Cell：衰老的神經(jīng)元調(diào)控(慢性腦缺血的病理損傷機(jī)制)

Cell：衰老的神經(jīng)元調(diào)控

2016年08月22日訊 衰老的一大特征就是多個組織出現(xiàn)穩(wěn)態(tài)失衡，神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)配著外部和內(nèi)部的信號，以及這些信號傳遞到外周組織的過程，因此可以說是掌管著整個人體的動態(tài)平衡。

來自麻省理工學(xué)院的研究人員發(fā)現(xiàn)我們的大腦能夠?qū)W習(xí)及生成新記憶的一個過程會隨著我們年齡的增長出現(xiàn)退化。

在以往對阿爾茨海默氏癥小鼠的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)即便是在疾病癥狀出現(xiàn)之前的階段，大腦海馬區(qū)的神經(jīng)元都含有大量的DNA損傷--DNA雙鏈斷裂。

為了確定這些DNA雙鏈斷裂產(chǎn)生的機(jī)制和原因以及受累的基因，研究人員開始調(diào)查了當(dāng)他們在神經(jīng)元中造成這種損傷時會發(fā)生什么。他們給神經(jīng)元添加了一種誘導(dǎo)DNA雙鏈損傷的毒性物質(zhì)，隨后獲取了細(xì)胞的RNA進(jìn)行測序。

他們發(fā)現(xiàn)有700個基因顯示出因這種損傷引起的改變，如預(yù)期的一樣大多數(shù)的表達(dá)水平均降低。然而令人感到驚訝的是，12個已知快速響應(yīng)新感覺體驗一類的神經(jīng)元刺激的基因，在DNA雙鏈斷裂后顯示表達(dá)水平升高。

最后，研究人員試圖確定了這些基因需要如此激烈的一種機(jī)制來使得它們得以表達(dá)的原因。利用計算分析，他們研究了這些基因附近的DNA序列，發(fā)現(xiàn)它們富含一種用于結(jié)合CTCF蛋白的模體（序列模式）。這種“建筑”蛋白已知可以在DNA中造成環(huán)或彎曲。

個人都擔(dān)心隨著年齡的增長而喪失記憶力--記憶力喪失仍然是老年人當(dāng)中最常抱怨的事情。但是這個過程背后的分子原因仍不清楚，特別是與年齡相關(guān)的機(jī)制。

來自美國佛羅里達(dá)州大學(xué)斯克里普斯研究所的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一種機(jī)制，可在普通果蠅中引起年齡所致的長期記憶喪失，果蠅是一種被廣泛認(rèn)可的人類記憶研究替代物種。

研究人員利用實時細(xì)胞成像，來監(jiān)測老年果蠅學(xué)習(xí)之前和之后的神經(jīng)元活性變化，發(fā)現(xiàn)一組被稱為背內(nèi)側(cè)配對神經(jīng)元和覃形體神經(jīng)元的神經(jīng)元之間的結(jié)構(gòu)連通性發(fā)生了缺陷，這些缺陷會阻止長期記憶的形成。

長期記憶需要形成新的突觸和新的蛋白質(zhì)，而短期記憶則是在現(xiàn)有蛋白質(zhì)之上構(gòu)建的?，F(xiàn)在我們知道長期記憶喪失是一個神經(jīng)連通性問題，為了改善記憶，我們就必須考慮重建這種聯(lián)系的方法。

