海洋微生物應用前景

海洋微生物應用前景

近20年來，有關海洋微生物產(chǎn)生新的生物活性的次級代謝產(chǎn)物的報道逐漸增多，海洋微生物作為活性物質(zhì)的新來源正日益為國內(nèi)外海洋研究工作者所重視。，已經(jīng)從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)了許多結(jié)構新穎的化合物，其中許多化合物具有較高的抗腫瘤活性。海洋放線菌是海洋細菌抗腫瘤活性物質(zhì)的重要來源，最先成為海洋微生物研究的熱點。來自國際最著名的海洋天然產(chǎn)物研究機構加州大學的Wfenical研究組從放線菌中分離鑒定出一系列結(jié)構新穎的化合物（Slinosporamides），些化合物具有很強的抗癌活性，如Slinosporamides(1)對HCT—116細胞的ED50為0．016ug/ml。從報道化合物的結(jié)構類型來看，有生物堿、環(huán)肽、聚醚類毒素、萜類等[9]。

近年來從海洋小單胞菌中發(fā)現(xiàn)了引人注目的抗腫瘤活性物質(zhì)，已引起人們的重視。Kosinostatin和異醌環(huán)素B[10]。是從海洋小單胞菌屬的培養(yǎng)液中分離得到的一類醌環(huán)類抗生素。日本Furumai等發(fā)現(xiàn)Kosinostatin對人的骨髓性白血病U937細胞有明顯的細胞毒性(ED50為0．09um/ml)，并對21種人類癌細胞具有抑制作用，IC50小于0．1um/ml。Francisco Romero研究組對印度洋海域的小單胞菌屬代謝產(chǎn)物進行了抗腫瘤活性篩選，得到了2抗腫瘤化合物Thiocoraline和IB—96212。其中IB—96212[11]是結(jié)構新穎的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，對P388細胞有極強細胞毒性(ED50＝0.0001mg/l)，對A549、HT29及MEl28細胞有明顯細胞毒性(ED50＝1mg/l)。

結(jié)合你所學到的環(huán)境微生物學方面的知識，談談對環(huán)境微生物學在環(huán)境科學和環(huán)境治理領域中的應用和發(fā)展前景

摘要：微生物在環(huán)境中充當著極其重要的角色，它在自然界的生態(tài)平衡和物質(zhì)循環(huán)中起著不可替代的作用。同時，在環(huán)境污染和治理方面，微生物也起著重要作用。環(huán)境微生物學的興起是微生物學與環(huán)境科學交叉發(fā)展的必然結(jié)果。它由普通微生物學發(fā)展起來的環(huán)境科學和環(huán)境工程的一門學科.它以普通微生物學為基礎，在研究微生物學一般規(guī)律的同時，著重微生物和環(huán)境之間互相作用的規(guī)律，微生物活動對環(huán)境和人類產(chǎn)生的有益和有害的影響以及在環(huán)境污染控制工程中有關的微生物原理的研究，是環(huán)境科學和環(huán)境工程的重要理論基礎。環(huán)境微生物學的內(nèi)容十分廣泛，而且該學科近年來的發(fā)展十分迅速，一些生物學的新技術手段被不斷應用到環(huán)境微生物學領域中。
關鍵詞:環(huán)境科學；環(huán)境工程；微生物學；環(huán)境微生物學
1 微生物學的發(fā)展簡史
微生物學是研究微生物及其生命活動的科學。微生物具有種類繁多、體積微小、比表面積大、代謝類型多、代謝強度高、生長繁殖速度快、容易變異、種類多等多種特點。它廣泛分布于空氣、水、土壤、人體及動植物體內(nèi)獨立或寄生生活。大多數(shù)微生物對人類和動植物是有益的，特別是它與人類的生活有密切的關系，對工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、人類的生活環(huán)境與健康衛(wèi)生有極大的影響[1]。
