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      基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9的重大發(fā)現(xiàn)
      
        
      
            佚名
            2024-06-04 23:21:13
        
      

        
      
           
      基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9的重大發(fā)現(xiàn)
      2016年08月31日訊 基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9被《科學(xué)》雜志列為2013年年度十大科技進(jìn)展之一
      ，受到人們的高度重視。CRISPR是規(guī)律間隔性成簇短回文重復(fù)序列的簡(jiǎn)稱
      ，Cas是CRISPR相關(guān)蛋白的簡(jiǎn)稱
      。CRISPR/Cas最初是在細(xì)菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的
      ，是細(xì)菌用來(lái)識(shí)別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防御系統(tǒng)。
      中國(guó)科學(xué)家將進(jìn)行世界首個(gè)人類CRISPR基因編輯臨床試驗(yàn)
      如今
      ，中國(guó)科學(xué)家即將利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)將修飾后的細(xì)胞注入人體進(jìn)行人類臨床試驗(yàn)
      ，這將是世界上首個(gè)在人類機(jī)體中進(jìn)行的CRISPR試驗(yàn)
      。
      進(jìn)行這項(xiàng)研究的是來(lái)自四川大學(xué)華西醫(yī)院（West China Hospital）的研究者Lu You（盧鈾），他計(jì)劃下個(gè)月在肺癌患者機(jī)體中檢測(cè)利用CRISPR-Cas9修飾后的細(xì)胞的性能，這項(xiàng)臨床試驗(yàn)已于7月6日獲得了醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)審核
      。研究者盧鈾，畢業(yè)于華西醫(yī)科大學(xué)
      ，長(zhǎng)期從事肺癌和食管癌等胸部腫瘤放化療和分子靶向治療的臨床與基礎(chǔ)研究
      ，腫瘤綜合治療及抗腫瘤新藥臨床試驗(yàn)研究
      。
      這項(xiàng)在中國(guó)進(jìn)行的人類臨床試驗(yàn)將會(huì)招募轉(zhuǎn)移性的非小細(xì)胞肺癌患者和化療、放療及其它療法相繼失敗的肺癌患者
      ，研究者Lu表示
      ，目前針對(duì)癌癥的療法選擇非常有限
      ，而基于CRISPR的技術(shù)或?qū)槎喾N疾病的患者帶來(lái)光明
      ，尤其是那些每天需要治療的癌癥患者
      。
      研究者Lu的研究團(tuán)隊(duì)將從招募的患者機(jī)體提取免疫細(xì)胞-T細(xì)胞
      ，隨后利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)敲除細(xì)胞中的特殊基因
      ，該基因所編碼的蛋白PD-1可以扮演細(xì)胞檢查點(diǎn)的角色
      ，其可以對(duì)細(xì)胞發(fā)起的特殊免疫反應(yīng)進(jìn)行檢查
      ，從而抑制健康細(xì)胞被攻擊。CRISPR-Cas9技術(shù)可以同分子向?qū)鋵?duì)來(lái)識(shí)別出攜帶特殊酶類的染色體上的特殊遺傳序列
      。
      隨后研究者在實(shí)驗(yàn)室中擴(kuò)增被基因編輯的細(xì)胞
      ，并將這些修飾后的細(xì)胞重新注入到患者的血液中
      ，這些工程化的細(xì)胞就可以在患者機(jī)體中進(jìn)行循環(huán)并且“游入”癌癥組織中
      ；即將在美國(guó)進(jìn)行的臨床試驗(yàn)也利用了類似的方法來(lái)敲除編碼PD-1的基因
      ，同時(shí)研究者還計(jì)劃敲除第二個(gè)基因，并在細(xì)胞重新注入患者體內(nèi)之前插入第三個(gè)基因
      。
      最后研究者Lu說(shuō)道，我希望我們是第一個(gè)進(jìn)行這項(xiàng)臨床試驗(yàn)的人
      ，更重要的是，我們希望可以通過(guò)這項(xiàng)臨床試驗(yàn)獲得足夠多的積極性證據(jù)。
      科學(xué)家質(zhì)疑巨病毒存在類似CRISPR/Cas的系統(tǒng)
      在很多細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas免疫防御系統(tǒng)
      ，因其能夠簡(jiǎn)單地而又優(yōu)雅地編輯宿主基因組，而成為時(shí)下最火熱的生物技術(shù)
      ，在近期產(chǎn)生一大批發(fā)現(xiàn)。在今年3月
      ，來(lái)自法國(guó)艾克斯-馬賽大學(xué)的Didier Raoult和同事們發(fā)表一篇論文，指出一種被稱作mimivirus的巨病毒（giant virus）擁有一種類似于CRISPR系統(tǒng)的被稱作mimivirus噬病毒體抵抗元件（mimivirus virophage resistance element, MIMIVIRE）的噬病毒體抵抗機(jī)制（Nature, 10 March 2016, doi:10.1038/nature17146）
      。而在上個(gè)月發(fā)表在Virologica Sinica期刊上的一篇論文中
      ，來(lái)自法國(guó)國(guó)家科學(xué)研究院（CNRS）的Jean-Michel Claverie和Chantal Abergel對(duì)這種觀點(diǎn)提出挑戰(zhàn)
        。
      Claverie和Abergel在他們的論文中寫道，“MIMIVIRE并不類似于CRISPR-Cas系統(tǒng)
        ，并不能夠作為一種核酸識(shí)別系統(tǒng)發(fā)揮作用
      ，也不可能擁有一種真正的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)所擁有的所有性質(zhì)
      ?div   id="jpandex"   class="focus-wrap mb20 cf">！?/p>
      Claverie和Abergel繼續(xù)質(zhì)疑這種噬病毒體抵抗機(jī)制到底是不是基于核酸的
      。他們提出蛋白可能干擾這種抵抗噬病毒體的mimivirus中的噬病毒體復(fù)制
      。
      但是
      ，Claverie和Abergel聲稱這種mimivirus防御機(jī)制一點(diǎn)都不像CRISPR系統(tǒng)
      。首先
      ，mimivirus基因組和噬病毒體復(fù)制發(fā)生在相同的地方
      ，“這就不可能獲得基于核酸的免疫系統(tǒng)”
      。再者
      ，CRISPR代表著規(guī)律間隔性成簇短回文重復(fù)序列
      ，而MIMIVIRE序列“并不是規(guī)律間隔性的
      ，而且在兩側(cè)也不存在可識(shí)別的重復(fù)序列”
      。最后
      ，與MIMIVIRE序列相對(duì)應(yīng)的Zamilon序列缺乏被稱作前間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif, PAM）的序列，其中細(xì)菌宿主通常利用這一序列區(qū)分病原體DNA和它們自己的DNA
      。
      利用CRISPR/Cas9讓沉默基因不再沉默
      CRIPSR/Cas9是細(xì)菌天然地用來(lái)抵抗病毒感染的一種免疫系統(tǒng)
      。它允許科學(xué)家們?cè)诨蚪M靶位點(diǎn)上精確地導(dǎo)入、移除或替換特異性的DNA片段
      。迄今為止
      ，CRISPR/Cas9是最為高效的、廉價(jià)的和最容易操作的基因編輯工具
