流行性感冒如何診斷

流行性感冒如何診斷

流行性感冒的診斷可根據(jù)以下四點確定：

(1)接觸史及集體發(fā)病史 短期內(nèi)有較多患者出現(xiàn)感冒癥狀體征；

(2)典型癥狀和體征 流行性感冒發(fā)病較急，全身癥狀較重，病人持續(xù)高熱，體溫高達(dá)40℃，肌肉關(guān)節(jié)酸痛，而鼻塞、流涕、咽痛等癥狀出現(xiàn)較遲；

(3)流行特征 流行性感冒發(fā)生突然，傳播迅速，同時有明顯的地區(qū)性流行；

(4)實驗室檢查

血常規(guī)檢查：白細(xì)胞總數(shù)降低，嗜酸性粒細(xì)胞消失，淋巴細(xì)胞相對增加。如合并細(xì)菌感染，則白細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞偏高。

病毒分離：早期可獲得70%的陽性結(jié)果，一般于發(fā)病第七日即不能再獲得陽性結(jié)果。

免疫熒光技術(shù)：取患者鼻洗液中粘膜上皮細(xì)胞的涂片標(biāo)本，或?qū)⒀适航臃N于細(xì)胞培養(yǎng)管內(nèi)，應(yīng)用熒光抗體技術(shù)加以檢測，結(jié)果出現(xiàn)快，靈敏性高，有助于早期診斷。

血清學(xué)檢查：紅細(xì)胞凝集抑制試驗及補體結(jié)合試驗。血凝抑制試驗的特異性較高，而補體結(jié)合試驗的靈敏性較高。這些方法僅作為病后回顧性診斷，不適于快速診斷。

流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則的診斷標(biāo)準(zhǔn)

