植物組織培養(yǎng)及其在中草藥研究中的運(yùn)用

植物組織培養(yǎng)及其在中草藥研究中的運(yùn)用

植物組織培養(yǎng)（Plant

Tissue Culture）是應(yīng)用無(wú)菌培養(yǎng)的方法培養(yǎng)植物的一個(gè)離體部分，也即是一種將自然環(huán)境中分離出來(lái)的植物細(xì)胞或組織放入含有合成培養(yǎng)基的瓶中，在無(wú)菌條件下使之生長(zhǎng)或發(fā)育的方法。這項(xiàng)工作自動(dòng)控制50年代后期至今巳取得了很大的進(jìn)展，如誘導(dǎo)培養(yǎng)胡蘿卜的體細(xì)胞分化成完整植株，由曼陀羅的花藥培養(yǎng)形成了單倍體的植株。

從而證明了植物每個(gè)體細(xì)胞都有形成整體植物的潛在能力，如植物細(xì)胞具有“全能性”，在離體培養(yǎng)的一定條件下能誘導(dǎo)其分化器官和再生成植株。70年代以后有關(guān)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交的研究得到了很訣發(fā)展，如煙草、曼陀羅、顛茄、胡蘿卜、油菜等能從其原生質(zhì)體經(jīng)培養(yǎng)再生分化長(zhǎng)成胚或完整的植物，利用原生質(zhì)體融合已經(jīng)能使煙草屬和矮牽牛屬的雜種細(xì)胞增殖分化成雜種植株。

因此，運(yùn)用組織培養(yǎng)方法可以在比較簡(jiǎn)單易觀察的條件下研究細(xì)胞、組織或器官的繁殖、生長(zhǎng)和分化，以及各種外界因素對(duì)它們的影響，從而為解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和藥物生產(chǎn)中的某些問(wèn)題開(kāi)辟了廣闊的前景，目前已有若干重要成果應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中，一為營(yíng)養(yǎng)繁殖系的快速繁殖，如以甘蔗為例，原來(lái)每畝要用蔗種0.5～1噸，用組織培養(yǎng)快速繁殖的幼苗進(jìn)行栽培可節(jié)省大量蔗種。又如貝母繁殖率非常低，而用組織培養(yǎng)分化出的三個(gè)月左右的鱗莖，其大小就相當(dāng)于用種子繁殖二年生的鱗莖，另一為藥物和生物制品的工業(yè)生產(chǎn)，藥用植物的有效成分一般都從植物體提得，其產(chǎn)量和質(zhì)量難免要受到植物的遺傳性、生長(zhǎng)條件、收獲時(shí)間及貯藏和運(yùn)輸?shù)纫蛩厮绊?，如果能采用?lèi)似培養(yǎng)微生物產(chǎn)生抗菌素的方法生產(chǎn)有效成分，就可克服這些缺點(diǎn)，這對(duì)生長(zhǎng)條件要求嚴(yán)格、生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)量低、價(jià)值貴重的植物藥更有意義。如近年來(lái)已大量培養(yǎng)人參組織，并提取有效成分，因此利用組織培養(yǎng)生產(chǎn)藥用成分，探索天然藥物生產(chǎn)工業(yè)化的途徑是當(dāng)前藥物生產(chǎn)的一個(gè)新方向，隨著大規(guī)模人工培養(yǎng)技術(shù)的成功，就有可能用組織培養(yǎng)法來(lái)代替全植物提取有效成分，這項(xiàng)工作將是未來(lái)研究植物藥的中心課題之一。

培養(yǎng)基的組成和配制法培養(yǎng)條件

材料和方法有效成分的形成

一、培養(yǎng)基的組成和配制法

近年來(lái)用的化學(xué)合成培養(yǎng)基大致由6種成分組成：（1）糖類(lèi)，②多種無(wú)機(jī)鹽類(lèi)，（3）微量元素，（4）氨基酸、酰胺、嘌呤：（5）維生素；③生長(zhǎng)素。此外，有些培養(yǎng)基還可添加天然的汁液，如椰子汁、酵母提取液、水解酪蛋白、麥芽浸出液等，培養(yǎng)基中如加入0．5～1％的瓊脂即為靜止培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基，否則為懸浮培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基。不同植物材料常需要改變配方，如維持生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞分裂和分化的培養(yǎng)基配方就不同，因此配方的種類(lèi)很多，目前以Ms （Murashige

and

Skoog）培養(yǎng)基配方為最常用的一種基本培養(yǎng)基，它利于一般植物組織和細(xì)胞的快速生長(zhǎng)。

總之，在進(jìn)行組織培養(yǎng)研究時(shí)應(yīng)根據(jù)研究目的和培養(yǎng)植物的種類(lèi)來(lái)確定培養(yǎng)基的組成，除營(yíng)養(yǎng)、誘導(dǎo)作用外還應(yīng)當(dāng)注意離子平衡和毒性問(wèn)題，如水一般都采用重蒸餾水，無(wú)機(jī)鹽類(lèi)一般都需用化學(xué)純的藥品，

pH值可用1N

KoH（或NaOH）溶液和2N

HCI調(diào)整。有時(shí)可以用普通藥品代替，但須注意這些藥品不僅應(yīng)有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還須無(wú)毒。如果在工業(yè)上使用大缸深層培養(yǎng)細(xì)胞或組織生產(chǎn)有效成分和生物制品、應(yīng)用培養(yǎng)基的量將要以噸位計(jì)量時(shí)，則采用什么代用品較為經(jīng)濟(jì)實(shí)用更應(yīng)慎重考慮。

二、培養(yǎng)條件

（一）溫度：對(duì)大多數(shù)植物組織20～28℃即可滿足生長(zhǎng)所需，其中26～27℃最適合。

（二）光：

組織培養(yǎng)通常在散射光線下進(jìn)行。光的影響可導(dǎo)致不同的結(jié)果。有些植物組織在暗處生長(zhǎng)較好，而另一些植物組織在光亮處生長(zhǎng)較好，但由愈傷組織分化成器官時(shí)，則每日必須要有一定時(shí)間的光照才能形成芽和根。有些次生物質(zhì)的形成，光是決定三因素。

（三）滲透壓：

滲透壓對(duì)植物組織的生長(zhǎng)和分化很有關(guān)系。在培養(yǎng)基中添加食鹽、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物質(zhì)可以調(diào)整滲透壓。通常1～2個(gè)大氣壓可促進(jìn)植物組織生長(zhǎng)，2個(gè)大氣壓以上時(shí)，出現(xiàn)生長(zhǎng)障礙，6個(gè)大氣壓時(shí)植物組織即無(wú)法生存。

（四）酸堿度：一般植物組織生長(zhǎng)的最適宜pH為5～6．5。在培養(yǎng)過(guò)程中pH可發(fā)生變化，加進(jìn)磷酸氫鹽或二氫鹽，可起穩(wěn)定作用。

