JCB：CRISPR-Cas9系統(tǒng)在活細(xì)胞中的工作機(jī)制取得重大突破

JCB：CRISPR-Cas9系統(tǒng)在活細(xì)胞中的工作機(jī)制取得重大突破

2016年09月07日訊 在一項(xiàng)新的研究中，來自美國馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員揭示出CRISPR-Cas9系統(tǒng)在活細(xì)胞中的內(nèi)部工作機(jī)制的重要新細(xì)節(jié)。這一發(fā)現(xiàn)可能對人們利用這種強(qiáng)大的基因編輯工具開發(fā)治療方法產(chǎn)生影響。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在Journal of Cell Biology期刊上，論文標(biāo)題為“CRISPR-Cas9 nuclear dynamics and target recognition in living cells”。

論文通信作者、馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教授和生物化學(xué)與分子藥理學(xué)教授Thoru Pederson博士說，“我們對CRISPR-Cas9復(fù)合物如何在活細(xì)胞的基因組中到處移動和發(fā)現(xiàn)靶位點(diǎn)的細(xì)節(jié)了解得并不多。在這項(xiàng)研究中，我們了解到這種復(fù)合物的工作機(jī)制對尋求為實(shí)驗(yàn)室研究和潛在的診所應(yīng)用開發(fā)工具的基因編輯人員而言是比較重要的和有用的。”

作為抵抗病毒入侵的細(xì)菌免疫系統(tǒng)中的一種組分，CRISPR-Cas9復(fù)合物是一種強(qiáng)大的基因編輯系統(tǒng)。這種CRISPR-Cas9復(fù)合物比之前的基因編輯技術(shù)更加高效和更加準(zhǔn)確，因而科學(xué)家們在實(shí)驗(yàn)室中發(fā)現(xiàn)對它進(jìn)行改造和快速地運(yùn)送它的方法，從而選擇性地對特異性的基因序列進(jìn)行編輯。為了切割雙鏈DNA片段，CRISPR-Cas9利用由大約20個(gè)核苷酸組成的向?qū)NA（gRNA）靶向結(jié)合基因組中的特異性序列，在那里，Cas9隨后進(jìn)行切割。這允許科學(xué)家們移除特定的基因序列或?qū)⑺鼈儾迦氲剿拗骷?xì)胞基因組中。

鑒于CRISPR-Cas9系統(tǒng)在活細(xì)胞內(nèi)的工作機(jī)制的內(nèi)在動力學(xué)性質(zhì)并未得到很好地理解，一些運(yùn)送系統(tǒng)和技術(shù)相比而言更容易取得成功。為了觀察CRISPR-Cas9系統(tǒng)在活細(xì)胞中的作用機(jī)制，Pederson博士和同事們開發(fā)出一種利用不同的熒光分子對gRNA和Cas9進(jìn)行標(biāo)記的技術(shù)，因此能夠同時(shí)追蹤它們。

研究人員發(fā)現(xiàn)當(dāng)未結(jié)合到Cas9上時(shí)，gRNA是非常短命的。當(dāng)Cas9與gRNA組裝在一起時(shí)，這種復(fù)合物更加穩(wěn)定：大約一半的復(fù)合物在細(xì)胞核中的壽命大約為15分鐘，而剩下的復(fù)合物具有更高的穩(wěn)定性。

論文共同第一作者、Pederson實(shí)驗(yàn)室研究員Hanhui Ma博士說，“Cas9讓gRNA穩(wěn)定化。如果你將gRNA和Cas9各自地運(yùn)送到靶細(xì)胞中，然后進(jìn)行組裝，那么它將是沒有工作效率的，這是因?yàn)橐恍ゞRNA將會發(fā)生降解。如果你將它們---已經(jīng)組裝在一起---同時(shí)運(yùn)送到靶細(xì)胞中，那么你將觀察到更多的活性?！?/p>

