清華大學用CRISPR解析重要lncRNA

清華大學用CRISPR解析重要lncRNA

2016年08月28日訊 國際學術期刊《Genome Research》在線刊登了清華大學生命科學學院的高冠軍博士帶領的一項研究成果，題為“Critical roles of long noncoding RNAs in Drosophila spermatogenesis”。這項研究確定了128個睪丸特異性的果蠅lncRNA，并采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)解析了它們的重要功能。

本文通訊作者高冠軍早年畢業(yè)于揚州大學，2005年博士畢業(yè)于浙江大學，2006年至2011年在美國國立衛(wèi)生研究院從事博士后和Research Fellow，2011年至今為清華大學生命科學學院PI、博士生導師。其帶領的課題組通過運用實驗室在國際上率先建立的CRISPR與phiC31重組酶相結合的高效果蠅基因打靶系統(tǒng)（knock-out和knock-in），綜合運用遺傳與生化相結合的方法與技術，規(guī)?；芯咳旧|表觀遺傳學相關因子（如非編碼RNA及組蛋白修飾等）在生殖系統(tǒng)及胚胎早期發(fā)育進程中的生物學功能及相應的分子作用機制。

長鏈非編碼RNAs（lncRNAs）是最近發(fā)現(xiàn)的一類細胞RNAs，在許多細胞發(fā)育過程中起著重要的調控作用。雖然lncRNAs已在各種系統(tǒng)中進行了系統(tǒng)性的鑒定，但是在活體動物模型中，它們中的大多數(shù)都沒有得以功能上的表征。在這項研究中，該研究小組確定了128個睪丸特異性的果蠅lncRNAs，并采用一種優(yōu)化的三組份CRISPR/Cas9系統(tǒng)，敲除了它們當中的105個。在lncRNA敲除的突變果蠅中，有33只（31%）表現(xiàn)出部分或全部的雄性生育能力喪失，伴有晚期精子發(fā)生的可見發(fā)育缺陷。

此外，6只敲除果蠅通過一種反式構型的轉基因而得以完全或部分修復，從而表明這些lncRNAs主要是反式發(fā)揮作用。此外，5個lncRNA突變體的基因表達譜顯示，睪丸特異性lncRNAs調節(jié)著總體的基因表達，精心策劃后期的雄性生殖細胞分化。

與編碼基因相比，睪丸特異性lncRNAs演化得更快。此外，具有更大功能重要性的lncRNAs具有較高的序列保守性，這表明它們處于不斷的進化選擇之下。總的來說，這些研究結果揭示了迅速進化的睪丸特異性lncRNAs在果蠅精子發(fā)生后期的關鍵功能。

此前，研究人員還公布了lncRNA在多種生物過程中的重要作用。例如，日本理化研究所（RIKEN）RNA生物學實驗室的Shinichi Nakagawa及其同事發(fā)現(xiàn)，一個特別的長非編碼RNA（lncRNA），在某些情況下可能對于生育是至關重要的。相關研究結果發(fā)表在2015年1月的國際著名期刊《Development》。

長非編碼RNA（lncRNA）正成為各種生物學過程的一個關鍵調控因子，然而，lncRNA在上皮間質轉化（EMT）中所起的作用，尚不明確。2015年1月20日，美國H. Lee Moffitt癌癥中心和浙江腫瘤醫(yī)院的研究人員，在《Journal of Biological Chemistry》發(fā)表了一項研究成果，解析了lncRNA在乳腺上皮細胞EMT過程中所起的作用。

2014年12月16日，中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院、山東大學、南方醫(yī)科大學、伯明翰大學和香港大學等處的研究人員，在國際著名學術期刊《Cell Research》發(fā)表了一項最新研究成果。這項研究對于lncRNAs在重編程中的作用提供了獨特見解，并在p53和異染色質之間建立了一種新的聯(lián)系。

CRISPR Cas9系統(tǒng)目前的研究熱點在什么方面

1.什么是CRISPR/Cas9？
CRISPR----Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats
是在細菌和古細菌中廣泛存在的成簇的、有規(guī)律的、間隔的短回文重復序列。07年，發(fā)現(xiàn)細菌可以用CRISPR系統(tǒng)抵抗噬菌體的入侵；08年，發(fā)現(xiàn)細菌的
CRISPR系統(tǒng)能夠阻止外源質粒的轉移。是細菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)。
Cas----CRISPR-associated
CRISPR/Cas9----CRIPSR-
Cas系統(tǒng)分為Type I、TypeII 、Type III三種類型。在TypeII
系統(tǒng)中包含一個標志性的Cas9蛋白（參與crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌體DNA或外源質粒)。CRISPR/Cas系統(tǒng)和Cas9蛋白結合成復合
體，發(fā)揮識別和降解入侵的外源DNA功能。
2.CRISPR/Cas9的優(yōu)缺點
優(yōu)點：