流行病學(xué)史
在流行季節(jié)一個單位或地區(qū)同時出現(xiàn)大量上呼吸道感染病人；或近期內(nèi)該地區(qū)或鄰近地區(qū)上呼吸道感染病人明顯增多；或醫(yī)院門診上呼吸道感染病人明顯增多。
病原學(xué)診斷方法
A1 病毒分離
從疑似流感病人呼吸道采集標(biāo)本分離病原體。
A2 標(biāo)本的收集和處理
A2.1 標(biāo)本收集時間應(yīng)于發(fā)病早期（1～3d內(nèi)）越早越好。
A2.2 標(biāo)本收集方法常用棉拭子擦抹法或咽喉漱洗法。棉拭子擦抹法用于采集兒童標(biāo)本，采集時將滅菌棉拭子稍沾標(biāo)本收集液（pH7.2～7.6含20%～40%滅菌肉湯的生理鹽水或Hanks液或生理鹽水），反復(fù)擦拭患者咽部數(shù)次，然后將此棉拭子放進(jìn)裝有上述收集液的試管中塞上棉塞。咽喉洗漱法用于采集成人標(biāo)本，采集時先讓患者咳嗽，然后用10mL左右的收集液反復(fù)洗漱咽喉部約1min，吐入管內(nèi)。如有條件，兒童標(biāo)本用負(fù)壓抽吸法抽取鼻咽分泌物，成人標(biāo)本用鼻咽洗液，可提高分離的陽性率。標(biāo)本采集后置冰壺（4℃）中盡快送實驗室。
A2.3 標(biāo)本的處理：用毛細(xì)吸管反復(fù)吹打標(biāo)本液（如為咽拭子標(biāo)本，先反復(fù)擠壓咽拭子后棄之），將粘液打散，于4℃靜置5～10min，待自然沉淀后取3mL上清，按每毫升加青霉素1000單位和鏈霉素1000μg，混勻置4℃處理2～4h即可接種。如標(biāo)本污染較重，可置4℃過夜處理。如預(yù)計標(biāo)本在48h內(nèi)不能完成接種時，應(yīng)將標(biāo)本置低溫（最好-70℃）保存。
A3 接種及培養(yǎng)法
最常用雞胚培養(yǎng)法和組織培養(yǎng)法，有條件的亦可同時用兩種方法進(jìn)行病毒分離。
A3.1 雞胚培養(yǎng)法：取9～11日齡雞胚，將處理過的標(biāo)本液經(jīng)羊膜腔和尿囊腔各接種0.2mL，每份標(biāo)本接種3～4只胚，置33～35℃溫箱培養(yǎng)3d，然后將雞胚放置4℃冰箱過夜（或置—20℃冰箱1h再置4℃數(shù)小時）可分別收獲尿液和羊水，并作初步血凝（其方法是用毛細(xì)吸管取1～2滴尿液或羊水，置大孔塑料板內(nèi)，再加入1～2滴1%雞紅細(xì)胞，搖勻后置室溫或4℃30～45min觀察結(jié)果，根據(jù)血球凝集程度的不同可分為++++、+++、++、+、±、－），如血凝為+++～++++時，再按系列倍比稀釋測定其血凝滴度，如具有一定血凝滴度即可鑒定。如血凝陰性，可盲傳2代，如仍為陰性則棄之。
A3.2 組織培養(yǎng)法：用0.2mL處理過的標(biāo)本液接種于長成單層的原代人胚腎（或猴腎或地鼠腎），或狗腎傳代細(xì)胞（Madin Darby Canine Kidney，MDCK），每份標(biāo)本接種4管，置37℃吸附1～2h后棄標(biāo)本液，再加入每毫升含2μg胰酶的199維持液1mL，于33℃培養(yǎng)7～10d，并逐日觀察病變。從第三天開始每隔一天用0.4%雞或豚鼠紅細(xì)胞對培養(yǎng)管做紅細(xì)胞吸附試驗（試驗前無菌法收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液），如陰性則用已收獲的上清液盲目傳代，如陽性則測定上清液的血凝滴度。如標(biāo)本第1代紅細(xì)胞吸附試驗陰性，可用收獲的全部上清液混合進(jìn)行盲傳2代，仍為陰性則棄之。
A4 新分離株的鑒定
新分離流感病毒可用血凝抑制、補體結(jié)合、中和以及血細(xì)胞吸附抑制等試驗方法進(jìn)行鑒定。最常用和最簡單的方法是血凝抑制試驗，必要時采用補體結(jié)合試驗。
A4.1 血凝抑制試驗：用當(dāng)前流行的甲3、甲1及乙型流感病毒代表株的免疫血清與新分離流感病毒做血凝抑制試驗，觀察新分離株能否被免疫血清所抑制。血凝抑制試驗方法見附錄B。
A4.2 紅細(xì)胞吸附抑制試驗：取紅細(xì)胞吸附試驗陽性的組織培養(yǎng)管和正常細(xì)胞對照管，用Hanks液洗細(xì)胞2次，加入經(jīng)霍亂濾液（RDE）處理（1∶10）的免疫血清0.2mL，再加入Hanks0.6mL，室溫作用30min后，再加入0.4%雞（或豚鼠）紅細(xì)胞0.2mL，置室溫30min后于普通光學(xué)顯微鏡下觀察有無血球吸附。如果血細(xì)胞吸附被所用免疫血清所抑制，表明所分離的病毒與所用免疫血清型別相一致或接近。
A4.3 補體結(jié)合試驗：如果用已知的甲型（甲3、甲1）或乙型或丙型流感病毒免疫血清對新分離病毒的血凝均不能抑制，則應(yīng)考慮可能為甲型流感病毒的新亞型，可用針對甲型、乙型流感病毒核蛋白的免疫血清作補體結(jié)合試驗定型。
血清學(xué)診斷方法
B1 血凝抑制試驗方法
B1.1 原理
一些動物紅細(xì)胞（如雞、豚鼠等）以及人“O”型血紅細(xì)胞上有流感病毒受體，遇流感病毒可產(chǎn)生紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，簡稱血凝。若將特異性抗體與流感病毒（血凝素）預(yù)先作用后再加入紅細(xì)胞則不產(chǎn)生凝集，稱為血凝抑制現(xiàn)象。用定量血凝素與不同稀釋度血清抗體作用后，能完全抑制血凝的最高稀釋度，即為血凝抑制抗體效價。