研究人員還觀察到Cas9-gRNA復(fù)合物在靶位點(diǎn)上的停留時(shí)間決定著DNA是否將被切割。當(dāng)gRNA序列與靶DNA序列完美匹配時(shí)，Cas9-gRNA復(fù)合物在離開之前，結(jié)合到這種靶DNA序列上長達(dá)兩個(gè)小時(shí)，在這期間，靶DNA序列切割也完成了。當(dāng)gRNA序列與靶DNA序列存在錯(cuò)配時(shí)，Cas9-gRNA復(fù)合物在靶DNA序列上的停留時(shí)間僅僅為幾分鐘的時(shí)間，因而這種切割被破壞了。

Ma說，了解到這一點(diǎn)后，科學(xué)家們能夠潛在地在數(shù)學(xué)上基于CRISPR-Cas9復(fù)合物在基因組位點(diǎn)上的停留時(shí)間長短，預(yù)測脫靶切割可能在何處發(fā)生。

Ma說，“我們?nèi)匀徊恢繡RISPR的規(guī)則。每個(gè)人都想知道當(dāng)它被運(yùn)送到活細(xì)胞中時(shí)將會發(fā)生什么。這項(xiàng)研究揭示了它的工作機(jī)制的一部分。”

基因編輯如何換藥不換湯

To destroy is easier than to create ，摧毀總比創(chuàng)造要簡單，這句話轉(zhuǎn)換到基因編輯上就是：knockout比knock in容易。因?yàn)閗nockout只要摧毀基因，而knockin則是要創(chuàng)造一個(gè)新的“基因”，這個(gè)新”基因“不僅僅正確表達(dá)，還需要有相應(yīng)的功能。換言之，knockout是non-specific，而knockin則是specific。

對于干細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、原代細(xì)胞以及靜息狀態(tài)的細(xì)胞而言，轉(zhuǎn)染已經(jīng)相當(dāng)困難，基于轉(zhuǎn)染方式的knockout則是難上加難，而knockin則是上下左右為難。假如你的課題需要knockin一些特殊標(biāo)記，而且不止一次需要knockin一次，那么有沒有什么討巧的辦法既可以減輕工作量，又可以specific？今天我們就來講 重組酶介導(dǎo)的盒式交換 （recombinase-mediated cassette exchange，RMCE） ，個(gè)人關(guān)于這個(gè)技術(shù)的描述是： 換藥不換湯 。

本文的1、2點(diǎn)是基因重組背景知識和gateway重組的介紹， 如不需要，可直接跳到第3點(diǎn)，直達(dá)RMCE（寧可不看一二，也絕不能錯(cuò)過三） 。

在動筆寫這篇文章RMCE之前，突然發(fā)現(xiàn)目前我們用到的幾乎所有基因編輯手段，都是一種特定生物學(xué)過程的結(jié)果，那就是-- 重組（Recombination） 。例如我們在前面的文章中有提到過 HDR（Homology directed repair）介導(dǎo)的CRISPR-Cas9技術(shù)，就是依賴基因的同源重組，將供體片段替換到基因組中 ；此外，在piggyBac文章中提到的基因 轉(zhuǎn)座 （Transposition ）*：DNA從某一位置移動到基因組上另一位置，也屬于基因重組的范疇，并且是一種高度特異的基因重組。因此，在我們了解RMCE之前，需要加強(qiáng)一遍重組在我們基因編輯技術(shù)知識譜系的重要程度。

一類：自然發(fā)生的重組類型至少有以下四種：

（1） General or homologous recombination（常規(guī)/同源重組）： 發(fā)生在序列非常相似的DNA分子之間，如二倍體生物中的同源染色體。同源重組是TELEN以及HDR介導(dǎo)的CRISPR-Cas9的基因編輯的基礎(chǔ)，由于這種方法需要供體包含有非常長的同源臂，從而可以達(dá)到精準(zhǔn)的效果，但精準(zhǔn)度越高，其成功率又隨之降低。

（2） Illegitimate or nonhomologous（不合理/非同源重組）： 由于這種重組方法并不需要有長同源序列，看起來“不合理”， 所以被稱之為不合理（非法）重組。這種重組可造成隨機(jī)突變，在科學(xué)研究中也有用到。