慢性腦缺血的病理損傷機(jī)制

2.1 組織形態(tài)學(xué)改變與慢性腦缺血
慢性腦缺血時，最容易受累的部位是腦白質(zhì)，而白質(zhì)損傷最明顯的表現(xiàn)為白質(zhì)疏松、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生以及海馬區(qū)的神經(jīng)纖維脫損傷和髓鞘改變，這些變化在缺血早期就能表現(xiàn)出來。慢性腦缺血后，毛細(xì)血管和血腦屏障（BBB）表現(xiàn)出不同程度的損傷，主要表現(xiàn)為毛細(xì)血管周細(xì)胞的退行性改變，血管床基底膜增厚以及大量的膠原纖維沉積等。Wu等人利用動靜脈瘺模型對慢性腦缺血后的超微結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行了研究，并將慢性腦缺血分為三期：急性期（3d）、亞急性期（3w）和慢性期（3個月），通過電鏡觀察顯示急性期超微結(jié)構(gòu)無明顯的變化，亞急性期毛細(xì)血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突出現(xiàn)輕度的空泡狀變性，而在慢性期則出現(xiàn)明顯的空泡狀變性。
Shin等人通過通過檢測claudin-3的免疫活性對慢性腦缺血后血腦屏障的破壞程度進(jìn)行了研究，claudin-3為一種維持血腦屏障（BBB）緊密連接完整性以及對BBB通透性其主要作用的蛋白質(zhì)。通過研究發(fā)現(xiàn)，在慢性腦缺血2w后，BBB結(jié)構(gòu)被破壞、通透性增加，但claudin-3的免疫活性卻增加，并且這種變化一直持續(xù)到缺血6w以后，因此，claudin-3表達(dá)的上調(diào)與BBB的破壞有關(guān)。但血腦屏障破壞與claudin-3表達(dá)之間的調(diào)節(jié)機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。
2.2 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與慢性腦缺血
神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（Neuroglial cell）是神經(jīng)系統(tǒng)的間質(zhì)細(xì)胞，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要的作用，它們不僅對神經(jīng)元起到支持營養(yǎng)作用，還參與了大腦內(nèi)信息的轉(zhuǎn)導(dǎo)及傳遞，調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌及攝取，維持腦內(nèi)環(huán)境的平衡等多種作用。CNS內(nèi)的膠質(zhì)細(xì)胞包括星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocyte， AS）、少突膠質(zhì)細(xì)胞（Oligodendrocyte，OLG）和小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglialcel， lMG）等。不同的膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮著不同的功能，在慢性腦缺血后的損傷和修復(fù)中起著不同的作用。
星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活在慢性腦缺血后的神經(jīng)退行性改變及海馬區(qū)神經(jīng)元損傷等方面起著很重要的作用。在研究星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活過程中，常選擇膠質(zhì)纖維酸蛋白（GFAP）、S100B蛋白、Nestin 蛋白的表達(dá)以及谷氨酸代謝等指標(biāo)來進(jìn)行研究。其中S100B是一種鈣結(jié)合蛋白，主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，起著調(diào)節(jié)蛋白磷酸化、構(gòu)成細(xì)胞骨架以及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的作用[24]。Schmidt-Kastner等人選擇GFAP和 Nestin 蛋白作為觀察指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)在慢性腦缺血1w后，在新大腦皮質(zhì)上出現(xiàn)彌漫的GFAP和Nestin表達(dá)增加。Vicente等人通過檢測GFAP、S100B水平和谷氨酸合成酶活性等指標(biāo)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在慢性腦缺血10w后，海馬區(qū)的S100B，和GFAP水平明顯升高，海馬區(qū)谷氨酸攝取和谷氨酸合成酶活性也明顯降低，因此證明了星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活在慢性腦缺血后的神經(jīng)退行性改變及認(rèn)知功能障礙方面起著重要的作用。