人類對微生物的利用甚早。我國在利用微生物方面，更有著豐富的經(jīng)驗和悠久的歷史。早在公元前3世紀，在《呂氏春秋》里就有“儀狄作酒禹飲而甘之”之說。在公元6世紀，后魏賈思勰所著的《齊民要術》一書中就詳細記載了制曲和釀酒的技術，還記載了栽種豆科植物可以肥沃土壤，當時雖不知根瘤菌的存在，也不知固氮作用，而會利用根瘤菌積累氮肥等等。
1676年，微生物學的先驅(qū)列文虎克用自制的單式顯微鏡首次觀察到了細菌的個體，為揭開微生物世界的奧秘打開了大門，具有劃時代的意義。在之后近200年的時間里，人們對微生物的研究僅停留在出于個人愛好對一些微生物進行形態(tài)描述的低級水平上，包括細菌、原生動物和真菌，但對它們的生理活動機理及其與人類實踐活動的關系卻未加研究，因此，微生物作為一門學科在當時還未形成。
在19世紀末和20世紀初微生物學被牢固地建立起來。法國的巴斯德和德國的科赫，分別被稱為微生物學的奠基人和細菌學的奠基人。巴斯德在研究釀酒生產(chǎn)中酒質(zhì)變酸的問題時，指出發(fā)酵是微生物的作用。巴斯德創(chuàng)立了培養(yǎng)基和玻璃器皿的滅菌方法及巴氏消毒，建立完成了稀釋和次代培養(yǎng)的無菌技術。為生物學的發(fā)展做出了突出的貢獻?？坪赵谂囵B(yǎng)細菌學的巨大貢獻是發(fā)明了用固體培養(yǎng)基的“細菌純培養(yǎng)法”和把混合培養(yǎng)物純化的技術，并用在固體培養(yǎng)基上劃線接種的方法獲得了單一的純種。這種技術使得培養(yǎng)細菌學發(fā)生革命性變化，并使得十九世紀最后二十年中這個學科得以開出絢麗的花朵。進入二十世紀，微生物學獲得了飛速的發(fā)展，研究重點逐漸轉(zhuǎn)移到了生化水平及分子生物學的水平上。工業(yè)微生物學與發(fā)酵工程、遺傳工程、細胞工程、酶工程和生物反應器工程一起組成了生物工程學這個當代高科技領域。
隨著社會經(jīng)濟發(fā)展的需要，人們不斷加強對微生物的研究，己形成了許多微生物學的分支學科。例如有普通微生物學、微生物生理學、微生物生態(tài)學、微生物遺傳學；有病毒學、細菌學、真菌學；還有土壤微生物學、海洋微生物學；再有醫(yī)學微生物學、工業(yè)微生物學、農(nóng)業(yè)微生物學、環(huán)境微生物學、石油微生物學等等，由此可見微生物學的發(fā)展無不體現(xiàn)著學科的交叉，特別是相關的細胞生物學，生物化學，遺傳學及分子生物學間的相互促進，由此推動整個生命科學的飛速發(fā)展。同時物理，化學，計算機技術及材料科學的發(fā)展，為微生物學的發(fā)展提供了必要的技術手段。所以，微生物學的發(fā)展歷史是輝煌的[2~4]。
2、環(huán)境微生物學的研究內(nèi)容
環(huán)境微生物學主要是介紹環(huán)境微生物學的發(fā)展和生物學基礎知識；在環(huán)境中存在的微生物主要種類和特點；微生物的生理和代謝，微生物生長和環(huán)境因子對微生物的影響；微生物的遺傳和變異，微生物的生態(tài)及其分布；在各種環(huán)境條件下微生物的存在和變化，微生物的代謝活動對環(huán)境的影響；微生物在自然界中的地位和作用，在生物地球化學循環(huán)中的作用；在環(huán)境領域中微生物所起的作用，微生物對污染物產(chǎn)生抗性的分子機理，以及對污染物降解的代謝途徑。
3、環(huán)境微生物學的發(fā)展