（3） Site-specific recombination（位點(diǎn)特異性重組）： 顧名思義，就是需要有特定的識別位點(diǎn)才能開啟的重組方式，而這些特定的識別位點(diǎn)通常長度在幾十bp左右， gateway recombination和今天我們要講的RMCE則屬于這種，由此可以想象一下RMCE也需要獨(dú)特的識別位點(diǎn) 。

（4） Replicative recombination： 可以看到復(fù)制性轉(zhuǎn)座屬于這種類型。

二類：人為改造/創(chuàng)造的重組類型：

（1） Plasmid Insertion Recombination（質(zhì)粒插入重組）： 在體外使用核酸酶可對質(zhì)粒進(jìn)行酶切，使用連接酶可將質(zhì)粒和DNA片段重組連接。其人為性不僅僅是因?yàn)檫@是體外實(shí)驗(yàn)，同時(shí)人類也可以使用PCR的方式合成出相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，從而增加質(zhì)粒的可編輯性，這對于大家來說就是家常便飯。

（2） Gene Gun Recombination（基因槍重組）： 主要用于植物工程，將包裹在金粒子上的DNA分子轟入活細(xì)胞中，最后該DNA溶液就可并入細(xì)胞的基因組中。這是一種物理改變DNA傳遞方法，同時(shí)基因傳遞的方法有以下幾個(gè)分類：

從基因槍的原理我們理解到， 改變DNA的傳遞方法，也是一種人為的重組方式 。因此上圖還將（3） Virus Replication Recombination（病毒復(fù)制重組） 和（4）電轉(zhuǎn)等等重組方式展現(xiàn)出來，這里就不再細(xì)說。

Gateway重組是常用質(zhì)粒元件置換方案 ，主要用于將目的元件在不依賴于核酸酶的方式，置換到想要的backbone上。前面說到，CRISPR-Cas9是從噬菌體侵入細(xì)菌時(shí)細(xì)菌的抵抗得到啟發(fā)，而gateway重組也是一個(gè)向自然界學(xué)習(xí)的典型例子。λ噬菌體在整合因子（IFN，Int）的幫助下， 將自身的attP位點(diǎn)和大腸桿菌的attB位點(diǎn)進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組，從而將自身的基因組整合到大腸桿菌中，此時(shí)attB & P產(chǎn)生兩個(gè)新位點(diǎn)：attL & R 。因此人們從這上得到啟發(fā)，將att位點(diǎn)克隆到質(zhì)粒中，這樣就可以輕松置換兩質(zhì)粒的原件，從而達(dá)到“換藥不換湯”的目的。

從上圖可知：

（1）att位點(diǎn)的相關(guān)特性。

（2）以右圖為例，現(xiàn)想要 將左邊紫色骨架質(zhì)粒的CaMPARI原件置換到右邊黃色骨架質(zhì)粒上 ，由于兩個(gè)骨架質(zhì)粒有可以互相重組的 attL1 & attL2位點(diǎn) 。將兩種質(zhì)粒放在同一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中，使用LR clonase，即可輕松將CaMPAR從紫色骨架轉(zhuǎn)移到黃色骨架上，從而得到一個(gè)新質(zhì)粒。而 ccdB是一個(gè)自殺基因 ，當(dāng)細(xì)胞被轉(zhuǎn)入帶有ccdB的質(zhì)粒后，大腸桿菌將不再生長，因此平板/培養(yǎng)基 只剩下含有目標(biāo)質(zhì)粒 的大腸桿菌。attL1 & L2重組后形成attP1 & P2的新位點(diǎn)。

（3）這種元件置換的方法，歸根結(jié)底就在于供體和受體之間具有可重組的識別位點(diǎn)，按照這樣的思路，人們可以將多種特殊的識別位點(diǎn)包裝為元件置換系統(tǒng)。