（五）通氣：

懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞的旺盛生長(zhǎng)必須有良好的通氣條件。小量懸浮培養(yǎng)時(shí)巨常轉(zhuǎn)動(dòng)或振蕩，可起通氣和攪拌作用。大量培養(yǎng)中可采用專(zhuān)門(mén)的通氣和攪拌裝置。

三、材料和方法

從低等的藻類(lèi)到苔蘚、蕨類(lèi)、種子植物等高等植物的各類(lèi)、各部分都可采用作為組織培養(yǎng)的材料，一般裸子植物多采用幼苗、芽、韌皮部細(xì)胞，被子植物采用胚、胚乳、子葉、幼苗、莖尖、根、莖、葉、花藥、花粉、子房和胚珠等各個(gè)部分。

由于植物在自然條件下，表面常被霉菌和細(xì)菌污染，故材料必須進(jìn)行滅菌處理。一般用漂白粉溶液（1～10％）、次氯酸鈉溶液（0．5～10％）、升汞溶液（0．01％）、乙醇（70％）或過(guò)氧化氫（3～10％）等處理后，再用無(wú)菌水反復(fù)沖洗至凈，然后在無(wú)菌室內(nèi)，將所取的組織迅速培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基上。在適宜的條件下，受傷組織切口表面不久即能長(zhǎng)出一種脫分化的組織堆塊，稱(chēng)為愈傷組織（Callus），此種愈傷組織在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上經(jīng)一定時(shí)間即能誘導(dǎo)生長(zhǎng)成整株植物，因此愈傷組織既可是某種植物代謝產(chǎn)物的來(lái)源，又是誘導(dǎo)成株的主要途徑之一。

在適宜的培養(yǎng)條件下，還可使愈傷組織長(zhǎng)期傳代生存下去，這種培養(yǎng)稱(chēng)為繼代培養(yǎng)。但在繼代培養(yǎng)中，不少植物培養(yǎng)的組織或細(xì)胞隨著再培養(yǎng)代數(shù)的增加，分化能力就逐漸降低甚至喪失，其原因可能是由于在培養(yǎng)過(guò)程中原有母體中存在的、與器官形成有關(guān)的特殊物質(zhì)被逐漸消耗所致，因此可以用激素或改善營(yíng)養(yǎng)條件使之恢復(fù)，也有認(rèn)為是組織和細(xì)胞在長(zhǎng)期培養(yǎng)中遺傳往的改變，主要是染色體的變化，出現(xiàn)大量多倍性或非整倍性細(xì)胞，這種改變恢復(fù)的可能住較小。不同的培養(yǎng)基可以使愈傷組織具有不同的生長(zhǎng)速度，結(jié)構(gòu)也可松可緊，利用這些特性可使之分散成為單細(xì)胞或很小的細(xì)胞團(tuán)。要形成單細(xì)胞培養(yǎng)宜在較高鹽分、高生長(zhǎng)素及高水解酪蛋白的培養(yǎng)基中進(jìn)行，然后移入液體并經(jīng)攪拌而分散成單細(xì)胞。也有用加入一些果膠酶的辦法，但一般來(lái)說(shuō)要得到純一的單細(xì)胞是很少的。

在培養(yǎng)藥用植物選材時(shí)，還應(yīng)考慮到所需要的次生物質(zhì)在植物體中的合成部位，如果選材和培養(yǎng)方法適當(dāng)，可使原植物內(nèi)所產(chǎn)主的代謝物通過(guò)細(xì)胞或組織培養(yǎng)發(fā)生生化轉(zhuǎn)變而獲得。

通過(guò)組織培養(yǎng)可獲得有效成分，但實(shí)際上只有大量培養(yǎng)成功才有經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此在生產(chǎn)上常采用懸浮培養(yǎng)法來(lái)代替含有瓊脂的固體培養(yǎng)基。愈傷組織懸浮培養(yǎng)的生長(zhǎng)通常比靜止培養(yǎng)快，這是由于懸浮培養(yǎng)時(shí)營(yíng)養(yǎng)成分可較快地滲入細(xì)胞，抑制生長(zhǎng)的代謝廢物可較快地除去，同時(shí)供氧情況也較好，在進(jìn)行這種培養(yǎng)時(shí)要注意通氣與定期更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)液，這是保證生長(zhǎng)穩(wěn)定，次生物質(zhì)產(chǎn)量高的關(guān)鍵之一。

四、有效成分的形成

列舉用組織培養(yǎng)方法合成的一些有效成分。

利用組織培養(yǎng)方法產(chǎn)生藥用成分，已漸漸成為藥物生產(chǎn)的新方向之一。六十年代以來(lái)，有些國(guó)家已經(jīng)開(kāi)展了薯蕷及其他有關(guān)科屬植物的組織培養(yǎng)，研究薯蕷皂甙元的形成，探討其生物合成機(jī)制；已知有7種薯蕷屬植物經(jīng)組織培養(yǎng)后，可獲得薯蕷皂甙元或其它甾體化合物，其中三角葉薯蕷Dioscorea deltoides Wal1。經(jīng)組織培養(yǎng)得到薯蕷皂甙元的含量為0．3～2．5％，此外尚有魚(yú)藤酮、甘草甜素，菸堿等，例如從煙草根尖細(xì)胞懸浮培養(yǎng)可產(chǎn)生2．9％（干重）菸堿。

在通常應(yīng)用的基本培養(yǎng)基中適當(dāng)添加生長(zhǎng)激素、維生素或其他化學(xué)藥品有時(shí)能使代謝物增加，如白花曼陀羅組織培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)基中加進(jìn)0．1％酪氨酸可使阿托品的產(chǎn)量增加7倍多，蕓香組織培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)基中添加4一羥基-2喹啉酚，可促進(jìn)白蘚堿的合成和積累，在這兩例中的添加物被認(rèn)為是生物合成的前體。又如培養(yǎng)三分三愈傷組織時(shí)，在生長(zhǎng)后期供給1my/1激動(dòng)素，可使東莨菪堿的含量達(dá)到0．495％，比原植物中的含量提高很多。

除了培養(yǎng)基的組成外，環(huán)境因素也影響次生物質(zhì)的產(chǎn)生。例如石芹的組織培養(yǎng)在黑暗中雖也增殖，但不形成黃酮類(lèi)，而當(dāng)暴露于光線中時(shí)，就能測(cè)出芹菜甙。組織培養(yǎng)應(yīng)用在藥學(xué)方面的工作雖然歷史不長(zhǎng)，但發(fā)展很迅速，它具有如下一些優(yōu)點(diǎn)：

1．利用組織培養(yǎng)代替原植物的栽培以獲得所需的有效成分，達(dá)到產(chǎn)量高，成本低的目的，還可節(jié)約土地。

2．除了應(yīng)用于產(chǎn)生次生物質(zhì)外，還可應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化。例如煙草組織培養(yǎng)中蒂巴因去甲基后可能生成嗎啡。

3．從組織培養(yǎng)的定性分析中發(fā)現(xiàn)新化合物。例如在蕓香組織培養(yǎng)中，合成和積累了蕓香素（Rutacultin），它是一個(gè)至今尚未能從原植物或其他植物的呋喃香豆精中檢測(cè)到的化合物。因而，組織培養(yǎng)將是獲得新的生物活性化合物的一個(gè)來(lái)源。