慢性腦缺血后，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與白質(zhì)的損傷的程度也表現(xiàn)出一定得相關(guān)性，小膠質(zhì)細(xì)胞激活能加重白質(zhì)的損傷，其主要機(jī)制是通過激活活性氧簇（ROS）如超氧自由基、羥自由基、NO等，以及激活促炎癥反應(yīng)因子如TNF-α等方式，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡加重白質(zhì)損傷。Farkas等人研究發(fā)現(xiàn)慢性腦缺血后，MMP-2、MHC-I/II以及促炎反應(yīng)因子染色陽性的細(xì)胞增加，因此，小膠質(zhì)細(xì)胞能夠通過產(chǎn)生促炎癥反應(yīng)因子誘發(fā)延遲的神經(jīng)損傷，此外小膠質(zhì)細(xì)胞還能參與清除壞死組織和促進(jìn)神經(jīng)再生的作用。
少突膠質(zhì)細(xì)胞是一種形成髓鞘的細(xì)胞，慢性腦缺血后，會出現(xiàn)一定程度的少突膠質(zhì)細(xì)胞的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，在慢性腦缺血7d后，出現(xiàn)少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷、DNA斷裂、Caspase凋亡通路激活、Caspase-3 mRNA的表達(dá)增加，同時膠質(zhì)細(xì)胞中參與凋亡信號有關(guān)的分子如TNF-α、Bax 蛋白表達(dá)都有上調(diào)，同時這些改變也進(jìn)一步加重了白質(zhì)的損傷以及少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。
2.3 神經(jīng)遞質(zhì)變化與慢性腦缺血
中樞膽堿能系統(tǒng)的變化在慢性腦缺血腦損傷的發(fā)展過程發(fā)揮著很重要的作用，膽堿能神經(jīng)元功能障礙是導(dǎo)致認(rèn)知功能受損害的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，膽堿能系統(tǒng)功能障礙也是引起紋狀體神經(jīng)細(xì)胞損傷一個主要的原因。慢性腦缺血后中樞膽堿能系統(tǒng)功能障礙主要表現(xiàn)為：乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（Chat）活性減低、乙酰膽堿水平下降、M型ACh-R的結(jié)合力下降以及M型膽堿能受體的mRNA表達(dá)降低等。
慢性腦缺血后，中樞的單胺能神經(jīng)系統(tǒng)和谷氨酸能系統(tǒng)也發(fā)生一系列的變化。Tanaka等人研究發(fā)現(xiàn)在慢性腦缺血后有一過性可逆的中樞單胺能神經(jīng)遞質(zhì)的變化，去甲腎上腺素水平只在第1w有升高，5-羥色胺能遞質(zhì)水平在急性期（1到3周）的升高，慢性期（6w后）卻出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，因此，推測慢性腦缺血之后的3w內(nèi)出現(xiàn)的神經(jīng)遞質(zhì)的變化可以作為慢性腦缺血治療的靶點，進(jìn)行干預(yù)性治療研究。但關(guān)于這些神經(jīng)遞質(zhì)的變化對慢性腦缺血后的神經(jīng)損傷的作用機(jī)制不十分明確，他們在慢性腦缺血中的作用有待進(jìn)一步研究。
此外，還有研究者發(fā)現(xiàn)在慢性腦缺血后組胺及其受體也發(fā)生了變化。在慢性腦缺血后組胺的mRNA表達(dá)下降，推測其原因可能為：（1）中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)海馬對缺血缺氧最敏感，慢性腦缺血后必然降低其營養(yǎng)代謝，使H4受體的表達(dá)減弱；（2）慢性腦缺血后海馬內(nèi)組胺量減少，能結(jié)合到組胺的H4受體量下降，通過反饋機(jī)制調(diào)控受體的表達(dá)下降；（3）中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)其它生化改變影響了H4受體的基因表達(dá)調(diào)控，使其表達(dá)減少。但組胺的改變在慢性腦缺血后神經(jīng)損傷中的確切機(jī)制及作用也有待進(jìn)一步的研究。
2.4 神經(jīng)細(xì)胞凋亡與慢性腦缺血
神經(jīng)細(xì)胞凋亡與多種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病相關(guān)。在慢性腦缺血中，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡在神經(jīng)損傷方面同樣起著重要的作用。慢性腦缺血能誘導(dǎo)椎體神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，在缺血后2～27w出現(xiàn)細(xì)胞核濃縮、染色體片段化以及DNA斷裂以及椎體神經(jīng)元細(xì)胞的減少，推測其主要原因為慢性腦缺血急性期時出現(xiàn)的谷氨酸細(xì)胞毒性作用以及持續(xù)性的神經(jīng)元去極化所誘導(dǎo)。王守春等人通過應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，在慢性腦缺血1w后，額葉、海馬細(xì)胞凋亡率分別為8.18%、21.92%，在缺血后2w時紋狀體區(qū)細(xì)胞凋亡率達(dá)最高為9.22%，均明顯高于對照組的，以后均逐漸下降。通過TUNEL染色也發(fā)現(xiàn)額葉、海馬及尾狀核神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯高于對照組。