B1.2 主要材料
大孔塑料板，1mL吸管或1mL移液器。
B1.3 雙份血清收集及處理
急性期血清于發(fā)病3d內(nèi)采取，恢復(fù)期血清于發(fā)病后2～4周采取。取0.1mL已分離的血清加入0.9（或0.4）mL霍亂濾液（RDE）（即1∶10或1∶5稀釋）搖勻，于37℃水浴中過夜，以去除血清中的非特異性抑制素，次日置56℃水浴50min以滅活多余的RDE。
B1.4 流感病毒血凝素制備
流感病毒接種雞胚后48h收獲的尿囊液，加入1/10000硫柳汞防腐。為了延遲尿鹽沉淀可先用無菌生理鹽水做等量稀釋，置4℃?zhèn)溆谩?br>B1.5 雞紅細(xì)胞懸液的制備
從靜脈或心臟抽取正常健康雞血，保存于阿氏（Alsevr's）液中，置4℃保存。用前以生理鹽水洗3次，末次經(jīng)2000r/min離心10min，將紅細(xì)胞用生理鹽水配成1%濃度。
B1.6 血凝素滴定
將流感病毒血凝素在大孔塑料板內(nèi)用生理鹽水從1∶5開始做系列倍比稀釋，每孔0.25mL再加入等量1%雞紅細(xì)胞，搖勻，置室溫或4℃30～45min后觀察結(jié)果，以出現(xiàn)十十血凝的血凝素最高稀釋度為其血凝效價，即為1個血凝單位，實驗時采用4個血凝素單位，例如血凝素效價為1∶320，為1個單位，4個單位即為1∶80稀釋。正式實驗前經(jīng)校對取4個血凝單位用于實驗。
B1.7 血凝抑制試驗步驟
B1.7.1 將上述已處理的待檢血清（1∶10或1∶5）再用生理鹽水做系列倍比稀釋，每孔加0.25mL。
B1.7.2 加入等量已配好的4個單位血凝素。
B1.7.3 每孔加入0.25mL 1%雞紅細(xì)胞，搖勻置室溫或4℃30～45min。
B1.8 結(jié)果觀察
觀察結(jié)果時將血凝板傾斜數(shù)十秒鐘，待陰性孔內(nèi)紅細(xì)胞自由下滑呈淚滴狀時讀結(jié)果。以出現(xiàn)完全抑制的血清最高稀釋度的倒數(shù)為抗體的效價。在檢測患者雙份血清時需在同一次試驗中進(jìn)行，并以恢復(fù)期血清抗體效價較急性期抗體效價升高4倍或4倍以上為陽性。
B2 型特異性補體結(jié)合試驗
B2.1 原理
甲、乙、丙三個型流感病毒各具有特異的可溶性抗原（核蛋白抗原），甲型流感病毒各亞型均具有相同的可溶性抗原，與乙型或丙型的可溶性抗原完全不同，因此可利用補體結(jié)合試驗來區(qū)別它們。當(dāng)流感病毒出現(xiàn)很大的變異或出現(xiàn)新亞型而引起大流行時，由于來不及充分掌握新分離毒株的性狀，常需同時采用補體結(jié)合試驗和血凝抑制試驗對新毒株進(jìn)行血清學(xué)診斷。
B2.2 型特異免疫血清制備
B2.2.1 免疫用抗原
甲型為PR8株和乙型為Lee株均為小鼠適應(yīng)株。于乙醚麻醉下鼻腔感染12～16g小鼠，每鼠0.05mL，待感染后3～5d大部分小鼠發(fā)病、部分死亡時，解剖小鼠。取肺研磨并用生理鹽水制成10%的懸液，低速離心去除粗塊，取上清鼠肺懸液即為免疫用抗原。
B2.2.2 免疫血清制備
選體重300～500g的健康豚鼠，免前采血3～5mL，分離血清分裝凍存留作對照。豚鼠用乙醚輕度麻醉，鼻腔滴入上述鼠肺懸液抗原0.5mL，共免疫3～4次，每次間隔一周，在末次免疫的同時，由腹腔注射鼠肺懸液2mL，一周后試血，如果對同型尿膜抗原的血清效價超過1∶80，而與異型抗原無交叉反應(yīng)，立即采血分離血清分裝凍存于低溫（-20℃以下）。試驗前血清于56℃水浴滅活30min。
B2.3 可溶性抗原的制備
用甲、乙型流感病毒或新分離病毒按常規(guī)接種和收獲尿囊液，如尿液血凝在1∶40以上時，收獲其尿囊膜，將尿囊膜用鹽水洗一次，用無菌剪刀將膜剪成數(shù)小塊放入試管中，每個雞胚的尿囊膜加1mL無菌生理鹽水，凍化三次，末次化后以3000r/min離心15min，吸出上清即為可溶性抗原，加入1∶10000的硫柳汞防腐，置4℃冰箱至少可用一個月。
B2.4 雙份血清采集
收集病人急性期（發(fā)病3d內(nèi)）和恢復(fù)期（發(fā)病10～30d后）的血清。血清于試驗前56℃30min滅活。
B2.5 1%綿羊紅細(xì)胞懸液制備、溶血素、補體的制備和滴定按常規(guī)方法。
B2.6 補體結(jié)合試驗步驟
按常規(guī)進(jìn)行。
B2.7 結(jié)果判定
B2.7.1 被檢病毒尿膜抗原與甲型（或乙型）流感病毒免疫血清呈陽性反應(yīng)則可診斷為甲型（或乙型）流感病毒，如甲、乙均為陰性時，應(yīng)考慮丙型流感病毒或其他病毒。
B2.7.2 雙份血清對甲型（或乙型）抗原有4倍或4倍以上升高，即可診斷為甲型（或乙型）流感病毒感染。
B2.7.3 正常人群補體結(jié)合抗體滴度一般在1∶16以下，如單份恢復(fù)期血清抗體在1∶32以上時，結(jié)合臨床癥狀可作診斷的參考。
B2.7.4 人群血清抗體水平調(diào)查中，補體結(jié)合抗體在1∶32以上者可作為新近感染流感的證據(jù)。
B3 神經(jīng)氨酸酶抑制試驗
B3.1 原理
