中藥基因功能調(diào)控獲突破(二十一世紀(jì)基因技術(shù)的幾個重大突破)

中藥基因功能調(diào)控獲突破

最近，一項(xiàng)關(guān)于“中藥與基因功能調(diào)控的研究”取得初步成果，引起了有關(guān)方面的關(guān)注。

據(jù)中新社報(bào)道，開展該項(xiàng)研究的北京朝陽安苑中醫(yī)醫(yī)院院長種連進(jìn)稱，目前人類發(fā)現(xiàn)和證實(shí)的分子生物學(xué)最主要的功能，在于它可以調(diào)節(jié)和關(guān)閉基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的各種高級生命活動，而某些中藥具有類似的功能。1987年，他提出中藥具有人體器官再造功能的假設(shè)，并藉此研制出治療糖尿病的藥物----愈消散。其后，他帶領(lǐng)研究組赴美國斯坦福大學(xué)進(jìn)行基因領(lǐng)域的研究，證實(shí)愈消散對2型糖尿病和胰島素依賴型糖尿病均有明顯效果，現(xiàn)時已在十多個國家上市。

中藥具雙向調(diào)節(jié)作用

種氏的研究發(fā)現(xiàn)，中藥具有雙向調(diào)節(jié)作用，而西藥雖然作用明確和見效快，但作用單一。例如，治療血壓病的藥物只能降壓或升壓，不能同時又升又降；但同一種中藥卻可以對血壓高的人降壓、對血壓低的人升壓。他認(rèn)為，這對解決人類“基因功能調(diào)控”的問題至關(guān)重要。

減少患者盲目用藥

他又說，采用能夠作用于疾病基因靶點(diǎn)的天然植物活性蛋白化合物，對糖尿病進(jìn)行對癥治療研究，可有效地修正病理細(xì)胞蛋白結(jié)構(gòu)，增殖生理結(jié)構(gòu)細(xì)胞，恢復(fù)器官生理功能。醫(yī)生可以根據(jù)病人的不同情況，預(yù)見治療效果，縮短病程，減少患者盲目用藥。他強(qiáng)調(diào)，中國是中藥的發(fā)祥地，故應(yīng)該讓古老的中藥與最前沿的基因?qū)W說成功結(jié)合，對世界醫(yī)學(xué)作出貢獻(xiàn)。

二十一世紀(jì)基因技術(shù)的幾個重大突破

1生物多樣性

自然界蘊(yùn)藏著巨大的微生物資源，但是人類至今對極端環(huán)境微生物(extremophiles)和未培養(yǎng)微生物(unculturable microorganisms)兩個資源寶庫涉足不深，所以研究開發(fā)潛力極大。

可以預(yù)期，人們能從嗜酸、嗜堿、嗜冷、嗜熱、嗜鹽、嗜壓等等極端微生物中獲得許多有價值的酶、蛋白質(zhì)以及其他活性物質(zhì)。在過去幾年中，隨著重組酶生產(chǎn)技術(shù)的開發(fā)，使人們有可能從更廣泛的來源獲取更廉價的酶。近年在這方面取得的進(jìn)展在一定程度上得益于極端微生物培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，更得益于把極端微生物的基因轉(zhuǎn)移到常用受體微生物宿主能力的提高。如此一來，人們有理由相信：在溫和、便宜的生長條件下就可以生產(chǎn)出對極端環(huán)境具有耐受性能的生物催化劑來。

另外據(jù)知，能夠在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的微生物的種類僅占自然界中微生物總數(shù)的不到1％!也就是說，還有99％的不可培養(yǎng)的微生物等待著我們用非常規(guī)手段加以研究。作為微生物資源研究和開發(fā)領(lǐng)域里的一個重大探索，可以采用最新的分子生物學(xué)方法，繞過菌種分離純化這一步驟，直接在自然界中尋找有開發(fā)價值的微生物基因。把來源于未經(jīng)培養(yǎng)的微生物的DNA克隆到業(yè)經(jīng)培養(yǎng)馴化的宿主生物體中，然后用高通量篩選技術(shù)從重組的克隆里篩選為新酶編碼的基因。

微生物世界展示給人類如此巨大的機(jī)會使我們興奮不已，一些有識之士指出：未知的微生物世界或許是地球上最大的未開發(fā)的自然資源，能充分利用這個微生物資源寶庫的國家必將取得發(fā)展的先機(jī)。