通過對凋亡分子水平的研究也發(fā)現(xiàn)凋亡在慢性腦缺血神經(jīng)損傷方面起著重要的作用。Bcl-2基因是抗細(xì)胞凋亡基因中的代表基因，在線粒體介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡通路中發(fā)揮重要作用：Bcl-2可能是通過抑制谷胱甘肽的外泄及封閉Bax形成孔道的活性，降低胞內(nèi)的氧化還原電位，并使一些小分子不能自由通透，能調(diào)節(jié)線粒體膜對一些凋亡蛋白前體的通透性，從而保護(hù)細(xì)胞，它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作為一種有效的抑制神經(jīng)元凋亡和壞死的因子，可促進(jìn)神經(jīng)元的存活以及突觸的再生。實驗研究發(fā)現(xiàn)在慢性腦缺血后，Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯增加。此外，慢性腦缺血后，少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡引起Caspase凋亡通路激活、Caspase-3 mRNA的表達(dá)增加，這些改變導(dǎo)致白質(zhì)的損傷以及少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡。
2.5、Aβ與慢性腦缺血
β淀粉樣肽（Aβ）在神經(jīng)細(xì)胞外沉積是AD疾病發(fā)生的觸發(fā)因素，在AD的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用。Aβ主要由淀粉樣前體蛋白（APP）通過兩種酶的作用產(chǎn)生，一種為β位點APP清除酶，另一種為γ分泌酶。β淀粉樣前體蛋白清除酶（BACE1）是一種水解APP生成的Aβ的β分泌酶，β分泌酶的活性則主要取決于BACE1的水平，因此，BACE1在Aβ的生成方面起著很重要的作用。
Wakita等人[16]通過檢測β/A4淀粉樣前體蛋白（APP）和嗜鉻粒蛋白A（CgA）的水平來檢測軸突的損傷程度，研究發(fā)現(xiàn)在缺血后的1到30d內(nèi)，APP、CgA和EP染色陽性的神經(jīng)纖維逐漸增加，而腦皮質(zhì)的改變不明顯。因此證明了在慢性腦缺血時，白質(zhì)是對缺血較敏感的區(qū)域，同時在慢性腦缺血后，APP表達(dá)增加。但Cai等人[40]研究發(fā)現(xiàn)，慢性腦缺血后海馬區(qū)BACE1和Aβ水平增加，其增加的程度與認(rèn)知障礙損傷程度呈相關(guān)性，但APP卻沒有明顯的增加。Aβ的增加主要歸因于BACE1的上調(diào)，但是慢性腦缺血后Aβ清除障礙是否為導(dǎo)致Aβ沉積的原因、慢性腦缺血后加重AD的發(fā)病機(jī)制以及慢性腦缺血后APP的變化等問題也有待進(jìn)一步的深入研究。
2.6 自由基形成、氧化應(yīng)激與慢性腦缺血
自由基通過活性氧簇（ROS）在各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理改變以及疾病的進(jìn)展方面起著重要的作用[41]，許多促氧化酶和抗氧化酶在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)和損傷中也起著重要的作用[42]。Tanaka等人[43]在研究慢性腦缺血后的氧化應(yīng)激和氧化還原反應(yīng)過程中，將慢性腦缺血分為兩個階段：第1天到6周為急性期，第6周以后為慢性期。急性期的氧化還原反應(yīng)主要與神經(jīng)細(xì)胞損傷和遲發(fā)的膽堿能系統(tǒng)功能障礙有關(guān)，而神經(jīng)細(xì)胞功能障礙主要與亞硝酸鹽和硝酸鹽（NOx）濃度升高所致，中樞膽堿能系統(tǒng)功能障礙則是由于GSH濃度降低所致。
Tanaka等人還發(fā)現(xiàn)在慢性腦缺血1d后，NOx的濃度和誘導(dǎo)型NO的mRNA表達(dá)開始上升，誘導(dǎo)型NO合酶（iNOS酶）的活性升高。推測NOx濃度升高可能為星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活導(dǎo)致iNO mRNA表達(dá)增加所致。iNOS具有破壞血管內(nèi)皮，激活缺血區(qū)域的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的作用。在慢性腦缺血第1天以及6w之后，紋狀體的超氧化物歧化酶（SOD）活性都有降低，Tanaka等人認(rèn)為第1天出現(xiàn)的SOD活性降低為亞硝酸鹽產(chǎn)生過程中消耗了大量的過氧化物所致，而6w后出現(xiàn)的第二次SOD活性降低是由于氧化應(yīng)激作用消耗了超氧化物所致。自由基形成和氧化應(yīng)激在慢性腦缺血中的作用機(jī)制較復(fù)雜，目前的研究尚未完全闡明自由基對慢性腦缺血后的神經(jīng)損傷機(jī)制，對于氧化應(yīng)激及在慢性腦缺血后的認(rèn)知功能障礙方面的機(jī)制也不完全清楚，這些都有待進(jìn)一步的研究。

