FEBS發(fā)布CRISPR技術(shù)特刊(CRISPRa基因過(guò)表達(dá)技術(shù))

FEBS發(fā)布CRISPR技術(shù)特刊

2016年09月10日訊 《FEBS Journal》雜志近日發(fā)布了一份介紹如何使用CRISPR/Cas9的特刊，它包含9篇綜述文章，由知名研究人員撰寫(xiě)，包括哈佛大學(xué)的George Church和Norbert Perrimon，西班牙阿利坎特大學(xué)的Francisco Mojica，以及Sloan Kettering紀(jì)念癌癥中心的Ralph Garippa。

這份特刊覆蓋了CRISPR的發(fā)現(xiàn)、CRISPR篩選、表觀遺傳編輯、模式生物和疾病模型中的CRISPR、向?qū)NA（gRNA）設(shè)計(jì)、脫靶效應(yīng)，以及在治療應(yīng)用中與RNAi的比較。

“我們希望這些綜述就像它們介紹的技術(shù)一樣將是有用的，立足于科學(xué)事實(shí)，并為探索提供指導(dǎo)，”Broad研究院遺傳擾動(dòng)平臺(tái)的主管John Doench在文中寫(xiě)道。

如今，科學(xué)界對(duì)CRISPR技術(shù)的熱情日益高漲。論文的數(shù)量在呈系數(shù)增長(zhǎng)。然而，許多研究人員仍在苦苦掙扎，不能很好地使用它?！凹词故鞘殖墒斓墓ぞ?，如限制性內(nèi)切酶、抗體和Sanger測(cè)序，日常應(yīng)用中仍時(shí)有失敗，需要進(jìn)行故障排查，”Doench寫(xiě)道?！懊科C述頭腦冷靜地評(píng)估了如何最好地應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)、它的優(yōu)勢(shì)以及它的局限性?！?/p>

CRISPR最早是在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的，作為細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。20多年前，F(xiàn)rancisco Mojica發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌中的CRISPR結(jié)構(gòu)。這一次，他與米格爾埃爾南德斯大學(xué)的Francisco Rodriguez-Valera一起介紹了這項(xiàng)技術(shù)的一些背景。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)也作為一種新穎的篩選方法，來(lái)鑒定生物過(guò)程中的重要蛋白。Sloan Kettering紀(jì)念癌癥中心的Ralph Garippa和John Poirier以及約翰？霍普金斯大學(xué)的Linde Miles為這一應(yīng)用提出了一些建議。

George Church以及他實(shí)驗(yàn)室的一些成員討論了CRISPR革命的下一站：RNA指導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控。最近，Cas9蛋白與效應(yīng)物的融合，如轉(zhuǎn)錄激活子、抑制子和組蛋白修飾物，實(shí)現(xiàn)了可編程的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)控。這篇綜述討論了基因調(diào)控的CRISPR工具，以及使用這些工具的最佳做法。

還有幾篇綜述主要介紹了CRISPR在疾病建模和模式生物中的應(yīng)用。Sloan Kettering紀(jì)念癌癥中心的Geulah Livshits及其同事介紹了利用CRISPR來(lái)研究體內(nèi)的基因功能，重點(diǎn)在小鼠的疾病建模；西北大學(xué)的Erik Andersen和Mostafa Zamanian介紹了CRISPR在線蟲(chóng)中的應(yīng)用，以研究熱帶疾??；賓夕法尼亞大學(xué)的Kiran Musunuru和Jennie Lin則介紹了利用CRISPR建立疾病模型時(shí)的注意事項(xiàng)。

CRISPRa基因過(guò)表達(dá)技術(shù)

上回說(shuō)到，基因功能研究，最常用的策略就是功能獲得和功能失活?；蜻^(guò)表達(dá)、基因干擾、基因敲除，這三板斧揮出去，配合下游的轉(zhuǎn)錄譜分析、表型分析，基因功能的神秘面紗，往往就能解開(kāi)一角。

基因過(guò)表達(dá)技術(shù)，通常是指將目的基因的ORF構(gòu)建到組成型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子的下游，通過(guò)載體轉(zhuǎn)入某一特定細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)量增加的目的，可以使用的載體類型有Virus-Free轉(zhuǎn)座子載體，慢病毒載體，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體等多種類型。當(dāng)基因表達(dá)產(chǎn)物超過(guò)正常水平時(shí)，觀察該細(xì)胞的生物學(xué)行為變化，從而了解該基因的功能。

CRISPRa(轉(zhuǎn)錄激活)，作為基因過(guò)表達(dá)技術(shù)的新成員，是通過(guò)催化失活的Cas9（dCas9）連上轉(zhuǎn)錄激活子，來(lái)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)基因組特定位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄。

目前CRISPRa已經(jīng)發(fā)展出好幾個(gè)新版本。MIT的CRISPR先驅(qū)張鋒通過(guò)改造dCas9和sgRNA優(yōu)化了轉(zhuǎn)錄機(jī)器的招募，成功將RNA表達(dá)水平提升了一個(gè)數(shù)量級(jí)。張鋒團(tuán)隊(duì)用自己的改良版CRISPRa激活了十個(gè)基因,研究顯示，這些基因的轉(zhuǎn)錄都得到了兩倍以上的增漲，許多基因的活性甚至有了幾個(gè)數(shù)量級(jí)的增加。他們發(fā)現(xiàn)，CRISPRa離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)越近，轉(zhuǎn)錄激活的效果就越強(qiáng)。如果CRISPRa靶向轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游（超過(guò)200bp），觸發(fā)的轉(zhuǎn)錄就會(huì)更為溫和，更接近生理水平。通過(guò)這一途徑揭示了基因表達(dá)量與表型強(qiáng)度之間的線性關(guān)系。