目的：給質(zhì)粒插入RFP標(biāo)簽

（1）挑選質(zhì)粒

供體質(zhì)粒： mRFP1Rab5 ；

目標(biāo)質(zhì)粒：pDONR-P2r-P3

（2）使用snapGene完成模擬

終于回到開頭，在knockin本身就很難的情況下，課題設(shè)計(jì)還需要多個(gè)knockin。如何做到只knockin一次，后面的”knockin“全部由RMCE完成。以上gateway recombination只是開胃小菜，gateway主要用于體外構(gòu)建載體，而 RMCE則可在體內(nèi)達(dá)成元件轉(zhuǎn)換 的作用。上一節(jié)我們了解到元件置換的基本原理就是：需要特點(diǎn) 識別位點(diǎn)+特定的重組酶 。活細(xì)胞及生物體內(nèi)用到的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)就是大名鼎鼎的 Cre-loxP、Flp-FRT以及Dre-rox 。以Cre-loxP系統(tǒng)為例:

看到上面的圖是不是感覺很混亂并不好記憶，為什么loxP方向相同是倒置，相反是敲除或者移位。很多文章會告訴上圖的內(nèi)容，但根本的原因是loxP相當(dāng)于影子分身，每個(gè)之間都可以互換，而且換的時(shí)候要求完全一樣（影子分身能不一樣？）。

我們想象一下上圖deletion的狀況，loxP-gene-loxP片段被Cre酶切除出來后可能出現(xiàn)的結(jié)果：

（1）左右兩個(gè)loxP由于還可以和切除位點(diǎn)互補(bǔ)重組，因此，切出來的loxP-gene-loxP片段再次被重組回去，其結(jié)果就是，切了跟沒切一樣。因此，再次印證了一句話，切開只是第一步，DNA repair才是決定結(jié)果的關(guān)鍵一步

（2）按道理左邊loxP被Cre切開后，重組時(shí)應(yīng)該結(jié)合自己原來殘留的缺口，但正是因?yàn)殚L得一樣，它認(rèn)錯(cuò)了，把右邊loxp剩下的缺口給占用了，導(dǎo)致gene-loxP片段被擠出基因組，此時(shí)就達(dá)到了敲除的效果。

根據(jù)以上描述，我們想知道，怎樣才能解決，切了相當(dāng)于沒切的問題呢？

在gateway中我們學(xué)到，att位點(diǎn)可有多種變體，同樣 loxP位點(diǎn)也是 ，如下圖所示， 不同loxP位點(diǎn)之間也有特定的重組方式和親和力 [2]?？梢钥吹剑?/p>

（1）野生型loxP可以和包括自己在內(nèi)的所有l(wèi)oxP突變體進(jìn)行重組。

（2）大部分loxP變體只能和少數(shù)loxP變體進(jìn)行重組，例如：loxP66可以和loxP71、511等進(jìn)行重組，最后形成相應(yīng)的loxP位點(diǎn)。

（3）少部分loxP變體只能和自己進(jìn)行重組，例如lox2272，每一種loxP變體的出現(xiàn)，都是在完善和擴(kuò)大Cre-loxP系統(tǒng)，使之可使用性更強(qiáng)、更廣。

目的：通過元件替換方式將細(xì)胞顏色熒光標(biāo)簽由綠色改為紅色

Case 1

可以看到：loxP66-GFP-loxP71元件在Cre重組酶的幫助下，被替換為loxP66-DsRed-loxP71，由此，細(xì)胞的熒光顏色由紅色轉(zhuǎn)為綠色。但這個(gè)系統(tǒng)的效果看似并不那么好，只有少數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為紅色，而大部分仍然是綠色的，而造成這個(gè)結(jié)果的原因是什么？歡迎留言給出自己的答案，下周我會將自己的解讀放上來。

在TELEN、ZFN和CRISPR-Cas9技術(shù)的出現(xiàn)，使得knockin所需的同源臂長度從原來的十幾kb，縮小到1 kb以內(nèi)，大大降低了knockin的難度。然而即使是新技術(shù)的出現(xiàn)，knockin仍然具有較大的難度，尤其是knockin的效率會隨著插入片段的長度增加而降低，超過3kb的knockin難度大大增加。個(gè)人小小整理RMCE使用情況如下：