隨著人類的生活要求和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅速發(fā)展，大量人工合成的并難以被天然微生物迅速降解轉(zhuǎn)化的污染性化合物進入到自然環(huán)境中。嚴重威脅人類及其他生物正常生存發(fā)展。其中，普遍存在于土壤環(huán)境中的重要有機污染物如多環(huán)芳烴，農(nóng)藥類等，因其致癌性，致畸性，致突變性而被認為是危險物質(zhì)。分子生物學技術的應用為污染治理、防治提供了新的思路和方法[5] 。同時，污染導致資源環(huán)境中的生物重組，對環(huán)境中復雜的混合微生物群落進行及時監(jiān)控和準確鑒定變得越來越重要。而分子生物學技術因其快速、準確、靈敏的特點，正逐步取代某些傳統(tǒng)的研究方法而被廣泛用于環(huán)境微生物的監(jiān)測[6] 。
3.1與環(huán)境微生物研究相關的各種分子生物學技術
3.1.1核酸探針檢測技術
利用能與特定核苷酸序列發(fā)生特異性互補的已知核苷酸片段作探針分析DNA序列及片段長度多態(tài)性。被標記(放射性或非放射性的)的探針以原位雜交、Southern印跡雜交、斑點印跡和狹線印跡雜交等不同的方法，可直接用來探測溶液中、細胞組織內(nèi)或固定在膜上的同源核酸序列。由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的高度靈敏性，使得核酸分子雜交技術廣泛應用于對環(huán)境中微生物的檢測，定性、定量分析它們的存在、分布、豐度和適應性等研究目標。
熒光原位雜交(FISH)是目前單個細胞水平上分析微生物群落結(jié)構的常用分子生態(tài)學方法。目前可利用FISH的方法，使用一整套特異的寡核苷酸探針可進行單個細胞的快速分類[7~8]。流式細胞計(FCM)是另一種能快速分析和分類單細胞群體的技術。適用于對有關微生物群落的組成和動態(tài)進行快速和頻繁的監(jiān)測。RFLP標記基于Southern印跡雜交的技術，即DNA限制片段長度多態(tài)性，是在生物多樣性研究中廣泛應用的DNA分子標記?？勺鳛橐环N能高度靈敏檢測污染環(huán)境下微生物種群變化的方法。
3.1.2 PCR及相關技術
PCR是一種體外擴增核酸序列從而得到多個核酸拷貝的技術。根據(jù)擴增的模板，引物序列來源及反應條件的不同可將PCR技術分為以下幾種：(1)反轉(zhuǎn)錄PCR技術是在mRNA反轉(zhuǎn)錄之后進行的PCR擴增，可以用來分析不同生長時期的mRNA表達狀態(tài)的相關性。(2)競爭PCR是一種定量PCR，通過向PCR反應體系中加入人工構建的帶有突變的競爭模板、控制競爭模板的濃度來確定目的模板的濃度，對目的模板作定量研究。競爭性PCR曾被用來測定受多環(huán)芳烴污染的沉降物中的編碼鄰基二酚-2，3-加雙氧酶的dmpB基因濃度[9]。(3)擴增的rDNA限制酶切分析技術，是美國最新發(fā)展起來的一項現(xiàn)代生物鑒定技術，它根據(jù)原核生物rDNA序列的保守性，將擴增的rDNA片段進行酶切。然后通過酶切圖譜來分析菌間的多樣性。
3.1.3電泳分離及顯示方法
除我們熟知的瓊脂糖凝膠電泳并用溴乙錠(EB)染色方法和聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE分離)銀染的方法外，還有一些通過特殊的電泳分離技術而建立的分子標記。如變性梯度凝膠電泳、溫度梯度凝膠電泳、單鏈構象多態(tài)性等，都是通過實施一些變性條件改變DNA雙螺旋結(jié)構(如添加線性梯度的變性劑或建立變性溫度梯度等)，由于序列不同的DNA片段，其部分解鏈程度也不同，不同的結(jié)構對DNA在凝膠中遷移速率影響很大，結(jié)果不同序列的DNA片段在凝膠上得以高分辨率的分離。
3.1.4 基因重組技術