加州大學(xué)的Jonathan Weissman研究團(tuán)隊(duì)在dCas9上融合了一連串短肽（也就是SunTag array），這些短肽相當(dāng)于一套分子掛鉤，能在細(xì)胞中招募多拷貝的轉(zhuǎn)錄激活子，生成強(qiáng)勁的信號(hào)。

綜合看CRISPRa（基因激活）系統(tǒng)是用于轉(zhuǎn)錄激活內(nèi)源性基因的強(qiáng)大工具。完整的CRISPRa系統(tǒng)包含三個(gè)組分，每個(gè)組分分別由單獨(dú)的載體提供：gRNA/MS2表達(dá)載體，MS2/P65/HSF1和dCas9/VP64輔助載體。

gRNA/MS2表達(dá)載體，包括兩個(gè)138-nt發(fā)夾RNA適體，形成噬菌體MS2衣殼蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。這些發(fā)夾RNA適體與gRNA連接，有利于高效募集MS2-融合蛋白。

MS2/P65/HSF1輔助載體驅(qū)動(dòng)由MS2，p65（NF-kB的反式激活亞基）和HSF1（人熱休克因子1的激活結(jié)構(gòu)域）組成的三結(jié)構(gòu)域融合蛋白的表達(dá)。

dCas9/VP64輔助載體驅(qū)動(dòng)催化失活變體dCas9和合成型VP64反式激活結(jié)構(gòu)域融合蛋白的表達(dá)。

當(dāng)這三種載體共轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞時(shí)，用戶定制的gRNA可能會(huì)募集MS2/P65/HSF1（通過(guò)MS2結(jié)合發(fā)夾適體與gRNA連接）和dCas9/VP64（通過(guò)CRISPR/Cas9復(fù)合物組裝） 到gRNA靶位點(diǎn)，從而組裝出強(qiáng)大的SAM復(fù)合物。這些SAM復(fù)合物可通過(guò)VP64，p65和HSF1激活結(jié)構(gòu)域之間的協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)的強(qiáng)烈轉(zhuǎn)錄激活。

該載體系統(tǒng)可用于激活單個(gè)或一系列基因的轉(zhuǎn)錄，也可用于基因組的大規(guī)模篩選，使用gRNA序列文庫(kù)來(lái)產(chǎn)生gRNA/MS2表達(dá)載體文庫(kù)。?

Chavez A, et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming[J]. Nature Methods, 2015, 12(4): 326-328.??

J Microbiol Biotechnol. 2017 Oct 28;27(10):1855-1866. doi:?10.4014/jmb.1705.05081.

CRISPR a vs ORF 傳統(tǒng)過(guò) 表達(dá) 技術(shù)

相比于傳統(tǒng)ORF穩(wěn)轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)技術(shù)，CRISPRa通過(guò)激活內(nèi)源性啟動(dòng)子高效轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)基因表達(dá)，不需要額外構(gòu)建外源性表達(dá)元件，不受基因轉(zhuǎn)錄本大小的限制。

Kampmann M. (2018). CRISPRi and CRISPRa Screens in Mammalian Cells for Precision Biology and Medicine. ACS chemical biology, 13(2), 406–416.

因此，CRISPRa技術(shù)在長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本基因過(guò)表達(dá)研究、單基因多轉(zhuǎn)錄本的整體激活研究具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。

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基因定點(diǎn)突破技術(shù)在什么才被普遍認(rèn)為獲得了成功

基因定點(diǎn)突破技術(shù)是指通過(guò)定向改變某個(gè)特定基因的堿基序列，來(lái)實(shí)現(xiàn)基因的修飾、修正或修復(fù)的技術(shù)。在這個(gè)技術(shù)的發(fā)展歷程中，有幾個(gè)關(guān)鍵的里程碑被認(rèn)為是其成功的標(biāo)志。

首先是1993年，由美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校的研究人員發(fā)明了CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)基于細(xì)菌天然的免疫系統(tǒng)，利用CRISPR序列和Cas9酶，實(shí)現(xiàn)了在準(zhǔn)確的基因位點(diǎn)進(jìn)行精確的基因編輯和修飾。

隨著CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)，人類基因編輯技術(shù)進(jìn)入了一個(gè)全新的時(shí)代。2012年，科學(xué)家首次利用CRISPR-Cas9技術(shù)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行了基因編輯。這標(biāo)志著該技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室條件下的成功應(yīng)用。

2015年，中國(guó)科學(xué)家使用CRISPR技術(shù)成功進(jìn)行了非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物（猴子）基因編輯，這意味著該技術(shù)已經(jīng)能夠在更復(fù)雜的生物系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)精確的基因編輯。

2016年，美國(guó)研究人員首次在人類胚胎中使用CRISPR技術(shù)進(jìn)行基因編輯。雖然這項(xiàng)研究引起了倫理和安全方面的爭(zhēng)議，但這標(biāo)志著該技術(shù)在人類基因編輯方面的潛力和前景。

綜上所述，CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展被認(rèn)為是基因定點(diǎn)突破技術(shù)的成功之一，其成功應(yīng)用于哺乳動(dòng)物和更復(fù)雜的生物系統(tǒng)中，以及在人類基因編輯方面的初步嘗試，都進(jìn)一步表明了該技術(shù)的潛力和前景。

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