胎球蛋白（Fetuin）底物經(jīng)流感病毒的神經(jīng)氨酸酶作用后，使N乙酰神經(jīng)氨酸游離出來，經(jīng)過碘酸鹽的氧化作用將N乙酰神經(jīng)氨酸轉(zhuǎn)化為β－甲醛內(nèi)酮酸，后者經(jīng)硫代巴比妥酸作用形成生色團(tuán)，用有機溶劑提取生色團(tuán)，并在分光光度計上比色。利用上述反應(yīng)可測知流感病毒的神經(jīng)氨酸酶活性，反應(yīng)的顏色越深酶活性越強。并可選擇用于神經(jīng)氨酸酶抑制試驗的標(biāo)準(zhǔn)劑量。神經(jīng)氨酸酶抑制試驗是將標(biāo)化好劑量的神經(jīng)氨酸酶(即一定稀釋度的流感病毒尿囊液）和系列稀釋的被檢血清和正常血清起孵育，測知血清作用于神經(jīng)氨酸酶活性的抑制效價，并計算出血清的神經(jīng)氨酸酶抑制滴度。
B3.2 器材及試劑
B3.2.1 小試管、10mL吸管及分光光度計等。
B3.2.2 磷酸緩沖液（PBS pH5.9）及生理鹽水。
B3.2.3 胎球蛋白底物液：450～500mg冰凍干燥的胎球蛋白加蒸餾水10mL，溶解后置4℃保存，每周新配。
B3.2.4 過碘酸鈉溶液：稱4.8g過碘酸鈉（NaIO（下標(biāo)始）4（下標(biāo)終)）溶于38mL蒸餾水中，加62mL正磷酸（濃），充分混合，置于棕色磨口瓶中，室溫保存。
B3.2.5 砷試劑：稱10g砷酸鈉（NaAsO（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終））和7.1g無水硫酸鈉溶于100mL蒸餾水中，加0.3mL濃硫酸，置于帶玻璃塞的瓶中，置4℃保存。
B3.2.6 硫代巴比妥酸試劑：稱1.2g硫代巴比妥酸和14.2g無水硫酸鈉加入200mL蒸餾水中，在煮沸的水浴中加熱溶解，每周新配。
B3.2.7 酸化丁醇試劑：于100mL正丁醇中加入5mL濃鹽酸，置棕色帶玻璃塞的瓶中，室溫保存。
B3.3 神經(jīng)氨酸酶活性測定
B3.3.1 病毒用生理鹽水做系列倍比稀釋（1∶2～1∶32）分裝小試管，每管0.1mL。標(biāo)準(zhǔn)病毒和未知病毒的神經(jīng)氨酸酶應(yīng)在同一試驗中測定。
B3.3.2 每管補充加入0.1mL生理鹽水，再加入0.1mL用pH5.9 PBS配制的胎球蛋白底物，對照管用鹽水代替病毒，充分混合后置37℃水浴作用18h。
B3.3.3 從水浴中取出試管在室溫冷卻，每管加入0.1mL的過碘酸鹽試劑，充分混合，室溫靜置20min（時間要準(zhǔn)）。
B3.3.4 每管加入1mL砷試劑，由于碘的釋放出現(xiàn)棕色，搖動試管待棕色消失。
B3.3.5 每管加入2.5mL硫代巴比妥試劑，并充分混合（該試劑需在煮沸溶解后加入），用棉塞將管口堵緊。
B3.3.6 立刻將試管置于煮沸的水浴中，煮沸10min，可見紅色出現(xiàn)，即為神經(jīng)氨酸酶活性的表現(xiàn)，顏色越深酶活性越高。
B3.3.7 將試管置冰水中冷卻后去掉棉塞，加入4mL丁醇試劑，換上干凈橡皮塞，用手劇烈搖動試管，提取顏色使其轉(zhuǎn)到有機物（丁醇）相。
B3.3.8 以1500r/min離心5～10min使丁醇層清亮透明，小心地吸出上層的丁醇，放入干凈的試管中待檢。
B3.3.9 將上述受檢樣品由高稀釋度到低稀釋度依次傾入透光池中，其中第一個透光池加入無病毒的對照管液，將分光光度計波長調(diào)至549nm，將對照管調(diào)至零，然后依次讀取每個稀釋度樣品的光密度。
B3.3.10 酶單位的計算：酶活性測定時光密度為0.45～0.85的病毒稀釋度作為一個酶單位。
B3.4 神經(jīng)氨酸酶抑制試驗
B3.4.1 按上述方法測定酶活性，選用1個酶單位的病毒稀釋度（即酶活性測定時光密度為0.45～0.85的病毒稀釋度），每管加入0.1mL。
B3.4.2 受檢血清做系列倍比稀釋，每管病毒加入不同稀釋度血清0.1mL，血清對照管是以最低稀釋度血清加生理鹽水代替病毒，37℃水浴作用1h。以同法做正常血清對照組。
B3.4.3 每管加入pH5.9 PBS配制的胎球蛋白0.1mL，充分搖勻，置37℃水浴中孵育18h。
B3.4.4 自水浴中取出試管，按B3.3.3.～B3.3.7逐步加入前述各種試劑。
B3.4.5 測定光密度時應(yīng)從低稀釋度血清管至高稀釋度血清管，檢測方法同B3.3.9。
B3.5 神經(jīng)氨酸酶抑制抗體滴度的計算法
B3.5.1 根據(jù)抗血清和正常血清兩組試驗的實驗結(jié)果，求得每組血清同一稀釋度的光密度之商數(shù)，即為經(jīng)血清作用后所余之酶活性的百分?jǐn)?shù)。血清稀釋度越高，殘留的酶活性也越高，找出50%酶活性前后兩個血清稀釋度及其相應(yīng)的酶活性百分?jǐn)?shù)，按公式計算出血清神經(jīng)氨酸酶抑制抗體滴度。
B3.5.2 計算公式
式中：A——血清神經(jīng)氨酸酶抑制抗體效價倒數(shù)；
B（下標(biāo)始）1（下標(biāo)終）——酶活性高于50%的血清稀釋度倒數(shù)；
B（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終）——酶活性低于50%的血清稀釋度倒數(shù)；
C（下標(biāo)始）1（下標(biāo)終）——高于50%的酶活性的百分?jǐn)?shù)；
C（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終）——低于50%的酶活性的百分?jǐn)?shù)；
50——常數(shù)。
B3.5.3 計算舉例
先計算血清作用后的酶活性：