4．一般情況下，組織培養(yǎng)是異養(yǎng)的，但也有自養(yǎng)的細(xì)胞系株，它們具有光合作用的能力而不依賴外界的糖類(lèi)供應(yīng)。這種特性將使細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)優(yōu)越于全植物，并更為經(jīng)濟(jì)。

目前中國(guó)有關(guān)單位已成功地將麥角菌、靈芝、猴頭菇等真菌進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，高等植物組織培養(yǎng)在工業(yè)化中的應(yīng)用也正在研究。

總之，植物組織培養(yǎng)這一新技術(shù)在中草藥方面應(yīng)用的前途是無(wú)限廣闊的，它不僅有利于探討和闡明藥用植物生理、遺傳和成分生物合成等一系列理論問(wèn)題，而且一旦工業(yè)化生產(chǎn)問(wèn)題得到解決，將可以為防病治病做出很大的貢獻(xiàn)。

可用于組織培養(yǎng)的植物有哪些

可用于組織培養(yǎng)的植物有哪些

幾乎所有的植物都可以用組織培養(yǎng)的方式繁殖，但要求的條件與技術(shù)較高。

現(xiàn)在植物組織培養(yǎng)技術(shù)在生產(chǎn)中應(yīng)用已經(jīng)很普遍了，比如花卉中的國(guó)蘭、洋蘭、馬蹄蓮、安祖花（火鶴）；水果中的火龍果、香蕉、蘋(píng)果、棗、石榴；林木中的竹子、桉樹(shù)、柚木；藥材中的羅漢果、絞股蘭、石斛；蔬菜中的青花菜、芋頭、馬鈴薯等等很多

適合組織培養(yǎng)的植物有哪些啊 ？

理論上什么植物都可以進(jìn)行組織培養(yǎng)，但是利用組培技術(shù)繁殖植物就是為了快速得到大批量?jī)?yōu)良植株，所以應(yīng)該選取形狀比較優(yōu)良的植物進(jìn)行培養(yǎng)，植物的組織器官，莖，葉，芽，都可以培養(yǎng)，根據(jù)不同的植物選取不同組織和器官進(jìn)行培養(yǎng)。也可以從種子培養(yǎng)出無(wú)菌苗然后用無(wú)菌苗進(jìn)行接種。
對(duì)于經(jīng)濟(jì)實(shí)惠要看你想購(gòu)買(mǎi)什么樣的植株，如果你想培養(yǎng)的植物比較名貴那就不能考慮這個(gè)了，如果想做個(gè)簡(jiǎn)單的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)完全可以就地取材，隨便找?guī)字曛参锶∑溆啄鄣牟课贿M(jìn)行培養(yǎng)就可以了。

哪些植物常用于組織培養(yǎng)

首先明確組織培養(yǎng)的應(yīng)用是
1植物快速繁殖，該應(yīng)用的目的是保持植物原有的優(yōu)良性狀，因此該方法適合于那些具有優(yōu)良性狀但在自然狀態(tài)下而無(wú)性繁殖比較難的植物，如蘭花之類(lèi)的植物。
2、植物脫毒：因病毒會(huì)降低產(chǎn)量，因此用于農(nóng)作物的脫毒，如土豆。草莓之類(lèi)的作物。
3、生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)品：主要用于瀕危植物，植物所含的物質(zhì)作用比較大，因此采用植物組織培養(yǎng)的方法將其培養(yǎng)到愈傷組織后，使其產(chǎn)生大量產(chǎn)品，而生產(chǎn)周期比較短。如紫杉醇的生產(chǎn)等。
生產(chǎn)上用得最多的植物有馬鈴薯、草莓、香蕉、甘蔗、甘薯、枸杞、葡萄、楊樹(shù)及蘭花、月季、百合、康乃馨等；還有各種新引進(jìn)的名、特、優(yōu)品種及一些名貴藥材。

關(guān)于植物組織培養(yǎng)的疑惑

首先是脫分化。植物組織培養(yǎng)通常采用已經(jīng)完全分化的成熟組織，如植物的根，莖，葉等，必須將這些完全分化的外植體去分化 或 脫分化轉(zhuǎn)變成具有未分化狀態(tài)的愈傷組織。這時(shí)你可以進(jìn)行一下選擇：
1，當(dāng)生長(zhǎng)激素含量大于細(xì)胞分裂素時(shí),會(huì)促進(jìn)"根原基"的生長(zhǎng)，即先生根。
2，當(dāng)細(xì)胞分裂素含量大于生長(zhǎng)激素時(shí),會(huì)促進(jìn)"芽原基"的生長(zhǎng)，即先發(fā)芽。
也就是你可以讓愈傷組織先生根 或 先生芽。

關(guān)于植物組織培養(yǎng)的問(wèn)題……

外植體一般選用芽等分生組織的細(xì)胞，因?yàn)檫@些細(xì)胞分化程度低，且很少帶有病毒。
細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，概括就是 去分化再分化
營(yíng)養(yǎng)成分不是一直不變，一是植物體在不斷消耗，有的時(shí)候我們也會(huì)進(jìn)行補(bǔ)充；二是在誘導(dǎo)去分化再分化的時(shí)候，就需要調(diào)整激素的濃度。

關(guān)于植物的組織培養(yǎng)的問(wèn)題

花粉來(lái)進(jìn)行組織培養(yǎng)，算無(wú)性繁殖（沒(méi)有經(jīng)過(guò)精卵融合成受精卵），培養(yǎng)得到的是單倍體（由配子直接發(fā)育成）

植物組織培養(yǎng)與植物細(xì)胞培養(yǎng)的區(qū)別

一是，植物組織培養(yǎng)是用很多細(xì)胞，而植物細(xì)胞培養(yǎng)使用一個(gè)細(xì)胞。
二是，植物組織培養(yǎng)可以得到與母本的植株，而植物細(xì)胞培養(yǎng)即可以得到與母本的植株也可以得到單倍體植株(譬如說(shuō)花粉培養(yǎng)）。

