需要根據(jù)實(shí)際情況決定）

三、突變體制備及確認(rèn)

3.1 F0飼養(yǎng)

如2.4驗(yàn)證有活性，一般需要顯微注射400~500枚胚胎作為F0（一般由胚胎發(fā)育至成體有10~20%），至少需要40尾以上的F0。

3.2 F0可遺傳突變的確認(rèn)

將上述F0親本與野生型雜交（或者自交），將所產(chǎn)胚胎隨機(jī)選取8枚經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，如存在Indel突變，則該F0親本即為可遺傳突變體。以此方法至少鑒定出3尾可遺傳的F0。

3.3 F1飼養(yǎng)

將3.2至少3尾親本經(jīng)交配，每組一般15~25尾，一般總量需到達(dá)40~50尾。

3.4 F1確認(rèn)

將3.3的F1飼養(yǎng)至2~2.5月齡,獲得其尾鰭基因組，通過PCR后測(cè)序確認(rèn)其具體基因型（要求必須是移碼突變或出現(xiàn)提前終止密碼子的突變）。

四、最終交付產(chǎn)品

至少獲得3尾以上移碼突變F1代斑馬魚（不限雌雄、不限具體突變類型），以及上述結(jié)項(xiàng)報(bào)告一份。

后續(xù)服務(wù)

一般客戶拿到3尾移碼突變斑馬魚并不能直接做實(shí)驗(yàn)，還需要繼續(xù)擴(kuò)繁、建系或做后研究等，因此我們也有后續(xù)服務(wù)。

五、突變體傳代

釋義：根據(jù)客戶具體要求，通過自交（或者雜交），將某一種（或者多種）突變型擴(kuò)大種群（或保持種群。

根據(jù)客戶常規(guī)要求，我們一般提供30~40尾（雌雄各不少于8尾）經(jīng)堯順禹鑒定后的確認(rèn)為突變體的Fn+1代斑馬魚。

六、表型觀察及基因功能研究

定制化服務(wù)，依據(jù)客戶實(shí)際要求實(shí)現(xiàn)。

?一、設(shè)計(jì)方案

1.1 基因的基本信息

確認(rèn)基因的基本信息，包括名稱ID號(hào)等，一般會(huì)在NCBI等查詢。

1.2?分析基因結(jié)構(gòu)、氨基酸序列等做生物學(xué)信息的分析

1.3分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)功能域

通過綜合考慮，設(shè)計(jì)最佳的KO靶點(diǎn)。

1.4分析并設(shè)計(jì)CRISPR，分析其效率及脫靶的情況

一般使用CCTOP，少數(shù)物種如沒有可找其它專業(yè)網(wǎng)站。

二、CRISPR活性驗(yàn)證

2.1分析并確認(rèn)基因組序列

設(shè)計(jì)Genotyping引物，確認(rèn)實(shí)際基因組序列與理論匹配情況，如CRISPR靶點(diǎn)驗(yàn)證與理論序列存在出入，需回到1.4重做。

該步驟還需要確認(rèn)引物擴(kuò)增條件，以備后用，如不能正常擴(kuò)增需要重新設(shè)計(jì)，并且不能進(jìn)行下一步操作。

2.2合成sgRNA

使用Thermo轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄，完成后需測(cè)定濃度（不得低于400 ng/μl）和OD值（260/280需在1.8~2.2）。

2.3顯微注射

將上述合成好的sgRNA按照一定的比例與Cas9蛋白預(yù)混，使用顯微注射技術(shù)將其注入斑馬魚早起胚胎中。

2.4活性驗(yàn)證

隨機(jī)選取8~24 hpf的8枚注射后的胚胎通過PCR后將其產(chǎn)物送商業(yè)公司sanger測(cè)序，需要看到至少有一組在靶向位置存在Indel突變。

[if !supportLists]1）?[endif]如有，挑取存在Indel突變的亞克隆確認(rèn)；

[if !supportLists]2）?[endif]如沒有，回到2.3或2.2或1.4（具體回到哪一步需要根據(jù)實(shí)際情況決定）

三、突變體制備及確認(rèn)

3.1 F0飼養(yǎng)

如2.4驗(yàn)證有活性，一般需要顯微注射400~500枚胚胎作為F0（一般由胚胎發(fā)育至成體有10~20%），至少需要40尾以上的F0。

3.2 F0可遺傳突變的確認(rèn)

將上述F0親本與野生型雜交（或者自交），將所產(chǎn)胚胎隨機(jī)選取8枚經(jīng)測(cè)序確認(rèn)，如存在Indel突變，則該F0親本即為可遺傳突變體。以此方法至少鑒定出3尾可遺傳的F0。

3.3 F1飼養(yǎng)

將3.2至少3尾親本經(jīng)交配，每組一般15~25尾，一般總量需到達(dá)40~50尾。

3.4 F1確認(rèn)

將3.3的F1飼養(yǎng)至2~2.5月齡,獲得其尾鰭基因組，通過PCR后測(cè)序確認(rèn)其具體基因型（要求必須是移碼突變或出現(xiàn)提前終止密碼子的突變）。

四、最終交付產(chǎn)品

至少獲得3尾以上移碼突變F1代斑馬魚（不限雌雄、不限具體突變類型），以及上述結(jié)項(xiàng)報(bào)告一份。

后續(xù)服務(wù)

一般客戶拿到3尾移碼突變斑馬魚并不能直接做實(shí)驗(yàn)，還需要繼續(xù)擴(kuò)繁、建系或做后研究等，因此我們也有后續(xù)服務(wù)。

五、突變體傳代

釋義：根據(jù)客戶具體要求，通過自交（或者雜交），將某一種（或者多種）突變型擴(kuò)大種群（或保持種群。

根據(jù)客戶常規(guī)要求，我們一般提供30~40尾（雌雄各不少于8尾）經(jīng)堯順禹鑒定后的確認(rèn)為突變體的Fn+1代斑馬魚。

六、表型觀察及基因功能研究

定制化服務(wù)，依據(jù)客戶實(shí)際要求實(shí)現(xiàn)。

本文地址:http://www.mcys1996.com/jiankang/299373.html.

聲明： 我們致力于保護(hù)作者版權(quán)，注重分享，被刊用文章因無法核實(shí)真實(shí)出處，未能及時(shí)與作者取得聯(lián)系，或有版權(quán)異議的，請(qǐng)聯(lián)系管理員，我們會(huì)立即處理，本站部分文字與圖片資源來自于網(wǎng)絡(luò)，轉(zhuǎn)載是出于傳遞更多信息之目的,若有來源標(biāo)注錯(cuò)誤或侵犯了您的合法權(quán)益，請(qǐng)立即通知我們(管理員郵箱：douchuanxin@foxmail.com)，情況屬實(shí)，我們會(huì)第一時(shí)間予以刪除，并同時(shí)向您表示歉意,謝謝!

上一篇: 北京大學(xué)生科院鄭曉峰發(fā)表關(guān)于核糖體的···

下一篇: 4篇Cell及子刊發(fā)布艾滋病重大突破