然后將對數(shù)稀釋度換算為幾何稀釋度：例如10（上標(biāo)始）－3（上標(biāo)終）換算為1/1000，10（上標(biāo)始）－3.5（上標(biāo)終）換算為1/3200。最后代入公式：
此抗血清的神經(jīng)氨酸酶抑制效價為1∶1440。
流感快速診斷方法
C1 直接檢查呼吸道脫落上皮細(xì)胞內(nèi)抗原
C1.1 原理
由于流感病毒的主要感染部位是在呼吸道上皮細(xì)胞，因此在病人呼吸道標(biāo)本的脫落細(xì)胞中含有流感病毒抗原，通過直接檢查脫落上皮細(xì)胞內(nèi)抗原即可診斷。檢查方法可采用免疫熒光法，一般于3～4h內(nèi)即可完成，而且可以直接定型。
C1.2 標(biāo)本的收集和制片
兒童標(biāo)本最好采用負(fù)壓抽吸法收集呼吸道分泌物，成人標(biāo)本最好采用鼻咽洗液?？蓪⒚糠輼?biāo)本分為兩份，一份低溫凍存?zhèn)渥鞑《痉蛛x，一份用pH7.2磷酸緩沖液（PBS），將粘液吹打散，1500r/min離心15min去除上清，細(xì)胞沉淀用PBS洗1～2次，末次離心后棄上清，加入適量pH7.2 PBS使細(xì)胞重懸，滴加于帶圈的玻璃片上，自然干燥，冷丙酮固定10min。
C1.3 間接免疫熒光法
C1.3.1 用10%新鮮羊或牛血清封閉標(biāo)本片，置濕盒中于37℃30min。
C1.3.2 分別加入適當(dāng)稀釋度的抗甲型和乙型流感型特異性單克隆抗體，置濕盒中于37℃放置1h。在PBS中洗兩次，共10min。
C1.3.3 加適當(dāng)稀釋度的兔抗鼠熒光素結(jié)合物置37℃1h。在PBS中洗三次，共10min，末次用蒸餾水過一下。
C1.3.4 于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，觀察到三個以上胞漿內(nèi)或胞核內(nèi)熒光陽性細(xì)胞即可判為陽性。
C2 標(biāo)本經(jīng)敏感細(xì)胞增殖1代后查抗原
C2.1 原理
病人呼吸道標(biāo)本經(jīng)接種敏感細(xì)胞（狗腎傳代細(xì)胞MDCK）增殖1～3d后，將細(xì)胞消化分散制成抗原片，再用免疫熒光法或免疫酶染法檢查細(xì)胞內(nèi)抗原。由于標(biāo)本中的病毒在敏感細(xì)胞增殖后查抗原，能明顯提高其診斷的敏感性，可在細(xì)胞病變出現(xiàn)以前查到抗原，可以直接定型，而且比常規(guī)雞胚分離病毒法要快得多，一般24～72h即可診斷。檢查方法可采用間接免疫酶染法（C2.5）或間接免疫熒光法（C2.4）
C2.2 標(biāo)本的收集及處理
兒童標(biāo)本可采用咽拭子，最好采用負(fù)壓抽吸法；成人標(biāo)本可采用咽漱液，最好采用鼻咽洗液。標(biāo)本按附錄A（標(biāo)準(zhǔn)的附錄）中A2.3方法處理。
C2.3 標(biāo)本的接種培養(yǎng)及制片
取處理過的標(biāo)本液0.2mL接種于長成單層的MDCK細(xì)胞，每份標(biāo)本接種3管，置37℃吸附1～2h后棄去標(biāo)本液，加入每毫升含2μg胰酶的199維持液至1mL，于35℃培養(yǎng)24、48和72h分別取出1管，收集上清備用，將細(xì)胞用消化液（1份0.25%胰酶+4份Versene）消化下來，用PBS洗一次，然后滴加于帶圈的玻璃片上，自然干燥，冷丙酮固定。同法制備未經(jīng)感染的正常MDCK細(xì)胞片即為正常對照細(xì)胞。
C2.4 間接免疫熒光法
C2.4.1 加單克隆抗體同C1.3.2。
C2.4.2 加兔抗鼠熒光素結(jié)合物同C1.3.3。
C2.4.3 于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，觀察到胞漿內(nèi)或胞核內(nèi)熒光，而正常細(xì)胞片未見熒光，即可判定為陽性。
C2.5 間接免疫酶染法
C2.5.1 加單克隆抗體同C1.3.2。
C2.5.2 加適當(dāng)稀釋度的羊抗鼠酶標(biāo)結(jié)合物，濕盒中置37℃1h，用PBS洗兩次10min。
C2.5.3 加鄰苯二胺底物液，其配制方法為：4mg鄰苯二胺+10mLpH5.0磷酸－檸檬酸緩沖液+15μL雙氧水。pH5.0磷酸緩沖液的配制方法為：先分別配制0.1mol/L檸檬酸（C（下標(biāo)始）6(下標(biāo)終）H（下標(biāo)始）8（下標(biāo)終）O（下標(biāo)始）7（下標(biāo)終）·H（下標(biāo)始)2（下標(biāo)終）O）（21g/1000mL）和0.1mol/L磷酸氫二鈉（Na（下標(biāo)始）2（下標(biāo)終）HPO（下標(biāo)始）4（下標(biāo)終））（28.4g/1000mL），分別按24.3mL和25.7mL混合后，再加入等量（50mL）雙蒸水混合即為pH5.0磷酸鹽－檸檬酸緩沖液。加入底物液3～5min即可觀察結(jié)果。
C2.5.4 于倒置顯微鏡下觀察結(jié)果（觀察結(jié)果時，細(xì)胞要濕，如果細(xì)胞已干，可以加入一滴自來水），觀察到棕紅色深染細(xì)胞，根據(jù)觀察到的深染細(xì)胞多少記錄為++++、+++、++、+、±、－。以觀察到+以上深染細(xì)胞判為陽性；有時可觀察到單個深染細(xì)胞被無色或淡紅色細(xì)胞所包圍，而正常細(xì)胞對照呈無色或淡紅色，亦可判為陽性。