影響組織培養(yǎng)的因素有哪些

1.植物的材料
（1）不同的植物組織，培養(yǎng)的難易程度差別很大。例如，菸草和胡蘿卜的組織培養(yǎng)較為容易，而枸杞愈傷組織的芽誘導(dǎo)就比較難。
（2）同一種植物材料，因器官來(lái)源及其生理狀況、材料的年齡、儲(chǔ)存時(shí)間的長(zhǎng)短等也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
2.培養(yǎng)基
離體的植物組織和細(xì)胞，對(duì)營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境條件要求相對(duì)特殊，需要配制適宜的培養(yǎng)基。植物組織培養(yǎng)常用MS培養(yǎng)基，其主要成分包括：
（1）無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)：
大量元素：除了C、H、O外還有N、S、P、Mg、K、Ca等
微量元素：Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、Co、I等
（2）有機(jī)營(yíng)養(yǎng)
維生素、Aa、瓊脂、活性炭、煙酸、肌醇、蔗糖等
（3）植物激素
植物激素中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是啟動(dòng)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素。在生長(zhǎng)素存在的情況下，細(xì)胞分裂素的作用呈現(xiàn)加強(qiáng)的趨勢(shì)。按照不同的順序使用這兩種激素，會(huì)得到不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
當(dāng)同時(shí)使用這兩種激素時(shí)，兩者用量的比例影響植物細(xì)胞的發(fā)育方向。
（4）能量和滲透壓
通常植物本身進(jìn)行光合作用，產(chǎn)生糖類(lèi)，不需要從外部供給糖，但在植物組織培養(yǎng)進(jìn)行異養(yǎng)的狀況下，大多不能進(jìn)行光合作用來(lái)合成糖類(lèi)，因此必須哎培養(yǎng)基中新增糖（一般是蔗糖），作為碳源和能源物質(zhì)，同時(shí)糖對(duì)保持培養(yǎng)基的滲透壓也有重要作用。
（5）PH
3.溫度
溫度是植物組織培養(yǎng)中成功的重要條件。在植物組織培養(yǎng)中大多采用最適溫度，并保持恒溫培養(yǎng)，以加速生長(zhǎng)。通常采用25加減2攝氏度的溫度，對(duì)大多數(shù)植物來(lái)講是合適的，但也因種類(lèi)而異。進(jìn)行菊花組織培養(yǎng)時(shí)是18~22度。
4.光照
不同的植物對(duì)各種條件的要求往往不同。組織培養(yǎng)中光照也是重要條件，它對(duì)生長(zhǎng)和分化有很大影響。當(dāng)然這也和材料的性質(zhì)、培養(yǎng)基情況以及由于光照而引起的溫度上升等方面的因素有關(guān)。菊花培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為1000~4000lx，每天光照12h。

哪兒可以弄到植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基

你好，請(qǐng)問(wèn)你是小批量做試驗(yàn)還是大量生產(chǎn)呢
一般網(wǎng)路有組培相關(guān)的公司在賣(mài)了，主要是MS培養(yǎng)基
因?yàn)椴煌参飳?duì)培養(yǎng)基要求不一樣，個(gè)人建議有條件自己配，這樣才知道怎么去改良配方
如確實(shí)需要購(gòu)買(mǎi)，請(qǐng)留下你的qq或其他聯(lián)絡(luò)方式，細(xì)談
歡迎追問(wèn)，滿意請(qǐng)采納，謝謝

現(xiàn)代生物及農(nóng)業(yè)技術(shù)在藥用植物研究和生產(chǎn)中的應(yīng)用是什么？

（朱蔚華）

1902年，最早作植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的G.Haberlandt預(yù)言，高等植物的離體細(xì)胞可以長(zhǎng)成植物體。這一假說(shuō)成為以后植物組織培養(yǎng)的理論依據(jù)。

1937年，White建立了組織培養(yǎng)的綜合培養(yǎng)基，并和Gautheret等人首次成功地用煙草的莖形成層細(xì)胞和胡蘿卜根的小塊，在人工培養(yǎng)的條件下，使細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)出愈傷組織。他們建立起來(lái)的植物組織培養(yǎng)的基本方法，成為以后各種植物進(jìn)行組織培養(yǎng)的技術(shù)基礎(chǔ)。

1948年，F(xiàn).Skoog和崔澂發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)煙草莖段和髓的培養(yǎng)基上，附加適當(dāng)比例的腺嘌呤和生長(zhǎng)素可以控制植物的組織長(zhǎng)苗或長(zhǎng)根，也就是說(shuō)當(dāng)腺嘌呤/生長(zhǎng)素的比例高時(shí)產(chǎn)生芽，比例低時(shí)形成根。其后，C.D.Miller等（1956）發(fā)現(xiàn)，激動(dòng)素代替腺嘌呤效果更好，建立了激動(dòng)素/生長(zhǎng)素比例的控制器官分化的激素模式。這種激素“控制論”的理論在植物組織培養(yǎng)研究中，至今仍起著指導(dǎo)作用。

50年代，組織培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展迅速，由靜止的固體培養(yǎng)發(fā)展到液體培養(yǎng)，其中又分懸浮培養(yǎng)、微室培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、平板培養(yǎng)等。1958年Steward等人，用液體懸浮培養(yǎng)把胡蘿卜的體細(xì)胞經(jīng)胚狀體的發(fā)育途徑，培養(yǎng)成完整植株并且開(kāi)花結(jié)實(shí)。這項(xiàng)重大突破，不但證實(shí)了Haberlandt的“細(xì)胞全能性”的設(shè)想，而且也為組織培養(yǎng)中研究器官形成和胚胎發(fā)生，開(kāi)創(chuàng)了一個(gè)新的領(lǐng)域。

60年代初E.C.Cocking等人用真菌纖維素酶分離植物原生質(zhì)體獲得成功，為近年來(lái)新發(fā)展的原生質(zhì)體融合技術(shù)、體細(xì)胞雜交等遺傳工程的迅速發(fā)展創(chuàng)造了條件。

近二十年來(lái)，由于培養(yǎng)的植物細(xì)胞在一定條件下所表現(xiàn)的全能性規(guī)律，使組織培養(yǎng)技術(shù)在生產(chǎn)上的應(yīng)用得到了重視與發(fā)展，已逐漸成為農(nóng)業(yè)、林業(yè)、園藝、醫(yī)藥等方面的重要研究手段，并且?guī)?dòng)了形態(tài)、細(xì)胞、生理、生化、遺傳育種等一系列學(xué)科的進(jìn)展。

由于分子生物學(xué)和生物工程的發(fā)展，促使植物組織培養(yǎng)技術(shù)日趨完善。60年代后植物組織培養(yǎng)開(kāi)始在生產(chǎn)上應(yīng)用，使植物生產(chǎn)走向工廠化的應(yīng)用時(shí)期。花卉及草本植物，用無(wú)性繁殖系快速繁殖植株，工廠化生產(chǎn)的試管品種商品化；應(yīng)用細(xì)胞大量培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥物的方法，已在日本、聯(lián)邦德國(guó)等國(guó)家獲得成功?？傊?，植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)是一項(xiàng)具有很大潛力的新興的生物技術(shù)，將以嶄新的面貌投入世界新的產(chǎn)業(yè)革命的行列，而展示美好的前程。

目前植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在植物學(xué)等學(xué)科的實(shí)際應(yīng)用，主要在兩個(gè)方面：（1）植物育種與快速繁殖；（2）生理活性物質(zhì)的生產(chǎn)。

一、植物組織培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備、滅菌方法和基本培養(yǎng)基

（一）植物組織培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備

1.實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置

（1）無(wú)菌操作室室內(nèi)有供接種用的凈化工作臺(tái)，放置接種用具和培養(yǎng)物的工作邊臺(tái)，天花板或墻上安裝紫外光燈管供滅菌用。如有細(xì)菌過(guò)濾的通氣裝置更好。