2．2基因組測序

隨著DNA測序能力的提高，對序列的分析能力也得到加強(qiáng)，于是可以發(fā)現(xiàn)許多新的基因。通過同已知基因序列進(jìn)行比較來推斷新基因表達(dá)產(chǎn)物的基本酶活性。當(dāng)然目前的技術(shù)水平還不足以推斷出這些酶性質(zhì)的許多細(xì)節(jié)。因此必須表達(dá)這些新發(fā)現(xiàn)的基因，以確定它們在一個特定的過程中是否確實(shí)有用。假定，從一種生物體來源的所有的酶在它的正常生長溫度下都有功能，那么來自超級嗜熱微生物的DNA序列就能成為尋找在沸點(diǎn)附近仍然有功能的酶的合理起點(diǎn)；同樣可以認(rèn)為，嗜冷微生物的基因則可能成為在零度仍然具有功能的酶的可能來源。

因特網(wǎng)最新資料表明：大約60種微生物的基因組序列已經(jīng)完成，另外還有近200種微生物基因組預(yù)期很快就可以完成。測序工作的努力已經(jīng)揭示了數(shù)萬個新基因，主要的是編碼酶的一些基因，其中大約三分之一可以被歸到“有功能”的家族里，這是一個十分豐富、而且每天都在增加的新工業(yè)酶后選者的來源。相信隨著基因組時代的到來，將會有大量新的工業(yè)酶被人類發(fā)現(xiàn)。

2．3定向性進(jìn)化

在以發(fā)現(xiàn)工業(yè)酶為主要目標(biāo)的所有技術(shù)中，定向進(jìn)化(directed evolution簡稱DE)可能是最強(qiáng)有力的一種。DE是一種快速而廉價的發(fā)現(xiàn)各種新酶的方法。這類新酶在特定的條件下應(yīng)該比天然酶工作得更好。DE模擬自然進(jìn)化，這種進(jìn)化取決于從多樣性群體中選擇合適“個體”，這里的“個體”就是酶。DE是定向的，意思是研究者通過一步步改進(jìn)使選擇的各種酶要符合一定預(yù)期的標(biāo)準(zhǔn)。DE從克隆擬改進(jìn)的酶的基因起始。分離到的基因通過體外突變使其多樣性得到加強(qiáng)。然后，克隆這些突變株的DNA，并且在通常的受體中表達(dá)，分析表達(dá)產(chǎn)物的酶活力，選擇最好的變異株克隆。它的基因又作為下一輪篩選的新起點(diǎn)。使用這一方法需要掌握兩項(xiàng)重要的支撐技術(shù)，即DNA重排(DNA shaffling)和高通量篩選技術(shù)。

2．4噬菌體展示

該技術(shù)最初是用于鑒定和分離蛋白質(zhì)的一些結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠牢固地結(jié)合到別的分子上。但是近年這個核心技術(shù)又經(jīng)過進(jìn)一步設(shè)計(jì)和發(fā)展，致使擬被改良的酶在理論上也可充當(dāng)被鑒定和分離的靶子。噬菌體展示最簡單的形式涉及把小段靶子DNA，(該DNA應(yīng)該是突變和篩選的靶子)插入噬菌體的基因組中，其插入位置要求其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域能夠出現(xiàn)在噬菌體顆粒的表面上。靶子基因的突變導(dǎo)致各種不同的結(jié)構(gòu)域在表面上展示，如果各種不同的結(jié)構(gòu)域的任何一個能足夠牢固地結(jié)合到一種固定化底物上，則編碼這個結(jié)構(gòu)域的顆粒便粘到這一固定相上，借以把它們從未結(jié)合的結(jié)構(gòu)域分開。然后把結(jié)合的噬菌體從固定化的底物上洗脫下來，收集之，增殖之。重復(fù)這一過程則可以增加獲得具有優(yōu)良品質(zhì)酶的幾率。

3兩個實(shí)例

以下結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的研究工作舉兩個實(shí)例。一個是酶制劑L—天冬酰胺酶；另一個是氨基酸，L—天冬酸。這兩個例子在我們討論的生物技術(shù)第三個浪潮這個主題下有一定的代表性。

3．1L-天冬酰胺酶

作為抗白血病首選藥物的L—天冬酰胺酶早就用大腸桿菌發(fā)酵的方法生產(chǎn)，但是生產(chǎn)和應(yīng)用至少存在兩個問題。一個問題是細(xì)胞形成酶的能力很低；另一個問題是酶在體內(nèi)半衰期短。這兩個問題的存在導(dǎo)致藥物生產(chǎn)成本過高，加大了患者的負(fù)擔(dān)。

本實(shí)驗(yàn)室借助基因工程技術(shù)提高了酶合成能力，首先從大腸桿菌獲得編碼該酶的基因，體外重組之后再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌體內(nèi)，不同的是強(qiáng)化了上游調(diào)控元件，便大大提高了酶合成能力40多倍!