神經(jīng)元凋亡檢測怎么做

1) PS（磷脂酰絲氨酸）在細(xì)胞外膜上的檢測：PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)在細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后不久發(fā)生，可能作為免疫系統(tǒng)的識別標(biāo)志。AnnexinV，一個鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，能專一性的結(jié)合暴露在膜外側(cè)的PS，再通過簡單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測。由于這是一種凋亡早期的活細(xì)胞檢測（懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結(jié)合來標(biāo)記凋亡的發(fā)展階段。
美國著名生物試劑公司CLONTECH和Invitrogen公司分別開發(fā)了多種標(biāo)記的Annexin V產(chǎn)品，簡便快速，10分鐘就可完成檢測。其中帶熒光標(biāo)記的Annexin V-EGFP（Enhanced Green Fluorescent Protein）及Annexin V-FITC，靈敏度高，可作為FACS（流式細(xì)胞分選）方法篩選凋亡細(xì)胞的基礎(chǔ)。由于融合蛋白Annexin V-EGFP，EGFP與PS 的結(jié)合比例為1：1，還可進(jìn)行定量檢測。除此之外，還提供生物素偶聯(lián)的Annexin V，可通過常用的酶聯(lián)顯色反應(yīng)來檢測。另外，MACS公司將磁珠包被Annexin V，可采用磁分選方法篩選凋亡細(xì)胞。
2)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測：
這反應(yīng)了細(xì)胞凋亡研究中相對較新的趨勢，研究什么樣的氧化還原環(huán)境引起下游事件的發(fā)生。CLONTECH公司的ApoAlertTM GlutathioneDetection Kit通過熒光染料monochlorobimane（MCB）體外檢測凋亡細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中谷光苷肽的減少來檢測凋亡早期細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化。正常狀態(tài)下，谷光苷肽（glutathione：GSH）作為細(xì)胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細(xì)胞內(nèi)有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應(yīng)在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細(xì)胞中，細(xì)胞膜中有可被凋亡信號啟動的ATP依賴的GSH轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH的排除非?；钴S時，細(xì)胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境，這可能導(dǎo)致了凋亡早期細(xì)胞線粒體膜電位的降低，從而使細(xì)胞色素C（三羧酸循環(huán)中的重要組分）從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞液中，啟動凋亡效應(yīng)器caspase的級聯(lián)反應(yīng)。
由于 GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關(guān)，此項檢測除了對研究細(xì)胞凋亡的起始非常有用外，還可用于心臟病、中風(fēng)等疾病治療的研究。但有些細(xì)胞如：HeLa 和3T3細(xì)胞凋亡時沒有明顯的GSH水平的變化，不能用此法檢測。
3)細(xì)胞色素C的定位檢測
細(xì)胞色素C作為一種信號物質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細(xì)胞液，結(jié)合Apaf-1 （apoptoticprotease activating factor-1）后啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)：細(xì)胞色素C/Apaf-1復(fù)合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ（cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4）是定位在線粒體內(nèi)膜上的膜蛋白，凋亡發(fā)生時，它保留在線粒體內(nèi)，因而它是線粒體富集部分的一個非常有用的標(biāo)志。
ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超離心，可從凋亡和非凋亡細(xì)胞中快速有效分離出高度富集的線粒體部分，再進(jìn)一步通過Western雜交用細(xì)胞色素C抗體和COX4抗體標(biāo)示細(xì)胞色素C和COX4的存在位置，從而判斷凋亡的發(fā)生。
4) 線粒體膜電位變化的檢測：
在凋亡研究的早期，從形態(tài)學(xué)觀測上線粒體沒有明顯的變化。隨著凋亡機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡也是細(xì)胞凋亡的重要組成部分，發(fā)生很多生理生化變化。例如，在受到凋亡誘導(dǎo)后線粒體轉(zhuǎn)膜電位會發(fā)生變化，導(dǎo)致膜穿透性的改變。MitoSensorTM，一個陽離子性的染色劑，對此改變非常敏感，呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細(xì)胞中，它在線粒體中形成聚集體，發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光。凋亡細(xì)胞中，因線粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在于細(xì)胞液中，發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用這種原理來檢測線粒體膜電位的變化。但是，這種方法不能區(qū)分細(xì)胞凋亡或其他原因?qū)е碌木€粒體膜電位的變化。 細(xì)胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶（某些Caspase的底物）在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。對于這一現(xiàn)象的檢測通常有以下兩種方法：
1) TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）