        。然而
        ，科學(xué)家們?cè)诖酥斑€不能夠高效地利用它激活細(xì)胞中的基因。
      在一項(xiàng)新的研究中
        ，來(lái)自日本北海道大學(xué)遺傳醫(yī)學(xué)研究所的Toru Kondo團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)開(kāi)發(fā)出一種強(qiáng)大的方法做到這一點(diǎn)。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2016年5月23日那期Angewandte Chemie期刊上
        ，論文標(biāo)題為“A Powerful CRISPR/Cas9-Based Method for Targeted Transcriptional Activation”。
      細(xì)胞中的基因擁有它們自己的開(kāi)關(guān)：?jiǎn)?dòng)子
        。當(dāng)基因的啟動(dòng)子發(fā)生甲基化時(shí)
        ，該基因就被關(guān)閉
        ，或者被沉默
        。
      在這項(xiàng)新的研究中
        ，研究人員想要高效地激活沉默基因（即因啟動(dòng)子發(fā)生甲基化被關(guān)閉的基因
        ，也就是不發(fā)生轉(zhuǎn)錄的基因）
        。他們將一種被稱作微同源末端連接（microhomology-mediated end-joining, MMEJ）的DNA修復(fù)機(jī)制與CRISPR/Cas9組合使用
        。他們利用CRISPR/Cas9切掉發(fā)生甲基化的啟動(dòng)子
        ，然后利用MMEJ插入一個(gè)未發(fā)生甲基化的啟動(dòng)子
        ，也就是利用基因的開(kāi)啟開(kāi)關(guān)替換它的關(guān)閉開(kāi)關(guān)
        。
      研究人員在神經(jīng)細(xì)胞基因OLIG2和胚胎干細(xì)胞基因NANOG上使用了這種工具以便測(cè)試它在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中的效率
        。在5天內(nèi)
      ，他們發(fā)現(xiàn)證據(jù)證實(shí)這些基因強(qiáng)效地表達(dá)
      。在當(dāng)體外培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞中利用這種方法激活OLIG2基因時(shí)
      ，它們?cè)?天內(nèi)高效地分化為神經(jīng)元
      。
      研究人員也發(fā)現(xiàn)他們的基因編輯工具可能能夠被用來(lái)激活其他的發(fā)生沉默的啟動(dòng)子。此外，他們發(fā)現(xiàn)這一系統(tǒng)并不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中其他的非靶向基因發(fā)生不想要的突變
      。這種工具有巨大的潛力被用來(lái)操作基因表達(dá)，構(gòu)建基因電路
      ，或者改變細(xì)胞命運(yùn)。
      利用CRISPR/Cas9有望靶向清除多種皰疹病毒感染
      大多數(shù)成年人攜帶著多種皰疹病毒
      。在初始的急性感染后
      ，這些病毒在它們的宿主體內(nèi)建立終生感染
      ，并導(dǎo)致唇皰疹
      、角膜炎
      、生殖器皰疹
      、帶狀皰疹
      、傳染性單核細(xì)胞增多癥和其他疾病
      。一些皰疹病毒還能夠?qū)е氯藗兓忌习┌Y
      。在潛伏性感染階段
      ，這些病毒長(zhǎng)時(shí)間地保持潛伏狀態(tài)
      ，但是保持偶爾重新激活的能力
        。這種重新激活有可能導(dǎo)致人們患病
        。一項(xiàng)新的研究提示著利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)攻擊皰疹病毒DNA能夠抑制病毒復(fù)制
        ，而且在一些情形下
        ，能夠?qū)е虏《厩宄?div   id="m50uktp"   class="box-center">  。相關(guān)研究結(jié)果于2016年6月30日發(fā)表在PLoS Pathogens期刊上
        ，論文標(biāo)題為“CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing of Herpesviruses Limits Productive and Latent Infections”
        。
      在這項(xiàng)新的研究中
        ，來(lái)自荷蘭烏德勒支大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的Robert Jan Lebbink和同事們認(rèn)為應(yīng)當(dāng)能夠靶向作用于被感染的人細(xì)胞中的潛伏性皰疹病毒DNA并讓它們的DNA發(fā)生突變
        ，因而潛在地阻止皰疹病毒相關(guān)的疾病
        。為了測(cè)試這一點(diǎn)
        ，他們?cè)O(shè)計(jì)出特異性的向?qū)NA（gRNA），即與皰疹病毒基因組的關(guān)鍵部分互補(bǔ)的且發(fā)揮著分子地址作用的短RNA片段
      。這些gRNA當(dāng)與CRISPR/Cas9系統(tǒng)中發(fā)揮著分子剪刀作用的Cas9結(jié)合在一起時(shí)
      ，應(yīng)當(dāng)能夠誘導(dǎo)在皰疹病毒DNA的特定位點(diǎn)上發(fā)生切割
      ，隨后誘導(dǎo)它們的DNA發(fā)生突變
      ，從而破壞這些病毒
      。
      通過(guò)采取這種方法
      ，研究人員研究了三種不同的皰疹病毒成員：導(dǎo)致唇皰疹和皰疹性角膜炎的1型單純皰疹病毒（HSV-1）
      ；人巨細(xì)胞病毒（HCMV）
      ，最為常見(jiàn)的病毒性出生缺陷病因（當(dāng)這種病毒由媽媽傳播給胎兒時(shí)）
      ；導(dǎo)致傳染性單核細(xì)胞增多癥和多種癌癥類型的愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barr virus, EBV, 也被稱作EB病毒）
      。
      研究人員總結(jié)道
      ，“我們觀察到將EBV從被潛伏感染的腫瘤細(xì)胞中高度有效地和特異性地清除出來(lái)
      ，以及破壞HSV-1和HCMV在人細(xì)胞中的復(fù)制?div   id="4qifd00"   class="flower right">
      ！彼麄兝^續(xù)說(shuō)道
      ，“盡管CRISPR/Cas9并不能夠高效地對(duì)潛伏性HSV-1進(jìn)行基因組編輯，但是一旦潛伏性HSV-1重新激活
      ，利用HSV-1特異性的gRNA能夠高效地阻止HSV-1復(fù)制?div   id="4qifd00"   class="flower right">
      ！彼麄兿Ｍ麄兊慕Y(jié)果“可能允許設(shè)計(jì)出高效的治療策略靶向潛伏性感染和增殖性感染期間的人皰疹病毒
      。”
      什么是CRISPR/Cas9技術(shù)
      1.什么是CRISPR/Cas9
      ？
      CRISPR----Clustered
      Regularly
      Interspaced
      Short
      Palindromic
      Repeats
      是在細(xì)菌和古細(xì)菌中廣泛存在的成簇的
      、有規(guī)律的
      、間隔的短回文重復(fù)序列
      。
      07年
      ，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可以用CRISPR系統(tǒng)抵抗噬菌體的入侵
      ；08年，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的
      CRIS
      CRISPR-Cas9 原理
      CRISPR/Cas技術(shù)是什么
      ？ 
        
       CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種原核生物的免疫系統(tǒng)
      ，用來(lái)抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵
      ，比如噬菌體病毒和外源質(zhì)粒。同時(shí)
      ，它為細(xì)菌提供了獲得性免疫：這與哺乳動(dòng)物的二次免疫類似，當(dāng)細(xì)菌遭受病毒或者外源質(zhì)粒入侵時(shí)
      ，會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的“記憶”，從而可以抵抗它們的再次入侵
      。CRISPR/Cas系統(tǒng)可以識(shí)別出外源DNA
      ，并將它們切斷
      ，沉默外源基因的表達(dá)
      。這與真核生物中RNA干擾（RNAi)的原理是相似的
      。正是由于這種精確的靶向功能
      ，CRISPR/Cas系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)成一種高效的基因編輯工具
      。在自然界中
      ，CRISPR/Cas系統(tǒng)擁有多種類別
      ，其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)是研究最深入
      ，應(yīng)用最成熟的一種類別。CRISPR/Cas9是繼鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）”
      、“類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）”之后出現(xiàn)的第三代“基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)”。憑借著成本低廉
      ，操作方便，效率高等優(yōu)點(diǎn)
      ，CRISPR/Cas9迅速風(fēng)靡全球的實(shí)驗(yàn)室，成為了生物科研的有力幫手
      。在TALEN和ZFN的時(shí)代
      ，科學(xué)家們往往要花費(fèi)重金
      ，把基因編輯工作交給生物公司。而現(xiàn)在
      ，在實(shí)驗(yàn)室里，人們就可以使用CRISPR/Cas9技術(shù)輕松的實(shí)現(xiàn)基因編輯
      。
        