（2）培養(yǎng)基配制室

用于配制各種培養(yǎng)基，室內(nèi)須有較大面積的平面工作臺(tái)以及放置各種化學(xué)藥劑及器皿的柜架。存放配制好的培養(yǎng)基母液的冰箱，蒸餾水制備及貯存的設(shè)備。

（3）恒溫培養(yǎng)室

培養(yǎng)室內(nèi)需要有控制恒溫的空氣調(diào)節(jié)器，以及照明裝置。恒溫室的溫度一般保持在25℃左右，溫差最好不超過(guò)±1℃。

培養(yǎng)室內(nèi)須有培養(yǎng)架，搖床，轉(zhuǎn)床等培養(yǎng)裝置及設(shè)備。

（4）細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室

放置各種顯微鏡和解剖鏡，主要觀察培養(yǎng)結(jié)果。有條件時(shí)可建立攝影設(shè)備，攝制實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（5）化學(xué)實(shí)驗(yàn)室

置備各種常規(guī)和先進(jìn)的化學(xué)分析和測(cè)定的儀器設(shè)備，進(jìn)行各種化學(xué)分析和測(cè)定工作。

2.儀器和用具

（1）玻璃器皿

應(yīng)用堿性溶解度小的硬質(zhì)玻璃制成的儀器和器皿，特別是進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)，如選用非優(yōu)質(zhì)玻璃制品，則易發(fā)生不良影響。

常用的玻璃器皿有：三角瓶、奶頭瓶、T型管、角形培養(yǎng)瓶、圓形培養(yǎng)瓶、L形試管、平行有（無(wú)）角試管、圓形扁瓶、培養(yǎng)皿、玻璃環(huán)、載玻片、蓋玻片、漏斗、分裝器、注射器、圓底燒瓶、分液漏斗、玻板、玻璃柱、冷凝器、提取裝置、染色缸、酒精燈。

（2）用具和器械

選用醫(yī)療器械和微生物實(shí)驗(yàn)室使用的器具，如刀、剪、各種鑷子、解剖刀、接種針。

（3）儀器和設(shè)備

一般需要有天平、酸度計(jì)、離心機(jī)、顯微鏡、解剖鏡、溫箱、烘箱、冰箱、搖床、轉(zhuǎn)床、自旋式培養(yǎng)架、分光光度計(jì)、薄層掃描儀、高壓液相色譜儀等。

（二）植物組織培養(yǎng)的滅菌方法

1.器皿和培養(yǎng)基的滅菌

培養(yǎng)皿、工作服、口罩、帽子等可用高溫消毒，一般用1.2個(gè)大氣壓，20—30分鐘；培養(yǎng)基的消毒時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則有些物質(zhì)易分解破壞，1.2個(gè)大氣壓，15分鐘就足夠了。金屬器械的消毒，一般于使用前浸泡在70%乙醇中，用時(shí)在火焰上點(diǎn)燃消毒冷卻后使用。

2.植物材料的滅菌

植物材料的滅菌主要是外部滅菌，須根據(jù)材料的種類(lèi)對(duì)殺菌劑的敏感性來(lái)選擇消毒劑的種類(lèi)與濃度和處理時(shí)間的長(zhǎng)短。首先將實(shí)驗(yàn)材料在肥皂粉溶液中仔細(xì)刷洗并用流水沖洗干凈，然后參照表13—1和表13—2所列的方法和順序進(jìn)行滅菌。

表13—1 常用滅菌劑效果的比較

表13—2 植物不同器官的滅菌順序（三）植物組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基

1.培養(yǎng)基的成分組成

植物組織培養(yǎng)基通常由以下幾類(lèi)物質(zhì)組成（表13—3）：

表13—3 幾種常用培養(yǎng)基的成分組成（單位：mg/l）

（1）無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物

無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)物包括大量元素和微量元素。大量元素除碳（C）、氫（H）、氧（O）外，就是氮（N）。氮通常用硝態(tài)氮或銨態(tài)氮，但在培養(yǎng)中多用硝態(tài)氮，也有將硝態(tài)氮與銨態(tài)氮混合使用。磷常用磷酸鹽，硫常用硫酸鹽。鉀是主要的陽(yáng)離子，鈣（Ca）、鈉（Na）、鎂（Mg）的需要量較少。大量元素的配合比率一般都是沿用培養(yǎng)整體植物的Knop溶液的配方修改而成。在一般情況下，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中至少要含有各為25mmol的硝酸鹽和鉀。銨的含量超過(guò)8mmol時(shí)常對(duì)培養(yǎng)物有毒害作用；但對(duì)常規(guī)的愈傷組織培養(yǎng)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，硝酸鹽加上銨的濃度可以提高到60mmol。鈣、硫、鎂的濃度在1—3mmol范圍內(nèi)較為合適。而所需的鈉氯化物則由鈣鹽、磷酸鹽或微量營(yíng)養(yǎng)物提供。微量元素包括碘（I）、硼（B）、錳（Mn）、鋅（Zn）、鉬（Mo）、銅（Cu）、鈷（Co）和鐵（Fe），其中碘可能是不必需的。

（2）碳源和能源

大多數(shù)植物細(xì)胞對(duì)蔗糖的需要范圍是2—4%，在有些植物組織培養(yǎng)中，蔗糖的濃度高達(dá)7%甚至15%。糖源在培養(yǎng)基中除作為碳源和能源外，可能還有其它作用。蔗糖也能用葡萄糖和果糖來(lái)代替，其它的糖類(lèi)均不夠理想。肌醇可能并不是必需的，但在一般培養(yǎng)基中均用了較大的濃度，這可能與它有促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)作用有關(guān)。

（3）維生素

在各種維生素中，鹽酸硫胺素（B1）可能是必需的，而煙酸及鹽酸吡哆辛（B6）對(duì)生長(zhǎng)只有促進(jìn)作用。

（4）生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)

植物激素是培養(yǎng)基中不可缺少的組成成分，它對(duì)植物愈傷組織的誘導(dǎo)、培養(yǎng)生長(zhǎng)、器官分化和次生產(chǎn)物的代謝，都有直接的影響。通常加入于培養(yǎng)基中的激素有兩類(lèi)：一是生長(zhǎng)素，常用有2，4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等；另一類(lèi)是細(xì)胞分裂素，常用的有激動(dòng)素（Kt）、玉米素（Zt）、6-芐基嘌呤（6-BA）。2，4-D的適宜濃度為10-7—10-5mol，IAA的為10-10—10-5mol，以1—10mg/l為最通用。NAA的適宜濃度范圍比前二者均高。在通常情況下，只用2，4-D（10-5—10-7mol）就可以成功地誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。如將2，4-D等生長(zhǎng)素物質(zhì)與一種細(xì)胞分裂素配合使用時(shí)，其效果會(huì)更好。誘導(dǎo)外植體分化植株時(shí)，用萘乙酸與一種細(xì)胞分裂素配合可能更好。在細(xì)胞分裂素中，激動(dòng)素與6-芐基嘌呤均使用得較普遍，對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，其適宜濃度為10-7—10-6mol。