如何區(qū)分寶寶是感冒還是流感了？有什么好的辦法？

是否出現(xiàn)發(fā)熱發(fā)熱程度和發(fā)熱持續(xù)時間以及全身癥狀和上呼吸道癥狀發(fā)病的持續(xù)時間來進(jìn)行判斷。普通感冒來說比較常見是鼻病毒或者冠狀病毒所引起，它的季節(jié)性不是十分明顯，孩子可以不發(fā)熱，或者僅為輕中度發(fā)熱，發(fā)熱持續(xù)1到2天，沒有或者有輕微的全身癥狀，普通感冒則既可以由病毒引起，比如鼻病毒，合胞病毒等呼吸道病毒，也可以由支原體，細(xì)菌引起，流感和感冒都是呼吸道傳染性疾病。

流感傳染性強，容易引起暴發(fā)流行或大流行，尤其甲型流感常造成暴發(fā)流行，乙型流感也常導(dǎo)致小規(guī)模的流行，與流感相比，普通感冒一般不會引起規(guī)模流行，流感與普通感冒的癥狀差別比較大。

流感一般起病急驟，突然發(fā)熱，體溫在數(shù)小時至24小時內(nèi)升達(dá)高峰，39到40℃甚至更高，且服用退熱劑后退熱效果差，呈稽留高熱狀態(tài)，普通感冒主要表現(xiàn)為發(fā)，咳嗽，流涕，發(fā)熱時間一般2到3天或不發(fā)熱，熱度一般不高，隨后4到5天的咳嗽。

流感可通過快速診斷方法診斷，取鼻咽分泌物送檢，約10到15分鐘即可得到結(jié)果，普通感冒病原多，很難做出具體的病原學(xué)診斷，嬰幼兒流感的臨床癥狀往往不典型，可出現(xiàn)高熱驚厥，普通感冒很少有發(fā)熱或僅為低熱，中度熱，無寒顫，很少有全身癥狀和并發(fā)癥。

流感病情重，病程長，普通感冒局部癥狀突出，常表現(xiàn)為噴嚏，流鼻涕，鼻塞，咳嗽等，全身癥狀如頭痛、發(fā)熱癥狀比較輕，流行性感冒鑒別是由于流感的表現(xiàn)與普通感冒及上呼吸道感染十分相似，無十分明顯的特征，因此最初發(fā)生的病例不易診斷，診斷時應(yīng)加以鑒別。

流行性感冒要點

?最近流感爆發(fā)，疾控又開始緊張，開始各種培訓(xùn)，提高大家意識，也算是記錄培訓(xùn)筆記了。

流行性感冒

? ? ?(以下簡稱流感)是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病,在世界范圍內(nèi)引起暴發(fā)和流行。流感起病急,雖然大多為自限性,但部分因出現(xiàn)肺炎等并發(fā)癥可發(fā)展至重癥流感,少數(shù)重癥病例病情進(jìn)展快,可因急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和/或多臟器衰竭而死亡。重癥流感主要發(fā)生在老年人、年幼兒童、孕產(chǎn)婦或有慢性基礎(chǔ)疾病者等高危人群,亦可發(fā)生在一般人群。

? ? ? 2017年入冬以來,我國南北方省份流感活動水平上升較快,當(dāng)前處于冬季流感流行高峰水平。全國流感監(jiān)測結(jié)果顯示,流感樣病例就診百分比和流感病毒檢測陽性率均顯著高于過去三年同期水平,流感活動水平仍呈現(xiàn)上升態(tài)勢,本次冬季流感活動強度要強于往年。

? ? ? 為進(jìn)一步規(guī)范和加強流感的臨床管理,減少重癥流感發(fā)生、降低病死率,在《甲型H1N1流感診療方案(2009年第三版)》和《流行性感冒診斷與治療指南(2011年版)》的基礎(chǔ)上,結(jié)合近期國內(nèi)外研究成果及我國既往流感診療經(jīng)驗,制定本診療方案。

1、病原學(xué)

? ? 流感病毒屬于正粘病毒科,為RNA病毒。根據(jù)核蛋白和基質(zhì)蛋白分為甲、乙、丙、丁四型。

? ? 目前感染人的主要是甲型流感病毒中的H1N1、H3N2亞型及乙型流感病毒中的Victoria和Yamagata系。

? ? 流感病毒對乙醇、碘伏、碘酊等常用消毒劑敏感;對紫外線和熱敏感,56℃條件下30分鐘可滅活。

2、流行病學(xué)

(一)傳染源

? ?流感患者和隱性感染者是流感的主要傳染源。從潛伏期末到急性期都有傳染性。受感染動物也可成為傳染源,人感染來源動物的流感病例在近距離密切接觸可發(fā)生有限傳播。

? ?病毒在人呼吸道分泌物中一般持續(xù)排毒3-6天,嬰幼兒、免疫功能受損患者排毒時間可超過1周,人感染H5N1/H7N9病例排毒可達(dá)1~ 3周。

(二)傳播途徑

? ?流感主要通過打噴嚏和咳嗽等飛沫傳播,也可經(jīng)口腔、鼻腔、眼睛等黏膜直接或間接接觸傳播。接觸被病毒污染的物品也可引起感染。人感染禽流感主要是通過直接接觸受感染的動物或受污染的環(huán)境而獲得。

(三)易感人群

? ? 人群普遍易感。接種流感疫苗可有效預(yù)防相應(yīng)亞型的流感病毒感染。

(四)重癥病例的高危人群

? ?下列人群感染流感病毒,較易發(fā)展為重癥病例,應(yīng)給予高度重視,盡早(發(fā)病48小時內(nèi))給予抗病毒藥物治療,進(jìn)行流感病毒核酸檢測及其他必要檢查。

1.年齡<5歲的兒童(年齡<2歲更易發(fā)生嚴(yán)重并發(fā)癥);

2.年齡≥65歲的老年人;

3.伴有以下疾病或狀況者:慢性呼吸系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病(高血壓除外)、腎病、肝病、血液系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)肌肉疾病、代謝及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、免疫功能抑制(包括應(yīng)用免疫抑制劑或HIV感染等致免疫功能低下);

4.肥胖者[體重指數(shù)(body mass index,BMI)大于30,BMI=體重(kg)/身高 (m) 2];