        CRISPR/Cas9如何工作
      ？ 
        
       CRISPR簇是一個(gè)廣泛存在于細(xì)菌和古生菌基因組中的特殊DNA重復(fù)序列家族
      ，充當(dāng)了防御外源遺傳物質(zhì)的“基因武器”
      。CRISPR全稱Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列
      ，分布在40%的已測(cè)序細(xì)菌和90%的已測(cè)序古細(xì)菌當(dāng)中
      。圖1展示了完整的CRISPR位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)
      。其中
      ，CRISPR序列由眾多短而保守的重復(fù)序列區(qū)（repeats）和間隔區(qū)（spacer）組成。重復(fù)序列區(qū)含有回文序列
      ，可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。而間隔區(qū)比較特殊
      ，它們是被細(xì)菌俘獲的外源DNA序列。這就相當(dāng)于細(xì)菌免疫系統(tǒng)的“黑名單”
      ，當(dāng)這些外源遺傳物質(zhì)再次入侵時(shí)
      ，CRISPR/Cas系統(tǒng)就會(huì)予以精確打擊。而在上游的前導(dǎo)區(qū)（leader）被認(rèn)為是CRISPR序列的啟動(dòng)子
      。另外
      ，在上游還有一個(gè)多態(tài)性的家族基因，該基因編碼的蛋白均可與CRISPR序列區(qū)域共同發(fā)生作用
      。因此
      ，該基因被命名為CRISPR關(guān)聯(lián)基因（CRISPR associated，Cas）
      。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Cas1-Cas10等多種類型的Cas基因
      。Cas基因與CRISPR序列共同進(jìn)化，形成了在細(xì)菌中高度保守的CRISPR/Cas系統(tǒng)
      。

      那么，CRISPR序列是如何與Cas蛋白配合來(lái)執(zhí)行防御功能的呢
      ？整個(gè)過(guò)程大體分為3步
      。 
        
        1.外源DNA俘獲：“黑名單”登記 
        
       簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，CRISPR/Cas系統(tǒng)在這一步實(shí)現(xiàn)了一個(gè)“黑名單登記”功能
      。CRISPR/Cas系統(tǒng)將識(shí)別出入侵者的“名字”（PAM）并找到它的“身份證”（原間隔序列），然后把入侵者身份信息作為“檔案”（間隔序列）記錄到“黑名單”（CRISPR序列）中
      。圖2展示了第一階段的工作原理。當(dāng)噬菌體病毒首次入侵宿主細(xì)菌
      ，病毒的雙鏈DNA被注入細(xì)胞內(nèi)部
      。CRISPR/Cas系統(tǒng)會(huì)從這段外源DNA中截取一段序列作為外源DNA的“身份證”
      ，然后將其作為新的間隔序列被整合到基因組的CRISPR序列之中。因此
      ，這段與間隔序列對(duì)應(yīng)的“身份證”被稱為原間隔序列（protospacer）。然而
      ，“身份證”的選取并不是隨機(jī)的
      。原間隔序列向兩端延伸的幾個(gè)堿基都十分保守
      ，被稱為原間隔序列臨近基序（protospacer adjacent motif
      ，PAM）
      。PAM通常由NGG三個(gè)堿基構(gòu)成（N為任意堿基）
      。病毒入侵時(shí)
        ，Cas1和Cas2編碼的蛋白將掃描這段外源DNA
        ，并識(shí)別出PAM區(qū)域，然后將臨近PAM的DNA序列作為候選的原間隔序列
        。隨后，Cas1/2蛋白復(fù)合物將原間隔序列從外源DNA中剪切下來(lái)
        ，并在其他酶的協(xié)助下將原間隔序列插入臨近CRISPR序列前導(dǎo)區(qū)的下游。然后
        ，DNA會(huì)進(jìn)行修復(fù)
        ，將打開(kāi)的雙鏈缺口閉合。這樣一來(lái)
      ，一段新的間隔序列就被添加到了基因組的CRISPR序列之中
      。

      2. crRNA合成：”軍火“制造 
        
       戰(zhàn)爭(zhēng)總需要武器，CRISPR/Cas系統(tǒng)也要制造足夠的”軍火“來(lái)打擊入侵者
      。目前的研究表明，CRISPR/Cas系統(tǒng)共有三種方式（Type Ⅰ
      、Ⅱ
      、Ⅲ）來(lái)制造”軍火“
      。CRISPR/Cas9系統(tǒng)屬于Type Ⅱ
      ，是目前最成熟也是應(yīng)用最廣的類型。因此
      ，圖3將重點(diǎn)介紹CRISPR/Cas9的原理。當(dāng)入侵者到來(lái)
      ，CRISPR序列會(huì)在”指揮官“（前導(dǎo)區(qū)）的調(diào)控下轉(zhuǎn)錄出兩種“軍火材料”：pre-CRISPR-derived RNA (pre-crRNA)和trans-acting crRNA（tracrRNA）。其中
      ，tracrRNA是由重復(fù)序列區(qū)轉(zhuǎn)錄而成的具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA
      ，而pre-crRNA是由整個(gè)CRISPR序列轉(zhuǎn)錄而成的大型RNA分子
      。隨后
      ，pre-crRNA
      ，tracrRNA以及Cas9編碼的蛋白將會(huì)組裝成一個(gè)小型“兵工廠”
      。它將根據(jù)入侵者的類型，選取對(duì)應(yīng)的“身份證”（間隔序列RNA）
        ，并在RNase Ⅲ的協(xié)助下對(duì)這段間“身份證”進(jìn)行剪切
        ，最終形成一段短小的crRNA（包含單一種類的間隔序列RNA以及部分重復(fù)序列區(qū)）
        。crRNA
        ，Cas9以及tracrRNA組成的復(fù)合物，就是最終的“戰(zhàn)斗武器”
        。

