FEBS發(fā)布CRISPR技術(shù)特刊(CRISPRa基因過表達(dá)技術(shù))

佚名 2024-06-03 03:11:23

FEBS發(fā)布CRISPR技術(shù)特刊

2016年09月10日訊《FEBS Journal》雜志近日發(fā)布了一份介紹如何使用CRISPR/Cas9的特刊，它包含9篇綜述文章

，由知名研究人員撰寫，包括哈佛大學(xué)的George Church和Norbert Perrimon

，西班牙阿利坎特大學(xué)的Francisco Mojica

，以及Sloan Kettering紀(jì)念癌癥中心的Ralph Garippa。

這份特刊覆蓋了CRISPR的發(fā)現(xiàn)

、CRISPR篩選、表觀遺傳編輯

、模式生物和疾病模型中的CRISPR

、向?qū)NA（gRNA）設(shè)計

、脫靶效應(yīng)

，以及在治療應(yīng)用中與RNAi的比較

。

“我們希望這些綜述就像它們介紹的技術(shù)一樣將是有用的，立足于科學(xué)事實

，并為探索提供指導(dǎo)，”Broad研究院遺傳擾動平臺的主管John Doench在文中寫道

。

如今

，科學(xué)界對CRISPR技術(shù)的熱情日益高漲

。論文的數(shù)量在呈系數(shù)增長

。然而，許多研究人員仍在苦苦掙扎

，不能很好地使用它?div id="m50uktp" class="box-center"> ！凹词故鞘殖墒斓墓ぞ?div id="m50uktp" class="box-center"> ，如限制性內(nèi)切酶、抗體和Sanger測序

，日常應(yīng)用中仍時有失敗，需要進(jìn)行故障排查

，”Doench寫道

。“每篇綜述頭腦冷靜地評估了如何最好地應(yīng)用這項技術(shù)

、它的優(yōu)勢以及它的局限性?div id="d48novz" class="flower left">

！?/p>

CRISPR最早是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的

，作為細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)

。20多年前

，F(xiàn)rancisco Mojica發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌中的CRISPR結(jié)構(gòu)。這一次

，他與米格爾埃爾南德斯大學(xué)的Francisco Rodriguez-Valera一起介紹了這項技術(shù)的一些背景。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)也作為一種新穎的篩選方法

，來鑒定生物過程中的重要蛋白

。Sloan Kettering紀(jì)念癌癥中心的Ralph Garippa和John Poirier以及約翰？霍普金斯大學(xué)的Linde Miles為這一應(yīng)用提出了一些建議。

George Church以及他實驗室的一些成員討論了CRISPR革命的下一站：RNA指導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控

。最近，Cas9蛋白與效應(yīng)物的融合

，如轉(zhuǎn)錄激活子

、抑制子和組蛋白修飾物

，實現(xiàn)了可編程的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)控

。這篇綜述討論了基因調(diào)控的CRISPR工具，以及使用這些工具的最佳做法

。

還有幾篇綜述主要介紹了CRISPR在疾病建模和模式生物中的應(yīng)用。Sloan Kettering紀(jì)念癌癥中心的Geulah Livshits及其同事介紹了利用CRISPR來研究體內(nèi)的基因功能

，重點在小鼠的疾病建模

；西北大學(xué)的Erik Andersen和Mostafa Zamanian介紹了CRISPR在線蟲中的應(yīng)用，以研究熱帶疾?div id="4qifd00" class="flower right">

。毁e夕法尼亞大學(xué)的Kiran Musunuru和Jennie Lin則介紹了利用CRISPR建立疾病模型時的注意事項

。

CRISPRa基因過表達(dá)技術(shù)

上回說到

，基因功能研究，最常用的策略就是功能獲得和功能失活

。基因過表達(dá)

、基因干擾

、基因敲除，這三板斧揮出去，配合下游的轉(zhuǎn)錄譜分析

、表型分析

，基因功能的神秘面紗，往往就能解開一角

。

基因過表達(dá)技術(shù)，通常是指將目的基因的ORF構(gòu)建到組成型啟動子或組織特異性啟動子的下游

，通過載體轉(zhuǎn)入某一特定細(xì)胞中

，實現(xiàn)基因表達(dá)量增加的目的，可以使用的載體類型有Virus-Free轉(zhuǎn)座子載體，慢病毒載體

，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體等多種類型

。當(dāng)基因表達(dá)產(chǎn)物超過正常水平時

，觀察該細(xì)胞的生物學(xué)行為變化，從而了解該基因的功能

。

CRISPRa(轉(zhuǎn)錄激活)，作為基因過表達(dá)技術(shù)的新成員

，是通過催化失活的Cas9（dCas9）連上轉(zhuǎn)錄激活子

，來實現(xiàn)促進(jìn)基因組特定位點的轉(zhuǎn)錄

。

目前CRISPRa已經(jīng)發(fā)展出好幾個新版本

。MIT的CRISPR先驅(qū)張鋒通過改造dCas9和sgRNA優(yōu)化了轉(zhuǎn)錄機(jī)器的招募，成功將RNA表達(dá)水平提升了一個數(shù)量級