通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標(biāo)記的 dNTP （多為dUTP）間接（通過地高辛）或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過酶聯(lián)顯色或熒光檢測定量分析結(jié)果。美國Intergen公司提供多種標(biāo)記方法，直接熒光標(biāo)記，地高辛介導(dǎo)熒光標(biāo)記或過氧化物酶聯(lián)顯色，可做細(xì)胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細(xì)胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測。其中，直接標(biāo)記步驟少，操作簡便。而間接標(biāo)記有信號放大的作用，檢測靈敏度高。
2) LM-PCR Ladder （連接介導(dǎo)的PCR檢測）
當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞比例較小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通過LM-PCR（ligation-mediated PCR），連上特異性接頭，專一性地擴(kuò)增核小體的梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產(chǎn)生的核小體的梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進(jìn)行比較。
上述兩種方法都針對細(xì)胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細(xì)胞受到其它損傷（如機(jī)械損傷，紫外線等）也會產(chǎn)生這一現(xiàn)象，因此它對細(xì)胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。
3) Telemerase Detection （端粒酶檢測）
這是相對來說推出較早，用得較多的一種方法。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白，它可以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復(fù)序列，使細(xì)胞獲得“永生化”。正常體細(xì)胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鐘，表明細(xì)胞年齡、復(fù)制衰老或細(xì)胞凋亡的信號。研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的癌細(xì)胞或凋亡細(xì)胞都具有端粒酶的活性。Invitrogen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分別與底物及端粒重復(fù)序列配對的引物。如果待測樣本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同個數(shù)的6堿基（GGTTAG）端粒重復(fù)序列，通過PCR反應(yīng)，產(chǎn)物電泳檢測就可觀察到相差六個堿基的DNA Ladder現(xiàn)象（參見圖4）。此外，Intergen公司還提供用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測的試劑盒.
同樣，這種檢測方法也不專對細(xì)胞凋亡，檢測結(jié)果也不純反應(yīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，人們已經(jīng)設(shè)計了許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法。
1．光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡
1． 未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。
貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。
2． 染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割
成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。
2．熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。
常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258),DAPI。三種染料與　DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。
Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。
DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。
結(jié)果評判：細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。
3．透射電子顯微鏡觀察
結(jié)果評判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。 細(xì)胞凋亡在胚胎發(fā)育、造血、免疫系統(tǒng)的成熟以及維護(hù)正常組織和器官的細(xì)胞恒定與生長平衡，乃至機(jī)體衰老方面都起著重要作用。因此，有關(guān)凋亡的研究在臨床和基礎(chǔ)等各個領(lǐng)域已經(jīng)廣泛開展,凋亡細(xì)胞的檢測方法顯得非常重要。流式細(xì)胞儀( Flow cytometry ,FCM) 將流體噴射技術(shù)、激光光學(xué)技術(shù)、電子技術(shù)和計算機(jī)技術(shù)等集于一體,較其它方法有不可比擬的優(yōu)越性，既可定性又可定量,且具有簡單、快速和敏感性高的特點,可進(jìn)行多參數(shù)和活體細(xì)胞分析。在APO 的研究得到較為廣泛的應(yīng)用，開辟了新途徑。
1 光散射法
在FCM 系統(tǒng)中，被檢細(xì)胞在液流中通過儀器測量區(qū)時,經(jīng)激光照射,細(xì)胞向空間360°立體角的所有方向散射光線,其中前向散射光( FSC) 的強(qiáng)度與細(xì)胞大小有關(guān),而側(cè)向散射光(SSC) 的強(qiáng)度與質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部的折射率有關(guān)。細(xì)胞凋亡時,細(xì)胞固縮,體積變小,核碎裂形成,細(xì)胞內(nèi)顆粒往往增多,故凋亡細(xì)胞FSC 降低而SSC 增高。細(xì)胞壞死由于胞體腫脹,細(xì)胞核亦碎裂分解故FSC 和SCC 均增高。正常細(xì)胞FSC 高而SSC 低。根據(jù)光散射特性檢測凋亡細(xì)胞最主要的優(yōu)點是可以將光散射特性與細(xì)胞表面免疫熒光分析結(jié)合起來,用以區(qū)別辯認(rèn)經(jīng)這些特殊處理發(fā)生選擇凋亡的淋巴細(xì)胞亞型,也可用于活細(xì)胞分類。值得注意的是,根據(jù)FSC 和SSC 判斷凋亡細(xì)胞的可靠性受被測細(xì)胞形態(tài)上的均一性和核細(xì)胞漿比率影響很大,因此在某些淋巴細(xì)胞凋亡中,用光散射特性檢測凋亡的可靠性較好而在腫瘤細(xì)胞凋亡中其可靠性較差。