5.妊娠期婦女。

3、發(fā)病機制及病理

(一)發(fā)病機制

? ? 甲、乙型流感病毒通過HA結(jié)合呼吸道上皮細(xì)胞含有唾液酸受體的細(xì)胞表面啟動感染。流感病毒通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,病毒基因組在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。復(fù)制出大量新的子代病毒顆粒。流感病毒感染人體后,可以誘發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴,導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng),出現(xiàn)ARDS、休克及多臟器功能衰竭。

(二)病理改變

? ?病理變化主要表現(xiàn)為呼吸道纖毛上皮細(xì)胞呈簇狀脫落、上皮細(xì)胞化生、固有層粘膜細(xì)胞充血、水腫伴單核細(xì)胞浸潤等病理變化。重癥肺炎可發(fā)生彌漫性肺泡損害。合并腦病時出現(xiàn)腦組織彌漫性充血、水腫、壞死。合并心臟損害時出現(xiàn)心肌細(xì)胞腫脹、間質(zhì)出血,淋巴細(xì)胞浸潤、壞死等炎癥反應(yīng)。

4、臨床表現(xiàn)和實驗室檢查

?潛伏期一般為1-7天,多為2-4天。

(一)臨床表現(xiàn)

? ?主要表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌痛和全身不適起病,體溫可達(dá)39-40℃,可有畏寒、寒戰(zhàn),多伴全身肌肉關(guān)節(jié)酸痛、乏力、食欲減退等全身癥狀,常有咽喉痛、干咳,可有鼻塞、流涕、胸骨后不適等。顏面潮紅,眼結(jié)膜充血。部分以嘔吐、腹痛、腹瀉為特點,常見于感染乙型流感的兒童。

? ? 無并發(fā)癥者病程呈自限性,多于發(fā)病3-4天后體溫逐漸消退,全身癥狀好轉(zhuǎn),但咳嗽、體力恢復(fù)常需1-2周。

(二)并發(fā)癥

? ?肺炎是流感最常見的并發(fā)癥,其他并發(fā)癥有神經(jīng)系統(tǒng)損傷、心臟損害、肌炎、橫紋肌溶解綜合征和膿毒性休克等。

(三)實驗室檢查

1.外周血常規(guī):白細(xì)胞總數(shù)一般不高或降低,重癥病例淋巴細(xì)胞計數(shù)明顯降低。

2.血生化:部分病例出現(xiàn)低鉀血癥,少數(shù)病例肌酸激酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、肌酐等升高。

3.病原學(xué)相關(guān)檢查:

(1)病毒核酸檢測:以RT-PCR(最好采用real-time RT-PCR)法檢測呼吸道標(biāo)本(咽拭子、鼻拭子、鼻咽或氣管抽取物、痰)中的流感病毒核酸。病毒核酸檢測的特異性和敏感性最好,且能區(qū)分病毒類型和亞型。(2)病毒抗原檢測(快速診斷試劑檢測):快速抗原檢測方法可采用膠體金和免疫熒光法。由于快速抗原檢測的敏感性低于核酸檢測,因此對快速抗原檢測結(jié)果的解釋應(yīng)結(jié)合患者流行病史和臨床癥狀綜 合考慮。

(3)血清學(xué)檢測:檢測流感病毒特異性IgM和IgG抗體水平。動態(tài)檢測的IgG抗體水平恢復(fù)期比急性期有4倍或以上升高有回顧性診斷意義。

(4)病毒分離培養(yǎng):從呼吸道標(biāo)本中分離出流感病毒。在流感流行季節(jié),流感樣病例快速抗原診斷和免疫熒光法檢測陰性的患者建議也作病毒分離。

(四)影像學(xué)表現(xiàn)并發(fā)肺炎者影像學(xué)檢查可見肺內(nèi)斑片狀、磨玻璃影、多葉段滲出性病灶;進(jìn)展迅速者,可發(fā)展為雙肺彌漫的滲出性病變或?qū)嵶?個別病例可見胸腔積液。

兒童病例肺內(nèi)片狀影出現(xiàn)較早,多發(fā)及散在分布多見,易出現(xiàn)過度充氣,影像學(xué)表現(xiàn)變化快,病情進(jìn)展時病灶擴(kuò)大融合,可出現(xiàn)氣胸、縱隔氣腫等征象。

5、診斷

診斷主要結(jié)合流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)和病原學(xué)檢查。

(一)臨床診斷病例

出現(xiàn)上述流感臨床表現(xiàn),有流行病學(xué)證據(jù)或流感快速抗原檢測陽性,且排除其他引起流感樣癥狀的疾病。

(二)確定診斷病例

有上述流感臨床表現(xiàn),具有以下一種或以上病原學(xué)檢測結(jié)果陽性:

1.流感病毒核酸檢測陽性(可采用real-time RT-PCR和RT-PCR 方法)。

2.流感病毒分離培養(yǎng)陽性。

3.急性期和恢復(fù)期雙份血清的流感病毒特異性IgG抗體水平呈4倍或4倍以上升高。

6、重癥與危重病例

(一)出現(xiàn)以下情況之一者為重癥病例

1.持續(xù)高熱>3天,伴有劇烈咳嗽,咳膿痰、血痰,或胸痛;

2.呼吸頻率快,呼吸困難,口唇紫紺;3.神志改變:反應(yīng)遲鈍、嗜睡、躁動、驚厥等;

4.嚴(yán)重嘔吐、腹瀉,出現(xiàn)脫水表現(xiàn);

5.合并肺炎;

6.原有基礎(chǔ)疾病明顯加重。

(二)出現(xiàn)以下情況之一者為危重病例

1.呼吸衰竭;