（1） 早期RMCE技術(shù)主要和慢病毒、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)結(jié)合 ：使用慢病毒或轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)（睡美人SB或piggyBac）將master載體整合到基因組中， 構(gòu)建出master cell line，之后在Cre重組酶的幫助下，將目標(biāo)序列置換到master line中，從而一步得到新的細(xì)胞系。 慢病毒和轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)有高效的特點(diǎn)，但其機(jī)制是隨機(jī)整合，因此當(dāng)課題需要精確編輯時(shí)，這種整合方式則無法被采用。

（2）使用TELEN、ZFN技術(shù)將master載體質(zhì)粒knockin到細(xì)胞中，構(gòu)建master line，隨后的故事同上。這個(gè)方案運(yùn)用了精準(zhǔn)敲入，因此難度增加不少，但系統(tǒng)成熟不少。 有人可能會說，knockin我不怕難，我可以一個(gè)一個(gè)的knockin，不需要使用RMCE系統(tǒng) 。但需要考慮到同一個(gè)細(xì)胞系， 隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞系內(nèi)異質(zhì)性也會增加 。有些課題對基因背景的均勻性有著變態(tài)的需求，此時(shí) 使用RMCE系統(tǒng)置換元件的方式，可以得到幾乎一致的基因背景，但knockin序列不同的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系，從而提供更均勻穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)背景 。

（3）敲入短片段master載體，通過Cre將長片段置換到master line中，完美避開長片段敲入極其困難的困境。

（4）對于基因編輯困難的細(xì)胞，能獲取一個(gè)master line，會讓整個(gè)課題組的工具系統(tǒng)上升一個(gè)等級。做過knockin的人都知道這個(gè)過程的困難。以TELEN系統(tǒng)為例，需要共轉(zhuǎn)至少3個(gè)質(zhì)粒：含有TELEN同源臂的+目的基因的載體，TELEN導(dǎo)航質(zhì)粒Left + Right。以干細(xì)胞為例，轉(zhuǎn)染效率是1%，那么一百萬個(gè)細(xì)胞可獲得約1萬個(gè)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，而被共轉(zhuǎn)的細(xì)胞則可能只有500個(gè)，這500個(gè)細(xì)胞中，真正被純合knockin的細(xì)胞可能只有幾個(gè)。按照傳統(tǒng)挑單克隆的方式，那么很有可能就是培養(yǎng)了100個(gè)單克隆細(xì)胞系，最后只有1個(gè)是真正需要的，這個(gè)工作量想起來都讓人覺得害怕。不過一般使用藥物篩選方式，可最后篩出抗藥生長的單克隆團(tuán)，但分離出單克隆的步驟仍不可少。

RMCE可以提供更為均勻穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)背景，但其優(yōu)勢也限制了其應(yīng)用，因?yàn)閙aster line敲入的位點(diǎn)限制了后續(xù)的應(yīng)用。例如master line敲入位置是AAVS1位點(diǎn)，而其實(shí)課題需要的多個(gè)knockin是在多個(gè)不同位點(diǎn)的。此時(shí)RMCE系統(tǒng)則起不到作用。是的，RMCE是基因編輯技術(shù)的補(bǔ)充，不能要求其完成一切需求，但有了它，我們能用的工具就更多了。個(gè)人覺得， AAVS1 knockin的master line非常實(shí)用，可以輕松構(gòu)建熒光標(biāo)簽細(xì)胞系，同時(shí)更多的inducible細(xì)胞系也更容易獲取 。單獨(dú)把RMCE拿出來講，它可能不夠出彩，它只是一個(gè)默默的扳手，看起來不起眼，但在關(guān)鍵時(shí)刻，還真香。

Reference：

[1] Araki, Kimi, Masatake Araki, and Ken‐ichi Yamamura. "Site‐directed integration of the cre gene mediated by Cre recombinase using a combination of mutant lox sites." Nucleic acids research 30.19 (2002): e103-e103.

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