2 　細(xì)胞DNA 含量的測定
細(xì)胞凋亡時,核酸內(nèi)切酶激活,導(dǎo)致DNA 斷裂,這是凋亡的特征性表現(xiàn),也為FCM 鑒別凋亡細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。而檢測細(xì)胞凋亡DNA 斷裂的方法中,最常用、最簡便的就是細(xì)胞DNA 含量分析。當(dāng)細(xì)胞用乙醇、TrtionX—100 處理后細(xì)胞膜上出現(xiàn)漏洞,小片段DNA 從細(xì)胞內(nèi)釋放出來,使其DNA 含量低于正常細(xì)胞的二倍體。用碘化丙啶( PI) 染色后分析,可在二倍體C0/ G1 ,峰前出現(xiàn)“亞二倍體”峰,即細(xì)胞凋亡峰(APO峰) ,根據(jù)APO 峰可測出凋亡細(xì)胞百分率,該法簡單易行,可大批定量檢測凋亡標(biāo)本,亦可同時分析細(xì)胞的細(xì)胞周期位置。另外,應(yīng)用FCM 方法通過對DNA 和RNA 的聯(lián)合檢測可以鑒別出G0 期細(xì)胞,因此,可分析細(xì)胞凋亡與G1 或G0 細(xì)胸的關(guān)系。DNA 降解的程度取決于凋亡的階段、細(xì)胞的類型和凋亡誘發(fā)因子的特性。染色過程中DNA 的逸出量變化也影響FCM 檢測結(jié)果。據(jù)研究,將高濃度的磷酸鹽———枸椽酸鹽緩沖液加入漂洗液中,可增高降解DNA 的逸出量,從而提高鑒別凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞的能力。
DNA 含量測定在檢測細(xì)胞凋亡中的局限性在于其特異性和敏感性均不高。特異性不高是因為APO 峰代表了一組細(xì)胞群體,包括凋亡細(xì)胞、機(jī)械損傷細(xì)胞、低DNA 含量的細(xì)胞或不同染色體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞,在上述情況下,DNA 與熒光染料的結(jié)合量均小。另外,非固定的細(xì)胞在低滲溶液中被溶解時,可導(dǎo)致大量的核碎片出現(xiàn),此時APO 峰的細(xì)胞數(shù)目只代表了核碎片的數(shù)目,并不代表凋亡細(xì)胞數(shù)目。敏感性較差的原因是細(xì)胞凋亡早期只有DNA 斷裂點出現(xiàn),但尚未出現(xiàn)DNA 片段的大量丟失,所以該法不能檢出早期凋亡細(xì)胞和發(fā)生于S 期或G2/ M 期的凋亡細(xì)胞,因為其實際含量不低于二倍體細(xì)胞所含的DNA ,因此該法進(jìn)行凋亡細(xì)胞分析時應(yīng)結(jié)合其它形態(tài)或生化方法,以期更準(zhǔn)確地分析細(xì)胞的凋亡狀態(tài)。
3 　Y 啶橙染色法( Acridine Orange ,AO)
AO 可將細(xì)胞或細(xì)胞核中的雙鏈DNA 和變性DNA 染成不同顏色的熒光。AO 插入雙鏈DNA 中時,發(fā)綠色熒光;AO也可與單鏈或通過變性而產(chǎn)生的DNA 單鏈發(fā)生作用,這時發(fā)出紅色熒光,因此,通過FCM 檢測不同的熒光,可判斷凋亡的發(fā)生。在測定被標(biāo)準(zhǔn)化后,綠色和紅色熒光強(qiáng)度的量與總DNA 含量成比例,紅色熒光與總體細(xì)胞(紅色加綠色) 熒光的比率表示細(xì)胞中變性DNA 的比例,因此,這種方法可用于評價DNA 對原位變性的敏感性。有時候,凋亡細(xì)胞DNA 降解不明顯,依賴于DNA 降解來檢測細(xì)胞凋亡的方法如細(xì)胞DNA含量測定、DNA 末端標(biāo)記等就難以檢測到細(xì)胞凋亡變化。AO法檢測凋亡的原理不依賴于DNA 片斷的產(chǎn)生,因此其最主要的優(yōu)點是可應(yīng)用于寡核小體片段與凋亡不相平衡等情況,但AO 染色法不能有效區(qū)分有絲分裂細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。
4 　若丹明( Rh123) 染色法
細(xì)胞生活狀態(tài)下,胞膜上的鈉- 鉀泵、鈣泵等的作用,使細(xì)胞膜內(nèi)外維持著不同離子的濃度梯度,包括Na + , K+ ,Cl - ,Ca2 + 等,形成細(xì)胞膜電位。FCM 可以檢測親脂性離子熒光染料在胞膜內(nèi)外的分布,來測量膜電位的高低,以評價細(xì)胞的活力。Rh123 是一種親脂性陽離子熒光染料,對細(xì)胞膜具有通透性,線粒體膜尤敏感。細(xì)胞存活狀態(tài)時,若丹明123 通過細(xì)胞膜,積聚于線粒體發(fā)出綠色熒光。在細(xì)胞凋亡時,線粒體膜的轉(zhuǎn)運能力下降,電負(fù)性降低,故細(xì)胞線粒體積聚Rh123 的能力也喪失,熒光強(qiáng)度降低,據(jù)此檢測細(xì)胞的凋亡變化。但應(yīng)指出,在凋亡的早期階段,由于胞膜尚完整,大多數(shù)細(xì)胞器和細(xì)胞功能相對較好,因此,Rh123 法對于早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的鑒別比較困難。
5 　原位末端標(biāo)記技術(shù)
細(xì)胞凋亡時,DNA 斷裂早于形態(tài)學(xué)改變及DNA 含量減少,原位末端標(biāo)記( ISEL) 是將滲入到凋亡細(xì)胞中的外源性核苷酸在酶和DNA 的催化下與凋亡細(xì)胞因內(nèi)源性核酸酶的激活而產(chǎn)生的單股或雙股斷裂相結(jié)合,較前述方面具更高靈敏性。通常有兩種方法: ①DNA 聚合酶I 或klenow 大片段介導(dǎo)的單位缺口平移( INST) ; ②末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記( TUNEL) 。
INST 是利用DNA 多聚酶將核苷酸整合到凋亡細(xì)胞內(nèi)斷裂的DNA 處的3’末端,同時水解5’末端,以修復(fù)DNA ,若使用已標(biāo)記的核苷酸即可顯示出有斷裂DNA 的細(xì)胞。1993 年,Gorczyca 等提出了末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶( TdT) 標(biāo)記法采檢測凋亡細(xì)胞的DNA 斷裂,此種方法已得到廣泛應(yīng)用。由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活,細(xì)胞自身的染色質(zhì)或DNA 被切割,并產(chǎn)生與DNA 斷點數(shù)目相同的3’2 羥基末端, TdT 可以將生物素化的dUTP 標(biāo)記至3’2 羥基末端,通過卵白素2FITC 系統(tǒng),使DNA 的斷點部位發(fā)生特異熒光而簽別出凋亡細(xì)胞,TdT 末端標(biāo)記法是鑒別凋亡細(xì)胞比較特異的一種方法。腦組織中的凋亡細(xì)胞很少,因此基因組DNA 片斷需要更靈敏的檢測技術(shù)。