。張鋒團(tuán)隊用自己的改良版CRISPRa激活了十個基因,研究顯示，這些基因的轉(zhuǎn)錄都得到了兩倍以上的增漲

，許多基因的活性甚至有了幾個數(shù)量級的增加

。他們發(fā)現(xiàn)，CRISPRa離轉(zhuǎn)錄起始位點越近

，轉(zhuǎn)錄激活的效果就越強(qiáng)。如果CRISPRa靶向轉(zhuǎn)錄起始位點的上游（超過200bp）

，觸發(fā)的轉(zhuǎn)錄就會更為溫和

，更接近生理水平。通過這一途徑揭示了基因表達(dá)量與表型強(qiáng)度之間的線性關(guān)系

。

加州大學(xué)的Jonathan Weissman研究團(tuán)隊在dCas9上融合了一連串短肽（也就是SunTag array），這些短肽相當(dāng)于一套分子掛鉤

，能在細(xì)胞中招募多拷貝的轉(zhuǎn)錄激活子

，生成強(qiáng)勁的信號。

綜合看CRISPRa（基因激活）系統(tǒng)是用于轉(zhuǎn)錄激活內(nèi)源性基因的強(qiáng)大工具

。完整的CRISPRa系統(tǒng)包含三個組分，每個組分分別由單獨的載體提供：gRNA/MS2表達(dá)載體

，MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64輔助載體

。

gRNA/MS2表達(dá)載體

，包括兩個138-nt發(fā)夾RNA適體

，形成噬菌體MS2衣殼蛋白的結(jié)合位點

。這些發(fā)夾RNA適體與gRNA連接，有利于高效募集MS2-融合蛋白

。

MS2/P65/HSF1輔助載體驅(qū)動由MS2，p65（NF-kB的反式激活亞基）和HSF1（人熱休克因子1的激活結(jié)構(gòu)域）組成的三結(jié)構(gòu)域融合蛋白的表達(dá)

。

dCas9/VP64輔助載體驅(qū)動催化失活變體dCas9和合成型VP64反式激活結(jié)構(gòu)域融合蛋白的表達(dá)

。

當(dāng)這三種載體共轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞時，用戶定制的gRNA可能會募集MS2/P65/HSF1（通過MS2結(jié)合發(fā)夾適體與gRNA連接）和dCas9/VP64（通過CRISPR/Cas9復(fù)合物組裝）到gRNA靶位點

，從而組裝出強(qiáng)大的SAM復(fù)合物。這些SAM復(fù)合物可通過VP64

，p65和HSF1激活結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)同作用實現(xiàn)靶位點的強(qiáng)烈轉(zhuǎn)錄激活

。

該載體系統(tǒng)可用于激活單個或一系列基因的轉(zhuǎn)錄，也可用于基因組的大規(guī)模篩選

，使用gRNA序列文庫來產(chǎn)生gRNA/MS2表達(dá)載體文庫。?

Chavez A, et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming[J]. Nature Methods, 2015, 12(4): 326-328.??

J Microbiol Biotechnol. 2017 Oct 28;27(10):1855-1866. doi:?10.4014/jmb.1705.05081.

CRISPR a vs ORF 傳統(tǒng)過表達(dá) 技術(shù)

相比于傳統(tǒng)ORF穩(wěn)轉(zhuǎn)過表達(dá)技術(shù)

，CRISPRa通過激活內(nèi)源性啟動子高效轉(zhuǎn)錄

，從而促進(jìn)基因表達(dá)，不需要額外構(gòu)建外源性表達(dá)元件

，不受基因轉(zhuǎn)錄本大小的限制。

Kampmann M. (2018). CRISPRi and CRISPRa Screens in Mammalian Cells for Precision Biology and Medicine. ACS chemical biology, 13(2), 406–416.

因此

，CRISPRa技術(shù)在長轉(zhuǎn)錄本基因過表達(dá)研究

、單基因多轉(zhuǎn)錄本的整體激活研究具有不可替代的優(yōu)勢。

Cas9X|海星生物提供上述基因干擾

、基因過表達(dá)、基因敲除服務(wù)

，優(yōu)質(zhì)的三板斧

，助力您輕松前行。