（5）氨基酸

培養(yǎng)基中應(yīng)包括某些氨基酸，例如甘氨酸。另外像水解酪蛋白也是組織培養(yǎng)中常采用的，它是一種具有多種氨基酸的混合物，特別是在分化培養(yǎng)基中加入一定量的水解酪蛋白，可促進(jìn)胚胎發(fā)生和多胚性出現(xiàn)。一些氨基酸是某些次生物質(zhì)的前體物（如苯丙氨酸、鳥(niǎo)氨酸等是莨菪類(lèi)生物堿生物合成的前體物），當(dāng)它們加入培養(yǎng)基中，會(huì)明顯地增加這類(lèi)次生物質(zhì)在組織培養(yǎng)物中的含量與產(chǎn)量。

（6）有機(jī)添加物

一些天然產(chǎn)物加入培養(yǎng)基中，它們對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和維持，以及促進(jìn)生長(zhǎng)和次生物質(zhì)的形成與積累都是有益的。其中最常用的有椰子乳、酵母提取物、番茄汁、大豆粉等。其使用的濃度范圍：椰子乳為10%（體積/體積），酵母提取物為0.5%，番茄汁為5—10%，大豆粉0.1—0.5%。這些天然添加物，由于成分復(fù)雜且難保證重復(fù)一致，所以在培養(yǎng)基的配制中更傾向于選用完全已知的合成化合物。

2.培養(yǎng)基的制備

（1）水和藥品

配制培養(yǎng)基最好使用玻璃容器蒸餾過(guò)的去礦質(zhì)鹽的蒸餾水。所用的化學(xué)藥品應(yīng)較純。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在用前最好進(jìn)行重結(jié)晶。蛋白質(zhì)水解物最好用酶水解的，這樣可以使氨基酸更好地在自然狀態(tài)中保存。

（2）母液（貯備液）

配制培養(yǎng)基方便的方法是先制備一系列母液。大量的礦質(zhì)鹽（大量元素）可配成濃于使用濃度的10倍。溶解礦質(zhì)鹽時(shí)，力求把Ca2+與SO2-4—和PO3-4錯(cuò)開(kāi)，以免形成硫酸鈣和磷酸鈣的不溶物，最好是用一定量蒸餾水將礦質(zhì)鹽分別溶化后，然后按順序加入，最后加水至一定體積。微量元素由于用量少，可配成使用濃度的100—1000倍濃縮液，與大量元素等貯存于冰箱中。維生素每種分開(kāi)配制，可按0.2—1mg/l的濃度分別配在容量瓶中貯存。鐵鹽需單獨(dú)配制（見(jiàn)前）。植物激素類(lèi)物質(zhì)，配制時(shí)的要求各有不同。NAA、2，4-D和IAA等生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)，稱(chēng)好藥品后先用少量95%乙醇溶化，然后再加蒸餾水稀釋至一定濃度；細(xì)胞分裂素類(lèi)物質(zhì)，則宜先用少量0.5或1N的鹽酸來(lái)溶解，然后加蒸餾水至所需量；葉酸則應(yīng)用少量的稀氨水溶解，然后再加蒸餾水至所需量；生物素配制時(shí)可直接溶于水。

（3）高壓滅菌和保存

配制培養(yǎng)基時(shí)，先將各種母液按所需容積分別取出并混合在一起，臨時(shí)加入蔗糖、激素和其它附加成分，并與預(yù)先已加熱溶化的瓊脂（液體培養(yǎng)則不加瓊脂）混合后，用氫氧化鈉溶液或1N鹽酸調(diào)節(jié)pH值至要求的一定值（5.5—5.8之間），然后再分別裝入培養(yǎng)容器中。制備好的培養(yǎng)基在高壓滅菌鍋中，120℃，1.1kg/cm2的高壓下滅菌15—20min。滅菌后的培養(yǎng)基可在室溫下貯存（最適的溫度為10℃），并應(yīng)在兩周內(nèi)應(yīng)用。

3.幾種常用培養(yǎng)基的特點(diǎn)

在不同的培養(yǎng)基中，一般無(wú)機(jī)鹽的變化較大，有時(shí)也因加入不同的氮源而形成各自的特點(diǎn)。MS是1962年Murashige，T.和Skoog，F(xiàn).為培養(yǎng)煙草而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，它對(duì)在固體培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)愈傷組織，在液體培養(yǎng)條件下作細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及用于胚、莖尖、莖段和花藥等培養(yǎng)和形態(tài)發(fā)生研究方面，均獲得了明顯的成功。MS培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)養(yǎng)分的數(shù)量和比例均較合適，足以滿足很多植物細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)上和生理上的需要。故在一般情況下，無(wú)需在培養(yǎng)基中加入酪朊水解物、酵母水解物或椰子乳等有機(jī)附加成分。與其它培養(yǎng)基相比，MS培養(yǎng)基中的硝酸鹽、鉀和銨的含量高，這是它顯著的特點(diǎn)。與MS培養(yǎng)基相近的，還有LS（Linsmaier，E.M.和Skoog，F(xiàn).1965）和RM（田中，1964）培養(yǎng)基，它們的基本成分均與MS培養(yǎng)基相同，唯前者去掉了甘氨酸，維生素B6和煙酸，后者把NH4NO3的用量提高到4950mg/l，把KH2PO4提高到510mg/l。與MS培養(yǎng)基相比White（1963）培養(yǎng)基則是一個(gè)具有較低濃度無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，但它的使用也十分廣泛，無(wú)論在胚胎培養(yǎng)或一般組織培養(yǎng)上也有很好的效果。B5培養(yǎng)基是Gamborg等（1968）設(shè)計(jì)的，它的主要特點(diǎn)是含較低的銨，而銨這一營(yíng)養(yǎng)成分可能對(duì)某些生長(zhǎng)物有抑制生長(zhǎng)的作用。N6培養(yǎng)基是中國(guó)科學(xué)院植物研究所和黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)計(jì)的，也是一個(gè)很適用的培養(yǎng)基，目前在國(guó)內(nèi)已廣泛用于花藥培養(yǎng)及某些植物的組織培養(yǎng)上，其成分與B5相似，但卻不含鉬。Heller（1953）培養(yǎng)基是歐洲使用得較普遍的一種培養(yǎng)基，它的無(wú)機(jī)鹽含量低，同時(shí)還缺乏鉬鹽，但含有鎳鋁等化合物。

從總的趨勢(shì)來(lái)看，近代的培養(yǎng)基都傾向于采用高濃度的無(wú)機(jī)鹽。在氮的運(yùn)用上，不少是采用硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的混合，或只是硝態(tài)氮。微量元素的作用研究得較少，大多數(shù)配方也基本上接近MS培養(yǎng)基的，而所包含的這些微量元素成分已滿足組織培養(yǎng)中愈傷組織和細(xì)胞生長(zhǎng)的需要。對(duì)于鐵鹽通常則采用FeSO4與Na2-EDTA（螯合劑）的混合物居多。