本實(shí)驗(yàn)室解決半衰期短和穩(wěn)定性差的策略是制備L—天冬酰胺酶—抗體的融合蛋白。首先從噬菌體抗體庫中篩選得到L—天冬酰胺酶(ASNase)的保護(hù)性抗體scFv46，然后構(gòu)建融合蛋白scFv-ASNase及ASNase—scFv。穩(wěn)定性測定結(jié)果表明：這兩種融合蛋白比天然ASNase的抗蛋白酶降解的能力強(qiáng)，并將天然ASNase的體外半衰期由2小時分別提高到9小時和6小時，另外，二者對高溫及低pH條件都具有較強(qiáng)的抗性。通過計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，預(yù)測了融合蛋白ASNase—scFv及scFv—ASNase的三維結(jié)構(gòu)，并與報(bào)道的天然ASNase的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析。通過結(jié)構(gòu)分析并結(jié)合上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出scFv的保護(hù)機(jī)制是scFv的空間阻礙效應(yīng)(如封閉蛋白酶作用位點(diǎn))與改變酶分子靜電勢表面的綜合作用結(jié)果。

借助完全基因組序列信息進(jìn)一步提高L—天冬酰胺酶的穩(wěn)定性的新嘗試。通過近年中國科學(xué)院一個科學(xué)家小組的不懈努力，完成了一種極端嗜熱微生物長達(dá)2689443 bp全部基因組的測序研究工作。為進(jìn)一步提高L—天冬酰胺酶的穩(wěn)定性并延長該藥的體內(nèi)半衰期，我們在這方面作出了的新努力，即試圖借助完全基因組序列信息，從一株極端嗜熱微生物中尋找穩(wěn)定性更好的L—天冬酰胺酶。

本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)測知E．coli L—天冬酰胺酶的氨基酸序列及為其編碼的基因核苷酸序列。在上述極端嗜熱微生物的完全基因組序列數(shù)據(jù)庫中搜尋E．coli L—天冬酰胺酶的結(jié)構(gòu)類似物，結(jié)果在No．967號基因編碼的蛋白質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)了一個一級結(jié)構(gòu)與L—天冬酰胺酶十分相似的蛋白質(zhì)。其中35％(115／323)的氨基酸完全一樣，另有52％(171／323)的氨基酸相似。因此，有理由相信在這株極端嗜熱微生物中很有可能存在一個與E．coli L—天冬酰胺酶有類似功能的蛋白質(zhì)。又鑒于該基因來自極端嗜熱微生物，預(yù)期這個蛋白質(zhì)還將會具有更好的熱穩(wěn)定性。當(dāng)然，一切結(jié)論將留待通過對該基因的克隆、表達(dá)、產(chǎn)物的分離和功能分析的結(jié)果予以最后的證實(shí)或澄清。

3．2L—天冬酸

通常的生產(chǎn)方法是用富含L—天冬酸酶的微生物細(xì)胞，經(jīng)過固定化處理后，將底物反丁烯二酸轉(zhuǎn)化為L—天冬酸。本實(shí)驗(yàn)室早期也曾作過一些工作并且投入生產(chǎn)應(yīng)用。在2000年柏林生物技術(shù)大會上得知，日本一個公司采取一系列改進(jìn)措施，使生產(chǎn)工藝水平大大提升了一步。首先為解決酶合成能力低下問題，也是采用基因工程技術(shù)，提高合成能力50倍；固定化酶的通透性問題因采用離子交換性質(zhì)的材料而得以解決；反應(yīng)熱—反應(yīng)器設(shè)計(jì)及降低反應(yīng)溫度，從37℃降低到20℃；消除了污染環(huán)境的副產(chǎn)物硫酸銨，代之以能重復(fù)使用的反丁烯二酸銨；正在開辟L—天冬酸的新用途，用于制造多聚L—天冬酸酶。這個經(jīng)過改進(jìn)的新工藝既是先進(jìn)的、高效的，又是綠色的、環(huán)保的。使這一產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝幾乎達(dá)到盡善盡美的地步，代表了21世紀(jì)傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)改造的方向。

4產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)

我們正處在這樣一個時代：社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展所遇到的一些重大障礙有待工業(yè)生物技術(shù)去解決；科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展形成了一批先進(jìn)的技術(shù)平臺；許許多多實(shí)例說明生物技術(shù)的第三個浪潮正在向我們走來。我們相信：在這第三個浪潮中，中國和世界工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)將會發(fā)生巨大的變化。

上世紀(jì)工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)格局大體上包括抗生素、維生素、氨基酸、有機(jī)酸、(醋酸、乳酸、檸檬酸、衣康酸、蘋果酸、葡萄糖酸等)、酶制劑、單細(xì)胞蛋白、溶劑(丙酮、丁醇)、乙醇、核酸、核苷酸等等。傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的全面技術(shù)改造：向高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效、資源節(jié)約、環(huán)境友好型過度，還肯定誕生一批新產(chǎn)業(yè)，包括生物材料產(chǎn)業(yè)、生物能源產(chǎn)業(yè)、生物化工產(chǎn)業(yè)及環(huán)境生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)等等。

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