利用DNA體外重組或擴增技術從供體生物基因組中分離感興趣的基因或DNA片段，或經(jīng)人工合成的方法獲得基因，然后經(jīng)一系列切割，加工修飾，連接反應產(chǎn)生重組DNA分子，再將其轉(zhuǎn)入適當?shù)氖荏w細胞，以期獲得基因表達的過程。此技術用于環(huán)境微生物的研究可構建出各種生物降解特性增強的重組菌用于污染環(huán)境的治理修復或發(fā)酵某些廢棄物生產(chǎn)天然氣。如將微生物分解纖維素和木質(zhì)素的基因轉(zhuǎn)入到中溫細菌中，使發(fā)酵能在較高溫度下進行，提高轉(zhuǎn)化速度，用于蔗糖發(fā)酵生產(chǎn)天然氣[10] 。
3.1.5 基因芯片技術
基因芯片技術作為生物芯片技術一個發(fā)展最完備的分支，基因芯片可以分為cDNA芯片和寡核苷酸芯片cDNA芯片有多種制備方法，在基因表達相關研究方面具有重大價值;寡核苷酸芯片主要應用于雜交測序、單核苷酸多態(tài)性分析和突變檢測?；蛐酒?，又稱DNA微陣列，是指按照預定位置固定在固相載體上很小面積內(nèi)的千萬個核酸分子所組成的微點陣陣列。在一定條件下，載體上的核酸分子可以與來自樣品的序列互補的核酸片段雜交。如果把樣品中的核酸片段進行標記，在專用的芯片閱讀儀上就可以檢測到雜交信號。cDNA芯片即在玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等固相載體上固定的成千上萬個cDNA分子組成cDNA微陣列。
3.2 分子生物學技術在環(huán)境微生物研究中的應用
3.2.1重組細菌用于環(huán)境污染防治
Pseudomonas sp.P2是一株甲酰磷降解菌，羅如新等人(1999)[11]克隆了氯苯降解菌L1的鄰苯二酚1,2-雙加氧酶基因，在表達載體PKT230攜帶下轉(zhuǎn)入了P2菌中，使P2獲得高效的鄰苯二酚1,2-雙加氧酶酶活，該酶活性甚至比天然宿主還高21倍。
植物根際是一個有潛力的污染降解地點，在植物根際由植物供給能被微生物利用的營養(yǎng)物質(zhì)使微生物繁殖，最終進行污染物的消除。在外來微生物中表達與脫毒有關的酶類也能在實地應用中提供專一選擇優(yōu)勢。該例利用了小麥根際微生物對土壤中的三氯乙烯(TCE)脫毒。D.C.yec等人(1998)[12]將洋蔥伯克霍爾德菌G4的甲苯鄰單加氧酶基因轉(zhuǎn)入熒光假單子孢菌2-79中后，熒光假單孢菌比小麥根際其它菌長得好。
3.2.2 胞內(nèi)酶在細胞表面表達更好發(fā)揮生物降解功能
當有重金屬存在時，較高等植物可產(chǎn)生相應的金屬硫蛋白(MTs)。MTs是含半胱氨酸豐富的蛋白質(zhì)，能結(jié)合鎘、鉻、汞和銅等重金屬離子。在E.coli中表達MTs是一項有希望的技術，但細胞內(nèi)的MTs對金屬離子的吸附能力有限。解決這一困難的一條途徑是在細胞表面表達MTs，據(jù)報道把MTs插入LamB序列的153位點而證實了這一可能性[13]，雜合蛋白的表達提高了對鎘的結(jié)合力達15~20倍，由于MTs定位于細胞表面，即使細胞死亡，仍可用于金屬的吸附和積累。有機磷廣泛用于農(nóng)業(yè)制造殺蟲劑，由土壤微生物中分離到的有機磷水解酶(OPH)能有效降解這些殺蟲劑。但OPH純化所需的成本高，而用完整的細胞脫毒受到轉(zhuǎn)運有機磷通過細胞膜屏障的限制。在細胞表面表達0PH的完整細胞降解磷!硫和Paraoxon比在細胞內(nèi)表達OPH的細胞快幾倍[14]。得到的酶活定位于細胞表面的生物催化劑比純化的0PH明顯更穩(wěn)定，也更活躍。
3.2.2 分子生物學技術在環(huán)境微生物監(jiān)測中的應用