構建方便簡單快捷
高效的介導基因定點敲入和基因組的點突變
精確的切口酶活性提高了基因治療的安全性
缺點：

嚴重的脫靶性
3.CRISPR/Cas9的用途
CRISPR/Cas9被改造成第三代人工核酸內切酶（前兩代分別是ZFN和TALEN），用于復雜基因組的編輯，目前該技術應用于人類細胞、斑馬魚、小鼠及細菌的基因組精確修飾。
4.CRISPR/Cas9目前熱點
CRISPR/Cas9有個極大的優(yōu)勢就是可以改造為切口酶，在DNA的特定位置制造單鏈切口，這樣不會引起非同源末端連接，但是可以激活同源細胞的重組。
這套系統(tǒng)目前的主要用途是在以下幾個方面：

基因定點InDel突變
基因定點敲入
兩位點同時突變
小片段的缺失
編碼基因和非編碼基因（lncRNA、microRNA）的靶向基因敲除

反義rna抑制基因表達的作用體現(xiàn)在那四個方面

反義lncRNA（antisense lncRNA）是指由基因（通常是蛋白編碼基因）的反義鏈轉錄，并與該基因的mRNA存在序列重疊的RNA分子。隨著對非編碼RNA研究的深入，研究發(fā)現(xiàn)約70%的基因均有反義lncRNA【1】。更為重要的是，反義lncRNA往往與其正義鏈基因的表達存在相關性，提示反義lncRNA可能廣泛地參與了蛋白編碼基因的表達調控。

目前，關于反義lncRNA影響正義鏈基因表達的作用機制，主要有3類：1.反義lncRNA的轉錄過程，抑制正義鏈基因的轉錄，該機制認為反義鏈轉錄事件本身，而不是反義lncRNA，調控了基因的表達。2.反義lncRNA結合DNA或組蛋白修飾酶，調控所在基因座位的表觀遺傳學，從而影響正義鏈基因的表達。3.反義lncRNA與正義鏈mRNA通過堿基互補配對結合，影響mRNA的可變剪接等【2】。

2019年4月4日，來自美國哥倫比亞大學的Tom Maniatis教授在 Cell 上發(fā)表研究Antisense lncRNA Transcription Mediates DNA Demethylation to Drive Stochastic Protocadherin a Promoter Choice。該研究首次發(fā)現(xiàn)反義lncRNA的轉錄可以影響DNA甲基化，進而改變染色體結構，促進增強子與啟動子的結合，調控Pcdhα基因的表達。該反義lncRNA的作用模型也解釋了Pcdhα基因的可變外顯子選擇機制。

在神經發(fā)育過程中，單個神經細胞響應不同的信號分子，會分化為具有不同功能的細胞，并最終形成復雜的神經回路。在此過程中，神經細胞需要區(qū)別自身與其他神經元，這就需要一個細胞表面獨特的識別蛋白。哺乳動物的Pcdh（Protocadherin，原鈣黏附蛋白）就發(fā)揮了這樣的功能，它具有多個隨機啟動的可變外顯子，可產生多個轉錄本（isoform）（圖1）。

圖1. Pcdhα基因
為了研究Pcdhα基因的表達調控，研究者系統(tǒng)地分析了該基因座位的轉錄情況，驚訝的發(fā)現(xiàn)每一個Pcdhα可變外顯子的反義鏈，都存在一個保守的反義lncRNA。利用CRISPR dCas9-VPR系統(tǒng)激活反義lncRNA的表達，會促進相應可變外顯子的轉錄。

那么反義lncRNA是如何促進響應正義轉錄本的轉錄的呢？研究者發(fā)現(xiàn)，反義lncRNA的轉錄，會造成該位點DNA去甲基化的發(fā)生，從而使遠端增強子靠近該外顯子的啟動子，促進它的表達。如圖2所示，Pcdhα基因座位均帶有抑制表達的DNA甲基化修飾，而當反義lncRNA表達時，該外顯子附近的DNA被DNA去甲基化酶TET3識別，去除了甲基化修飾，cohesin蛋白重塑了染色體的結構，HS5-1增強子與該基因座位的啟動子結合，啟動相應Pcdhα變體的表達。

圖2
該研究從非編碼RNA的角度揭示了Pcdhα基因變體的隨機選擇機制，然而，目前對反義lncRNA的表達驅動尚不清楚。對該問題的解決將有助于更全面的了解神經細胞身份的決定過程。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.03.008

制版人：珂

參考文獻

1. Yiping He, Bert Vogelstein, Victor E. Velculescu，The Antisense Transcriptomes of Human Cells，SCIENCE VOL 322 19 DECEMBER 2008

2. Mohammad Ali Faghihi and Claes Wahlestedt，Regulatory roles of natural antisense transcripts.NATURE REVIEWS, VOlUME 10 | SEpTEMBER 2009 | 637

本文地址:http://www.mcys1996.com/jiankang/302249.html.

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