      3.靶向干擾：強(qiáng)大火力，精確打擊 
        
       武器已經(jīng)制造完成，戰(zhàn)爭(zhēng)就要打響
        。圖4展示了靶向干擾的過(guò)程。Cas9/tracrRNA/crRNA復(fù)合物就像是一枚制導(dǎo)導(dǎo)彈
        ，可以對(duì)入侵者的DNA進(jìn)行精確的打擊。這個(gè)復(fù)合物將掃描整個(gè)外源DNA序列
        ，并識(shí)別出與crRNA互補(bǔ)的原間隔序列
        。這時(shí)
        ，復(fù)合物將定位到PAM/原間隔序列的區(qū)域
        ，DNA雙鏈將被解開(kāi)，形成R-Loop
        。crRNA將與互補(bǔ)鏈雜交，而另一條鏈則保持游離狀態(tài)
      。隨后
      ，Cas9蛋白發(fā)起猛烈攻勢(shì)
      ，其HNH酶活性將剪切crRNA互補(bǔ)的DNA鏈，而其RuvC活性位點(diǎn)將剪切非互補(bǔ)鏈
      。最終，Cas9強(qiáng)大的火力使雙鏈斷裂（DSB）形成
      ，外源DNA的表達(dá)被沉默，入侵者被一舉殲滅
      。