二、植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)在藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用

近些年來(lái)由于自然環(huán)境的人為破壞，濫采亂伐，勞力費(fèi)用上漲及引種野生植物在技術(shù)上和（或）經(jīng)濟(jì)上的困難，導(dǎo)致植物資源急劇減少，而確保藥用植物充分供應(yīng)的困難日益增加。六十年代以來(lái)，人們開(kāi)始應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究植物藥的生產(chǎn)問(wèn)題。近年來(lái)隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，植物細(xì)胞大量培養(yǎng)獲得成功，為植物藥物開(kāi)辟了一條嶄新的工業(yè)化生產(chǎn)的新途徑。

細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)比一般整體植物栽培，具有多方面的優(yōu)越性：（1）有用物質(zhì)的生產(chǎn)是在可控制的條件下進(jìn)行，而不必依賴氣候和土壤條件，并節(jié)省土地；（2）細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)微生物和蟲(chóng)害；（3）生長(zhǎng)周期短，縮短植物引種馴化和擴(kuò)大繁殖的漫長(zhǎng)過(guò)程；（4）可以進(jìn)行特定的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，可以探索新的合成路線和獲得新的有用物質(zhì)；（5）可以通過(guò)篩選新的細(xì)胞系，改變培養(yǎng)條件，以提高生產(chǎn)率和減少生產(chǎn)費(fèi)用。

（一）植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

1.愈傷組織的誘發(fā)和培養(yǎng)

愈傷組織是植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)的基本材料，所以誘發(fā)愈傷組織和進(jìn)行培養(yǎng)是植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)性工作之一。

誘發(fā)愈傷組織的工作程序大致如下：

（1）植物材料（包括植物種類(lèi)與部位）的選擇；（2）材料的制備與消毒；（3）培養(yǎng)基的選定與制備；（4）接種與培養(yǎng)；（5）繼代培養(yǎng)。

目前已經(jīng)成功地從許多植物誘發(fā)出愈傷組織，其中以雙子葉植物最多，單子葉植物較少。此外，裸子植物、蕨類(lèi)和蘚類(lèi)植物也有成功的例子。因此可以說(shuō)，所有的多細(xì)胞植物都有誘發(fā)愈傷組織成功的潛在可能性。雙子葉植物除有廣泛的實(shí)用價(jià)值外，且它們能夠迅速地長(zhǎng)出愈傷組織。植物的各種組織，如維管束形成層，貯藏器官的薄壁組織，根的中柱鞘，胚乳、子葉、葉肉組織及維管束組織等，在合適的條件下，都能形成愈傷組織。

愈傷組織的誘發(fā)多在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行。固體培養(yǎng)一般在25—28℃進(jìn)行，每隔4—6周進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)。

愈傷組織的培養(yǎng)方式一般可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩種。固體培養(yǎng)是指向培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑（0.6—1.0%瓊脂等），加熱溶解后，分別裝入培養(yǎng)容器中，冷卻后即為固體培養(yǎng)基。而不加凝固劑者則為液體培養(yǎng)基。

固體培養(yǎng)為靜置培養(yǎng)，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便，只需一般玻璃器皿即可，不像液體振蕩培養(yǎng)那樣需要搖床、轉(zhuǎn)床等復(fù)雜的機(jī)械設(shè)備，且占地少，一間小培養(yǎng)室就可以放置很多培養(yǎng)器皿。但固體培養(yǎng)也存在如下缺點(diǎn)：愈傷組織只有一部分表面和培養(yǎng)基接觸，造成愈傷組織生長(zhǎng)不均衡；接觸培養(yǎng)基的底層組織氣體交換不良，同時(shí)也使生長(zhǎng)過(guò)程排出的有害物質(zhì)堆積；靜止放置時(shí)，由于重力作用或光線照射不均勻，而使組織出現(xiàn)極化現(xiàn)象，而難得相當(dāng)一致的群體。

液體培養(yǎng)又分靜置和振蕩兩種。液體靜置培養(yǎng)與固體培養(yǎng)一樣也是方法簡(jiǎn)便，且培養(yǎng)液中不會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度差異現(xiàn)象；但由于使用的局限性較大，故目前已很少采用。振蕩培養(yǎng)是使植物組織在液體培養(yǎng)基中不斷轉(zhuǎn)動(dòng)，從而可以消除靜置培養(yǎng)中的缺點(diǎn)。振蕩培養(yǎng)又可分為兩類(lèi)：（1）連續(xù)浸沒(méi)的，通過(guò)攪動(dòng)或振動(dòng)培養(yǎng)液的方法使組織懸浮于培養(yǎng)基中，常用搖床進(jìn)行培養(yǎng)；（2）定期浸沒(méi)的，用T型管，乳頭瓶作培養(yǎng)容器，在轉(zhuǎn)床上進(jìn)行培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)動(dòng)過(guò)程中培養(yǎng)材料在液相和氣相中重復(fù)出現(xiàn)。

2.細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)是由愈傷組織的液體培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的培養(yǎng)技術(shù)。近二十多年來(lái)，從試管懸浮培養(yǎng)發(fā)展到大容積發(fā)酵罐培養(yǎng)，從不連續(xù)培養(yǎng)發(fā)展到半連續(xù)和連續(xù)培養(yǎng)，直到近年來(lái)最新型的濁度恒定法和化學(xué)恒定法等自動(dòng)控制的較大規(guī)模的連續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的特點(diǎn)是：（1）能大量提供均勻的植物細(xì)胞；（2）細(xì)胞增殖的速度比愈傷組織快；（3）適合于大規(guī)模培養(yǎng)。因此有可能把植物細(xì)胞如同微生物一樣來(lái)培養(yǎng)，應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)中來(lái)，生產(chǎn)一些植物特有的產(chǎn)物，從而開(kāi)辟一條工業(yè)化生產(chǎn)植物產(chǎn)品的新途徑。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是使游離的植物細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，但是因?yàn)橹参锛?xì)胞具有聚集在一起的特性，故直到目前為止，還不能使懸浮液中只有游離的單細(xì)胞，而往往是一些小的細(xì)胞團(tuán)。

（1）懸浮培養(yǎng)的設(shè)備和裝置

①搖床 廣泛地用于植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中。易于碎裂的愈傷組織塊，經(jīng)搖床的連續(xù)振蕩可以得到分散的細(xì)胞懸浮液。也可用于懸浮細(xì)胞的繼代培養(yǎng)。