2.急性壞死性腦病;

3.膿毒性休克;

4.多臟器功能不全;

5.出現(xiàn)其他需進(jìn)行監(jiān)護(hù)治療的嚴(yán)重臨床情況。

7、鑒別診斷

(一)普通感冒

流感的全身癥狀比普通感冒重;追蹤流行病學(xué)史有助于鑒別;普 通感冒的流感病原學(xué)檢測陰性,或可找到相應(yīng)的感染病原證據(jù)。

(二)其他類型上呼吸道感染

包括急性咽炎、扁桃體炎、鼻炎和鼻竇炎。感染與癥狀主要限于相應(yīng)部位。局部分泌物流感病原學(xué)檢查陰性。

(三)其他下呼吸道感染

流感有咳嗽癥狀或合并氣管-支氣管炎時需與急性氣管-支氣管炎相鑒別;合并肺炎時需要與其他肺炎,包括細(xì)菌性肺炎、衣原體肺炎、支原體肺炎、病毒性肺炎、真菌性肺炎、肺結(jié)核等相鑒別。根據(jù)臨床特征可作出初步判斷,病原學(xué)檢查可資確診。

8、治療

(一)基本原則

1.對臨床診斷病例和確診病例應(yīng)盡早隔離治療。

2.住院治療標(biāo)準(zhǔn)(滿足下列標(biāo)準(zhǔn)1條或1條以上):

(1)妊娠中晚期婦女。

(2)基礎(chǔ)疾病明顯加重,如:慢性阻塞性肺疾病、糖尿病、慢性心功能不全、慢性腎功能不全、肝硬化等。

(3)符合重癥或危重流感診斷標(biāo)準(zhǔn)。

(4)伴有器官功能障礙。

3.非住院患者居家隔離,保持房間通風(fēng)。充分休息,多飲水,飲食應(yīng)當(dāng)易于消化和富有營養(yǎng)。密切觀察病情變化,尤其是兒童和老年患者。

4.流感病毒感染高危人群容易引發(fā)重癥流感,盡早抗病毒治療可 減輕流感癥狀,縮短流感病程,降低重癥流感的病死率。

5.避免盲目或不恰當(dāng)使用抗菌藥物。僅在流感繼發(fā)細(xì)菌性肺炎、中耳炎和鼻竇炎等時才有使用抗生素的指征。

6.兒童忌用阿司匹林或含阿司匹林藥物以及其他水楊酸制劑。

(二)對癥治療

高熱者可進(jìn)行物理降溫,或應(yīng)用解熱藥物?？人钥忍祰?yán)重者給予止咳祛痰藥物。根據(jù)缺氧程度可采用鼻導(dǎo)管、開放面罩及儲氧面罩進(jìn)行氧療。

(三)抗病毒治療

抗流感病毒治療時機

發(fā)病48h內(nèi)進(jìn)行抗病毒治療可減少流感并發(fā)癥、降低住院患者的病死率、縮短住院時間,發(fā)病時間超過48h的重癥患者依然能從抗病毒治療中獲益。

重癥流感高危人群及重癥患者,應(yīng)盡早(發(fā)病48h內(nèi))給予抗流感病毒治療,不必等待病毒檢測結(jié)果;如果發(fā)病時間超過48h,癥狀無改善或呈惡化傾向時也應(yīng)進(jìn)行抗流感病毒治療。無重癥流感高危因素的患者,發(fā)病時間不足48h,為縮短病程、減少并發(fā)癥也可以抗病毒治療。

2.抗流感病毒藥物

神經(jīng)氨酸酶抑制劑(NAI)對甲型、乙型流感均有效。

(1)奧司他韋:成人劑量每次75mg,每日2次,療程5天,重癥病例劑量可加倍,療程可延長。腎功能不全者要根據(jù)腎功能調(diào)整劑 量。1歲及以上年齡的兒童應(yīng)根據(jù)體重給藥:體重不足15Kg者,予30mg每日2次;體重15~23Kg者,予45mg每日2次;體重23~40Kg 者,予60mg每日2次;體重大于40Kg者,予75mg每日2次。對于吞咽膠囊有困難的兒童,可選用奧司他韋顆粒劑。對用藥過程中無效或病情加重的患者,要注意是否出現(xiàn)耐藥。

(2)扎那米韋:適用于于成人及7歲以上青少年,用法:每日2次,間隔12小時;每次10mg(分兩次吸入)。但吸入劑不建議用于重癥或有并發(fā)癥的患者。

(3)帕拉米韋:成人用量為300~600mg,小于30d新生兒6mg/kg, 31-90d嬰兒8mg/kg,91d-17歲兒童10mg/kg,靜脈滴注,每日1次, 1~5天,重癥病例療程可適當(dāng)延長。目前臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)有限,應(yīng)嚴(yán)密觀察不良反應(yīng)。

離子通道M2阻滯劑金剛烷胺和金剛乙胺僅對甲型流感病毒有效,但目前監(jiān)測資料顯示甲型流感病毒對其耐藥,不建議使用。

(四)重癥病例的治療

治療原則:積極治療原發(fā)病,防治并發(fā)癥,并進(jìn)行有效的器官功能支持。

1.如出現(xiàn)低氧血癥或呼吸衰竭,應(yīng)及時給予相應(yīng)的治療措施,包括氧療或機械通氣等。

2.合并休克時給予相應(yīng)抗休克治療。

3.出現(xiàn)其他臟器功能損害時,給予相應(yīng)支持治療。

4.出現(xiàn)繼發(fā)感染時,給予相應(yīng)抗感染治療。

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