      如何應(yīng)用CRISPR/Cas技術(shù)
      ？ 
        
       CRISPR/Cas是進(jìn)行基因編輯的強(qiáng)大工具
      ，可以對(duì)基因進(jìn)行定點(diǎn)的精確編輯
      。在向?qū)NA（guide RNA，gRNA）和Cas9蛋白的參與下
      ，待編輯的細(xì)胞基因組DNA將被看作病毒或外源DNA
      ，被精確剪切。但是
      ，CRISPR/Cas9的應(yīng)用也有一些限制條件
      。首先，待編輯的區(qū)域附近需要存在相對(duì)保守的PAM序列（NGG）。其次
      ，向?qū)NA要與PAM上游的序列堿基互補(bǔ)配對(duì)
      。圖5展示了最基礎(chǔ)的兩種CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用
      。以基因敲除為例
        ，在待敲除基因的上下游各設(shè)計(jì)一條向?qū)NA（向?qū)NA1
        ，向?qū)NA2）
        ，將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)入細(xì)胞中
        ，向?qū)NA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)可以靶向PAM附近的目標(biāo)序列
        ，Cas9蛋白會(huì)使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。而生物體自身存在著DNA損傷修復(fù)的應(yīng)答機(jī)制
        ，會(huì)將斷裂上下游兩端的序列連接起來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞中目標(biāo)基因的敲除
      。如果在此基礎(chǔ)上為細(xì)胞引入一個(gè)修復(fù)的模板質(zhì)粒（供體DNA分子），這樣細(xì)胞就會(huì)按照提供的模板在修復(fù)過(guò)程中引入片段插入或定點(diǎn)突變
      。這樣就可以實(shí)現(xiàn)基因的替換或者突變
      。對(duì)受精卵細(xì)胞進(jìn)行基因編輯
      ，并將其導(dǎo)入代孕母體中
      ，可以實(shí)現(xiàn)基因編輯動(dòng)物模型的構(gòu)建。隨著研究的深入
      ，CRISPR/Cas技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用。除了基因敲除
      ，基因替換等基礎(chǔ)編輯方式，它還可以被用于基因激活
      ，疾病模型構(gòu)建
      ，甚至是基因治療
      。
      CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)簡(jiǎn)介
       CRISPR-Cas9是繼ZFN
      、TALENs等基因編輯技術(shù)推出后的第三代基因編輯技術(shù)
      ，短短幾年內(nèi),CRISPR-Cas9技術(shù)風(fēng)靡全球, 成為現(xiàn)有基因編輯和基因修飾里面效率最高
      、最簡(jiǎn)便、成本最低
      、最容易上手的技術(shù)之一
      ，成為當(dāng)今最主流的基因編輯系統(tǒng)
      。
          一
      、什么是CRISPR-Cas系統(tǒng) 
          CRISPR-Cas系統(tǒng)是原核生物的一種天然免疫系統(tǒng) 。某些細(xì)菌在遭到病毒入侵后
      ，能夠把病毒基因的一小段存儲(chǔ)到自身的 DNA 里一個(gè)稱為 CRISPR 的存儲(chǔ)空間。當(dāng)再次遇到病毒入侵時(shí)
      ，細(xì)菌能夠根據(jù)存寫的片段識(shí)別病毒，將病毒的DNA切斷而使之失效
      。
                                                  C RISPR-Cas系統(tǒng)包含CRISPR基因座和Cas基因（CRISPR關(guān)聯(lián)基因）兩部分
      。
         [圖片上傳失敗...(image-890ed-1634820207331)]
          1
      、CRISPR（/'kr?sp?r/）是原核生物基因組內(nèi)的一段重復(fù)序列 
      。CRISPR全稱Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats（成簇的規(guī)律性間隔的短回文重復(fù)序列）
      。分布在40%的已測(cè)序細(xì)菌和90%的已測(cè)序古細(xì)菌當(dāng)中
      。 （注：生活在深海的火山口、陸地的熱泉以及鹽堿湖等極端環(huán)境中
      ，有一些獨(dú)特結(jié)構(gòu)的細(xì)菌
      ，稱為古細(xì)菌）
          CRISPR基因序列主要由前導(dǎo)序列（leader）、重復(fù)序列（repeat）和間隔序列（spacer）構(gòu)成 
      。
          ①前導(dǎo)序列 ：富含AT堿基，位于CRISPR基因上游
      ， 被認(rèn)為是CRISPR序列的啟動(dòng)子 
      。
          ②重復(fù)序列 ：長(zhǎng)度約20–50 bp堿基且包含5–7 bp回文序列，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)
      ， 穩(wěn)定RNA的整體二級(jí)結(jié)構(gòu) 
      。
          ③間隔序列 ： 是被細(xì)菌俘獲的外源DNA序列 。這就相當(dāng)于細(xì)菌免疫系統(tǒng)的“黑名單”
      ，當(dāng)這些外源遺傳物質(zhì)再次入侵時(shí)
      ，CRISPR/Cas系統(tǒng)就會(huì)予以精確打擊。
          2
      、Cas基因位于CRISPR基因附近或分散于基因組其他地方，該基因編碼的蛋白均可與CRISPR序列區(qū)域共同發(fā)生作用。因此
      ，該基因被命名為CRISPR關(guān)聯(lián)基因（       CRISPR associated，Cas ）
      。       
         Cas基因編碼的Cas蛋白在防御過(guò)程中至關(guān)重要
      ，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Cas1-Cas10等多種類型的Cas基因
      。
          依據(jù)Cas蛋白在細(xì)菌免疫防御過(guò)程中參與的角色
      ，目前將CRISPR-Cas系統(tǒng)分為兩大類
      。 
          第一大類 ：它們切割外源核酸的效應(yīng)因子為多個(gè)Cas蛋白形成的復(fù)合物
      ，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型
      。
          第二大類 ：它們的作用因子是比較單一的Cas蛋白，比如Ⅱ型的Cas9蛋白和Ⅴ型的Cpf蛋白
      。
                                                  目前
      ，被最為廣泛應(yīng)用的CRISPR系統(tǒng)是II型CRISPR-Cas系統(tǒng)
      ，也就是CRISPR-Cas9系統(tǒng)
      。 
          二
      、CRISPR-Cas9的作用原理 
         對(duì)于CRISPR-Cas9的作用機(jī)理可以分為三個(gè)階段來(lái)理解
      。
          1、第一階段：CRISPR 的高度可變的間隔區(qū)的獲得 （ 俘獲外源DNA
      ，登記“黑名單” ）
         CRISPR 的高度可變的間隔區(qū)獲得
      ，其實(shí)就是指外來(lái)入侵的噬菌體或是質(zhì)粒DNA 的一小段DNA 序列被整合到宿主菌的基因組，整合的位置位于CRRSPR 的5' 端的兩個(gè)重復(fù)序列之間
      。因此
      ，CRISPR 基因座中的間隔序列從5' 到3' 的排列也記錄了外源遺傳物質(zhì)入侵的時(shí)間順序。
         新間隔序列的獲得可能分為三步：
         第1步：Cas1和Cas2編碼的蛋白將掃描入侵的DNA
      ，并識(shí)別出PAM區(qū)域，然后將臨近PAM的DNA序列作為候選的原型間隔序列
      。
         [圖片上傳失敗...(image-b6e38b-1634820207330)]
         第2步：Cas1/2蛋白復(fù)合物將原間隔序列從外源DNA中剪切下來(lái)
      ，并在其他酶的協(xié)助下將原間隔序列插入臨近CRISPR序列前導(dǎo)區(qū)的下游
      。
         第3步：DNA會(huì)進(jìn)行修復(fù)
      ，將打開(kāi)的雙鏈缺口閉合。這樣一來(lái)
      ，一段新的間隔序列就被添加到了基因組的CRISPR序列之中
      。
         [圖片上傳失敗...(image-4831b9-1634820207330)]
          2、第二階段：CRIPSR 基因座的表達(dá)（包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的成熟加工） 
         CRISPR序列在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生pre-crRNA（ crRNA的前體 ）