將TUNEL 法與FCM 結(jié)合起來可以提高檢測凋亡細(xì)胞中DNA 片斷的靈敏度。經(jīng)凋亡誘導(dǎo)因子處理一定時間后的細(xì)胞,原位末端標(biāo)記的凋亡比Hoechst33342 染色顯示的要多,提示TUNEL 可檢測出尚未出現(xiàn)明顯凋亡形態(tài)學(xué)特征但已發(fā)生DNA 裂解的核,從而使檢測的靈敏度提高。對比研究表明, TUNEL 的敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ISNT ,尤其在APO早期TUNEL 法陽性率較高,可能是APO 發(fā)生時DNA 多數(shù)為雙鏈同時斷裂,單鏈少見的原因。后者是依賴DNA 多聚酶介導(dǎo)的修復(fù)反應(yīng),故ISNT 的陽性率相對較低。TUNEL 還可結(jié)合細(xì)胞同期的分析,可同時了解凋亡細(xì)胞DNA 斷裂和細(xì)胞周期分布之間的關(guān)系,近來已成為鑒別和定量凋亡細(xì)胞的最常用方法之一。但由于斷裂DNA 的標(biāo)記過程比較復(fù)雜,涉及多種因素,所以末端標(biāo)記的陰性結(jié)果并不一定代表DNA鏈的完整,應(yīng)排除方法上的問題,如TdT 酶活力的喪失等諸多影響因素。因此應(yīng)用TdT 末端標(biāo)記法鑒別凋亡細(xì)胞必須同時設(shè)陽性及陰性對照組,以便得到可靠結(jié)果。
6 　Annexin V/ PI 法
1992 年Fadok 報道在APO 早期位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserin ,PS) 遷移至細(xì)胞外側(cè),這一現(xiàn)象出現(xiàn)在核染色質(zhì)變性與核體積縮小之前。AnnexinV 是一種具有很強(qiáng)的抗凝血特性的血管蛋白,和磷脂有高親合力,尤其與帶負(fù)電荷的磷脂如PS 具極強(qiáng)的結(jié)合力,利用其特性可以檢測細(xì)胞凋亡。但壞死細(xì)胞PS 亦暴露于外表使Annexin V 結(jié)合陽性,因此使用Annexin V 這一參數(shù)不能區(qū)分壞死或凋亡,必須同時采用PI 這一參數(shù)將壞死細(xì)膽區(qū)分開來。FCM 通過Annexin V —FITC 標(biāo)志暴露于細(xì)胞膜上的PS 結(jié)合PI 進(jìn)入損傷細(xì)胞膜標(biāo)記降解DNA 分析凋亡與壞死細(xì)胞。在檢測時有4個亞群包括機(jī)械性損傷細(xì)胞(Annexin - / P1 + ) 、正常細(xì)胞(An2nexin - / PI - ) 、凋亡細(xì)胞(Annexin + / PI - ) 和繼發(fā)性壞死細(xì)胞(Annexin + / PI + ) 被區(qū)分。Boersma 等應(yīng)用Ampexin V2FITE染色法檢測細(xì)胞毒藥物處理后的中國倉鼠細(xì)胞凋亡變化,FCM 檢測發(fā)現(xiàn)熒光信號強(qiáng)弱不同的兩種細(xì)胞亞群。進(jìn)一步形態(tài)學(xué)等證實弱熒光細(xì)胞亞群代表早期凋亡細(xì)胞,強(qiáng)熒光亞群代表晚期凋亡細(xì)胞,可見其是檢測和定量凋亡細(xì)胞的一種較為可靠的方法。細(xì)胞凋亡時膜上PS 外露早于DNA 斷裂發(fā)生,因此該法檢測早期凋亡更為靈敏,且該法不需要固定細(xì)胞,避免了PI 法因固定造成的細(xì)胞碎片過多及TUNEL 法因固定出現(xiàn)的DNA 片段丟失,因此更加省時,結(jié)果亦更可靠,是目前最為理想的凋亡定量檢測方法。
7 　其　他
7.1 　ssDNA 單抗法　把抗單鏈DNA(ssDNA) 單克隆抗體用于細(xì)胞凋亡的檢測,是一種偶然發(fā)現(xiàn),因為在應(yīng)用ssDNA 單抗(熒光法) 檢測細(xì)胞毒性藥物誘導(dǎo)DNA 損傷中,觀察到凋亡的白血病細(xì)胞(MOL T24) 有較強(qiáng)的熒光,后來經(jīng)過適當(dāng)?shù)母倪M(jìn),證明ssDNA 單抗可以特異地識別凋亡細(xì)胞。與TUNEL法相比,ssDNA 具有更強(qiáng)的靈敏性。TUNEL 法檢測的凋亡細(xì)胞可能只是單抗法檢測的凋亡細(xì)胞中的一個亞類。ssDNA法檢測APO 一般用免疫熒光法。但也可和FCM 結(jié)合應(yīng)用。單抗法使用簡便、成本低、應(yīng)用廣泛。ssDNA 單抗可以區(qū)別壞死和凋亡、甚至能檢測前期凋亡,凋亡后壞亡和一些特殊的凋亡形式(如無片段化的細(xì)胞凋亡) 。因此, ssDNA 單抗法可望成為一種新的特異靈敏檢測細(xì)胞凋亡的方法。
7.2 　細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白分析　研究發(fā)現(xiàn),有不少基因參加凋亡調(diào)控,這些基因產(chǎn)物可參與促進(jìn)或抑制APO 的發(fā)生、發(fā)展,因此檢測凋亡調(diào)節(jié)基因蛋白對研究APO 及其調(diào)控有重要作用。迄今為止,已可對大量細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)基因的蛋白產(chǎn)物分析,如P53 蛋白、caspases、C2myc、Fas 抗原、TNF、bcl22 家族蛋白、cyclin、ras 等。FCM 用熒光標(biāo)記的各種調(diào)控蛋白單抗染色,收集不同波長的熒光信號,檢測細(xì)胞膜表面或細(xì)胞內(nèi)熒光分子數(shù)量,可以了解每個細(xì)胞的變化,而且所需樣品少,方法簡便、快捷、準(zhǔn)確。
8 　展　望
近幾年來,隨著FCM 技術(shù)的不斷發(fā)展和APO 研究的逐漸深入,FCM 在細(xì)胞凋亡研究中日益廣泛。應(yīng)用FCM 定量檢測凋亡細(xì)胞簡便、快速、客觀,并可進(jìn)行多參數(shù)檢測,因此,可同時對APO 及其相關(guān)的癌基因表達(dá)、細(xì)胞周期分布等諸多因素進(jìn)行相關(guān)分析,可以比較深入地了解凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制。盡管應(yīng)用FCM 進(jìn)行細(xì)胞凋亡研究的方法較多,但FCM檢測凋亡細(xì)胞的方法一般基于細(xì)胞凋亡過程中形態(tài)、生化等某一方面的特性,因而難于了解凋亡過程中發(fā)生的各種變化的相互關(guān)系,也使該類方法缺乏特異性,所以,聯(lián)合應(yīng)用多種針對不同特性的FCM 檢測方法,才能更為有效地鑒別凋亡細(xì)胞。同時,FCM 研究結(jié)果尚需同時結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察或生物化學(xué)方法,才能更加深入地了解凋亡細(xì)胞的生物學(xué)特性。隨著生物技術(shù)的發(fā)展及人們對APO 本質(zhì)認(rèn)識的深入,相信在不久的將來,定會有更為特異和敏感的方法問世,有助于細(xì)胞凋亡取得突破性進(jìn)展。

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