環(huán)境中存在的大量微生物中，僅有1%可通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法在培養(yǎng)皿上進行培養(yǎng)和進一步分離，而絕大多數(shù)細菌要求非常嚴格的營養(yǎng)條件或是難以培養(yǎng) [15] PCR技術及衍生出的一系列生物技術，使得在復雜環(huán)境中對那些混合物內(nèi)低含量的群體成員或生物群中某個特異基因的檢測與研究成為可能。
Fantroussi等人[16]用嵌套式PCR(nestedPCR)來監(jiān)測未被污染的土壤淤泥實驗生態(tài)系中3-氯苯脫氯細菌的外源基因的種類。Selvaratnam等人[17]用編碼苯酚單加氧酶的dmpN基因的PCR擴增來檢測處理廢水的分批式反應器中的降解酚的假單胞桿菌。PCR技術還與其它方法結(jié)合應用于環(huán)境監(jiān)測中。Chandler等人[18]用MPN/PCR技術來估測被燃料污染的土壤中的萘過氧化物酶基因nahAc、鏈烷單加氧酶基因alkB及dmpB的數(shù)量。PCR技術與核酸雜交技術結(jié)合，用來進一步檢測PCR擴增產(chǎn)物，核實被擴增的序列即目的序列。
環(huán)境微生物監(jiān)測環(huán)境中微生物的研究難點是常常無法準確定性和直接定量地檢測環(huán)境中可能存在的眾多微生物種群?；蛐酒夹g的出現(xiàn)和發(fā)展為微生物學領域的研究者提供了高效快捷的技術方法，為科研迅速向縱深化發(fā)展提供了可能[19]。一些作為分子標記的基因工程菌也應用到環(huán)境生物技術中，主要用來監(jiān)測投放到環(huán)境中的微生物的情況。許多學者對細菌中的熒光基因(luxgene)進行克隆，轉(zhuǎn)移到具有分解能力的特種微生物體內(nèi)，具有分解能力的菌體中就有了特定的熒光標記，通過對熒光菌和熒光量的監(jiān)測可以達到對專門細菌的跟蹤，并可以了解到它們與其它菌株之間在分解過程中的關系[20]。
3.2.3 分子生物技術在環(huán)境基因工程菌的穩(wěn)定性和安全性研究中的應用
對轉(zhuǎn)基因生物的環(huán)境安全問題需進行長期的系統(tǒng)的研究，因風險的出現(xiàn)有長期滯后性。在關于被引入遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性和新的遺傳物質(zhì)是否轉(zhuǎn)移到其他微生物中，通過生物的表型可初步判斷，進一步的證實則可以利用DNA序列分析，探針雜交等。關于生物圍堵，目的是加強對重組微生物的行為和命運的可預見性。生物圍堵系統(tǒng)可以是被動的，如對菌株引入培養(yǎng)缺陷型，recA-等突變；或是主動的系統(tǒng)，指向細胞中引入誘導細胞死亡的自殺基因。化學誘導自殺作為生物圍堵的基本原理，其策略是將殺傷功能與生物降解途徑的調(diào)節(jié)系統(tǒng)相聯(lián)系，細胞在非生物物質(zhì)存在時存活(自殺基因被遏制)，但非生物物質(zhì)完全降解后，自殺基因開啟，細胞死亡。
隨分子生物學技術的發(fā)展和對環(huán)境微生物研究的深入，分子生物學技術在環(huán)境微生物中的應用越來越廣泛也越來越重要。分子生物學技術的應用不僅擴大了環(huán)境微生物研究的廣度而且加大了研究的深度。隨著越來越多微生物全部基因序列的解碼，對各種細菌體內(nèi)降解基因的分布和表達會有更深入的了解，這方面技術的成熟必將對環(huán)境微生物的研究有一個整體的系統(tǒng)的生態(tài)水平上的認識，必將使研究更具目標性，應用更具可控性[21]。

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