      ，同時(shí)與pre-crRNA序列互補(bǔ)的tracrRNA（ 反式激活crRNA ）也被轉(zhuǎn)錄出來(lái)。pre-crRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與tracrRNA形成雙鏈RNA并與Cas9編碼的蛋白組裝成一個(gè)復(fù)合體
      。它將根據(jù)入侵者的類型，選取對(duì)應(yīng)的“身份證號(hào)碼”（ 間隔序列RNA ）
      ，并在核糖核酸酶Ⅲ（ RNaseⅢ ）的協(xié)助下對(duì)這段“身份證”進(jìn)行剪切
      ，最終形成一段短小的crRNA（ 包含單一種類的間隔序列RNA以及部分重復(fù)序列區(qū) ）
      。
         crRNA
      ，Cas9以及tracrRNA組成最終的復(fù)合物，為下一步剪切做好準(zhǔn)備
      。
                                                  3、第三階段：CRISPR/Cas 系統(tǒng)活性的發(fā)揮（靶向干擾） 
         crRNA
      ，Cas9以及tracrRNA組成最終的復(fù)合物就像是一枚制導(dǎo)導(dǎo)彈，可以對(duì)入侵者的DNA進(jìn)行精確的打擊
      。這個(gè)復(fù)合物將掃描整個(gè)外源DNA序列
      ，并識(shí)別出與crRNA互補(bǔ)的原間隔序列。這時(shí)
      ，復(fù)合物將定位到PAM/原間隔序列的區(qū)域，DNA雙鏈將被解開(kāi)
      ，形成R-Loop。crRNA將與互補(bǔ)鏈雜交
      ，而另一條鏈則保持游離狀態(tài)。
         隨后
      ，Cas9蛋白精確的平端切割位點(diǎn)位于PAM上游3個(gè)核苷酸位置，形成平末端產(chǎn)物
      。Cas9蛋白的HNH結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割與crRNA互補(bǔ)配對(duì)的那一條DNA鏈
      ，而RuvC結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)切割另外一條非互補(bǔ)DNA鏈
        。最終在Cas9的作用下DNA雙鏈斷裂（DSB）
        ，外源DNA的表達(dá)被沉默
        ，入侵者被一舉殲滅
        。
                                                 三
        、 CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)及應(yīng)用… 
         tracrRNA-crRNA在被融合為單鏈向?qū)NA（sgRNA）時(shí)也可以發(fā)揮指導(dǎo)Cas9的作用。
         CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)就是通過(guò)人工設(shè)計(jì)的 sgRNA（guide RNA）來(lái)識(shí)別目的基因組序列
        ，并引導(dǎo) Cas9 蛋白酶進(jìn)行有效切割 DNA 雙鏈，形成雙鏈斷裂
        ，損傷后修復(fù)會(huì)造成基因敲除或敲入等
        ，最終達(dá)到對(duì)基因組DNA 進(jìn)行修飾的目的。
         CRISPR-Cas9的廣泛應(yīng)用
         1
        、基因敲除（Knock-out）
         Cas9可以對(duì)靶基因組進(jìn)行剪切
        ，形成DNA的雙鏈斷裂。在通常情況下
        ，細(xì)胞會(huì)采用高效的 非同源末端連接 方式（NHEJ）對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)
        。但是
      ，在修復(fù)過(guò)程中通常會(huì)發(fā)生堿基插入或缺失的錯(cuò)配現(xiàn)象
      ，造成移碼突變，（ 移碼突變 ：是指DNA分子由于某位點(diǎn)堿基的缺失或插入
      ，引起閱讀框架變化
      ，造成下游的一系列密碼改變
      ，使原來(lái)編碼某種肽鏈的基因變成編碼另一種完全不同的肽鏈序列
      。）使靶標(biāo)基因失去功能，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除
      。為了提高CRISPR系統(tǒng)的特異性，可將Cas9的一個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變
      ，形成只能對(duì)DNA單鏈進(jìn)行切割造成DNA缺口的Cas9 nickase核酸酶
      。因此想要形成雙鏈斷裂的效果可以設(shè)計(jì)兩條sgRNA序列，分別靶向DNA互補(bǔ)的兩條鏈
      ，這樣兩條sgRNA特異性的結(jié)合靶標(biāo)序列
      ，即可形成DNA斷裂
      ，并在修復(fù)過(guò)程中通過(guò)移碼突變實(shí)現(xiàn)基因敲除
         2
      、基因敲入（Knock-in）
         當(dāng)DNA雙鏈斷裂后
      ，如果有DNA修復(fù)模板進(jìn)入到細(xì)胞中
      ，基因組斷裂部分會(huì)依據(jù)修復(fù)模板進(jìn)行 同源重組修復(fù) （HDR）
      ，從而實(shí)現(xiàn)基因敲入。修復(fù)模板由需要導(dǎo)入的目標(biāo)基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）組成
      ，同源臂的長(zhǎng)度和位置由編輯序列的大小決定。DNA修復(fù)模板可以是線性/雙鏈脫氧核苷酸鏈
        ，也可以是雙鏈DNA質(zhì)粒
        。HDR修復(fù)模式在細(xì)胞中發(fā)生率較低
        ，通常小于10%
        。為了增加基因敲入的成功率，目前有很多科學(xué)家致力于提高HDR效率
        ，將編輯的細(xì)胞同步至HDR最活躍的細(xì)胞分裂時(shí)期，促進(jìn)修復(fù)方式以HDR進(jìn)行
        ；或者利用化學(xué)方法抑制基因進(jìn)行NHEJ
        ，提高HDR的效率
         3、基因抑制
        、基因激活（Repression or Activation）
         Cas9的特點(diǎn)是能夠自主結(jié)合和切割目的基因
        ，通過(guò)點(diǎn)突變的方式使Cas9的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域RuvC-和HNH-失去活性，形成的dCas9只能在sgRNA的介導(dǎo)下結(jié)合靶基因
        ，而不具備剪切DNA的功能
        。因此，將dCas9結(jié)合到基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)
        ，可以阻斷轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始
        ，從而抑制基因表達(dá)；將dCas9結(jié)合到基因的啟動(dòng)子區(qū)域也可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制/活化物
        ，使下游靶基因轉(zhuǎn)錄受到抑制或激活
        。因此dCas9與Cas9、Cas9 nickase的不同之處在于
      ，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的
      ，并不會(huì)對(duì)基因組DNA造成永久性的改變
      。
         4
      、多重編輯（Multiplex Editing）
         將多個(gè)sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到細(xì)胞中，可同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行編輯
      ，具有基因組功能篩選作用。多重編輯的應(yīng)用包括：使用雙Cas9nickases提高基因敲除的準(zhǔn)確率
      、大范圍的基因組缺失及同時(shí)編輯不同的基因
      。通常情況下，一個(gè)質(zhì)粒上可以構(gòu)建2～7個(gè)不同的sgRNA進(jìn)行多重CRISPR基因編輯
      。
         5
      、功能基因組篩選
         利用CRISPR-Cas9進(jìn)行基因編輯可以產(chǎn)生大量的基因突變細(xì)胞，因此利用這些突變細(xì)胞可以確認(rèn)表型的變化是否是由基因或者遺傳因素導(dǎo)致的
      ?div   id="4qifd00"   class="flower right">
      ；蚪M篩選的傳統(tǒng)方法是shRNA技術(shù)，但是shRNA有其局限性：具有很高的脫靶效應(yīng)以及無(wú)法抑制全部基因而形成假陰性的結(jié)果
      。CRISRP-Cas9系統(tǒng)的基因組篩選功能具有高特異性和不可逆性的優(yōu)勢(shì)
      ，在基因組篩選中得到了廣泛的應(yīng)用。目前CRISPR的基因組篩選功能應(yīng)用于篩選對(duì)表型有調(diào)節(jié)作用的相關(guān)基因
      ，如對(duì)化療藥物或者毒素產(chǎn)生抑制的基因
      、影響腫瘤遷移的基因以及構(gòu)建病毒篩選文庫(kù)對(duì)潛在基因進(jìn)行大范圍篩選等。
          CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)簡(jiǎn)介 - 知乎 (zhihu.com) 
      

          
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      芹菜與黃瓜同食好嗎
      
                        
      芹菜與黃瓜同食好嗎芹菜不宜與黃瓜一同食用，這是因?yàn)辄S瓜中含有維生素C分解酶
      ，這種物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致芹菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低
 
                
            
      
                
      
                    
                        
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      無(wú)氧運(yùn)動(dòng)是什么,有哪些好處無(wú)氧運(yùn)動(dòng)是運(yùn)動(dòng)的一種方式
      ，我們比較常見(jiàn)的就是有氧運(yùn)動(dòng)，有氧運(yùn)動(dòng)要比較無(wú)氧運(yùn)動(dòng)更有利于健康
      。你知道無(wú)氧運(yùn)動(dòng)是什么嗎
 
                
            
      
                
      
                    
                        
      寶寶睡覺(jué)時(shí)驚厥的癥狀,如何預(yù)防小兒驚厥
      
                        
      一
      、寶寶睡覺(jué)時(shí)驚厥的癥狀有哪些癥狀一：嬰兒在剛?cè)胨瘯r(shí)或即將醒時(shí)滿頭大汗。專家提醒：可以說(shuō)大多數(shù)嬰兒夜間出汗都是正常的
      。但如果大汗淋漓
      ，并伴有其他不適的表現(xiàn)，就要注意觀察
 
                
            
      
                
      
                    
                        
      榆錢怎么吃,春天嘗鮮就吃榆錢
      
                        
      春季嘗鮮吃榆錢雖然榆錢寓意著富余
      ，但對(duì)50多歲的不少人來(lái)說(shuō)卻是帶點(diǎn)痛苦的記憶。在生活困難時(shí)期
      ，野菜、樹(shù)皮
      、樹(shù)葉……能吃的不能吃的
      ，為了活命都嘗試過(guò)。到了我們這一代
 
                
            
      
                
      
                    
                        
      癌痛到底是陣痛還是持續(xù)痛？如何才能緩解
      ？一文科普
      ，不妨看看！
      
                        
      癌痛指的是癌性疼痛
        ，是由于患上各種癌癥
        ，引起了神經(jīng)受壓等問(wèn)題
      ，從而使患者產(chǎn)生的疼痛現(xiàn)象
      。有很多人認(rèn)為，癌痛屬于陣發(fā)性的疼痛
      ，只要適當(dāng)服用藥物就能夠起到快速止痛的作用
      。但有不少人認(rèn)為，癌痛屬于劇烈且持續(xù)性的疼痛
      。那么，癌痛到底是陣痛還是持續(xù)性
      
                    
                    
      
                        
      
                            
                        
      
                        2023-08-13
                    
      
                
      
                
                ，不妨看看
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      ？一文科普
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