②轉(zhuǎn)床 每分鐘一轉(zhuǎn)。用T型管或奶頭瓶作為培養(yǎng)容器。

③自旋式培養(yǎng)架 可用較大的瓶作為培養(yǎng)容器。

④連續(xù)培養(yǎng)設(shè)備 通常依靠通入無(wú)菌的壓縮空氣或既通入空氣又不斷攪拌的方法，使細(xì)胞一直處于懸浮狀態(tài)。在這樣的攪動(dòng)裝置中，由于盛放培養(yǎng)液的容器是靜止的，故能容易地把貯存新鮮培養(yǎng)液的容器，空氣補(bǔ)給裝置等和培養(yǎng)容器連接起來(lái)。培養(yǎng)容器內(nèi)可安裝一些蛇形管，管內(nèi)放入電熱絲就可加熱，通入冷水就可降溫，因此這類(lèi)裝置不必安裝于恒溫室內(nèi)。這類(lèi)裝置一般都有能夠簡(jiǎn)便控制溫度，攪拌速度，通氣速度，照明強(qiáng)度，營(yíng)養(yǎng)液流入速度等的裝置，而且還常與氧電極，pH電極，細(xì)胞密度測(cè)定器等聯(lián)接起來(lái)，成為一套初步自動(dòng)控制的連續(xù)培養(yǎng)裝置。幾種植物細(xì)胞大量培養(yǎng)裝置有用攪拌的發(fā)酵裝置，用振蕩器的發(fā)酵裝置，利用導(dǎo)管及旋轉(zhuǎn)葉輪的發(fā)酵裝置，氣泡攪動(dòng)的發(fā)酵裝置和氣升式發(fā)酵裝置等。

（2）懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)基

常用的適合愈傷組織的培養(yǎng)基，不一定對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)也最合適。通常誘發(fā)愈傷組織的培養(yǎng)基可以作為確定最適培養(yǎng)基的出發(fā)點(diǎn)。特別需要注意生長(zhǎng)素類(lèi)和細(xì)胞激動(dòng)素類(lèi)的用量對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集性的影響，必須選用使細(xì)胞易于單一游離的培養(yǎng)基。

在懸浮培養(yǎng)時(shí)pH常有相當(dāng)大的變動(dòng)，因此必須加入EDTA等螯合劑使鐵和其他離子長(zhǎng)期處于可利用狀態(tài)。硝態(tài)氮和銨態(tài)氮之間比例的調(diào)整也可作為穩(wěn)定pH的一種方法。加入一些固態(tài)緩沖物，如微溶的磷酸氫鈣、不溶的磷酸鈣、碳酸鈣也是穩(wěn)定pH的一種方法。

（3）懸浮細(xì)胞的繼代培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞數(shù)目增長(zhǎng)的變化情況見(jiàn)圖13—1?；旧鲜且粭lS形曲線。一開(kāi)始是延遲期，細(xì)胞很少分裂；接著是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞數(shù)目迅速增長(zhǎng)，增長(zhǎng)速率保持不變；以后進(jìn)入逐漸減慢的靜止期；最后達(dá)到增長(zhǎng)完全停止期。細(xì)胞在培養(yǎng)中，一般在靜止期之初進(jìn)行繼代培養(yǎng)，有的在靜止期之前增殖減慢時(shí)即需傳代，有的甚至在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末立即傳代，以求加速細(xì)胞增殖。

圖13—1 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在一個(gè)培養(yǎng)世代中細(xì)胞數(shù)的增長(zhǎng)情況示意圖

近年研究采用DNA合成抑制劑和植物激素處理法等，使培養(yǎng)中的細(xì)胞在一定條件下，進(jìn)入細(xì)胞分裂周期的某一個(gè)時(shí)期（如G期），然后從下一個(gè)時(shí)期開(kāi)始，使大部分細(xì)胞或全部細(xì)胞同步分裂，即所謂同步培養(yǎng)。這樣不僅可以詳細(xì)了解細(xì)胞周期的真實(shí)過(guò)程，還可以認(rèn)識(shí)控制著從親代細(xì)胞到子代細(xì)胞過(guò)程中生化變化序列的因素。由于同步培養(yǎng)可以頻繁地取樣進(jìn)行生化學(xué)和細(xì)胞學(xué)的分析，取樣量可以較大，并且不會(huì)影響到剩下來(lái)的群體繼續(xù)生長(zhǎng)，這樣對(duì)研究細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、次生物質(zhì)代謝等重要過(guò)程提供了必要的技術(shù)手段，是植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展中的又一重要進(jìn)展。

綜上所述，目前植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已從靜止的固體培養(yǎng)發(fā)展到液體培養(yǎng)，其特點(diǎn)是可以使培養(yǎng)中的組織和細(xì)胞的養(yǎng)分和供氧情況得到改善。在規(guī)模和方法上正沿著從小量到大量，在應(yīng)用上從試管到大罐和同步培養(yǎng)，在操作上從手工到自動(dòng)化方向發(fā)展。這些進(jìn)步和發(fā)展對(duì)植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)的研究和生產(chǎn)應(yīng)用產(chǎn)生重大的影響。

（二）植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的藥物成分

自1950年Bonner等對(duì)用銀膠菊愈傷組織產(chǎn)生天然橡膠進(jìn)行研究以來(lái)，許多科學(xué)工作者圍繞著愈傷組織能產(chǎn)生哪些有用物質(zhì)，如何提高有效成分得率等問(wèn)題，進(jìn)行了大量的工作，并取得了一些成果。越來(lái)越多的人認(rèn)為利用植物組織和培養(yǎng)細(xì)胞有可能生產(chǎn)用于治療各種疾病的生物堿、萜烯類(lèi)、醌類(lèi)、固醇類(lèi)、酶等，以及從培養(yǎng)物中提取肽類(lèi)和蛋白質(zhì)物質(zhì)。Nickell（1980）概括介紹了植物組織培養(yǎng)能產(chǎn)生50余類(lèi)化合物及其中28類(lèi)潛在的產(chǎn)品。鄭光植（1980）綜述列表舉出藥用成分，來(lái)源植物與藥物含量共60多條。日本協(xié)和發(fā)酵公司的見(jiàn)澤（Misawa，M.，1980）介紹了由工業(yè)實(shí)驗(yàn)室或政府進(jìn)行的，通過(guò)植物組織培養(yǎng)產(chǎn)生生物堿，固醇類(lèi)、萜類(lèi)、醌類(lèi)和其他生理活性物質(zhì)包括酶等的研究成果。據(jù)世界衛(wèi)生組織公布，從高等植物提取的最普通而又必不可少的藥物有17種。其中11種藥物的來(lái)源植物已有組織培養(yǎng)（表13—4）。

表13—4 來(lái)源于高等植物的普通而又不可少的藥物

1.生物堿

利用植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物堿是格外地困難，然而產(chǎn)生生物堿的藥用植物的組織培養(yǎng)是研究得最多的一個(gè)方面（表13—5）。但其含量通常比原植物低。

表13—5 植物愈傷組織中的生物堿

表13—5 植物愈傷組織中的生物堿（續(xù)）-1

（1）莨菪烷生物堿

Mothes、West、Chan、Metz、木島正夫、Bhandary、Thomas、Stohs、Sairam、Tabata、Hiraoka、Cliokshi等先后對(duì)曼陀羅、顛茄、天仙子、莨菪等的根、愈傷組織、懸浮細(xì)胞進(jìn)行了大量的研究，但藥用目的物沒(méi)有或含量很低。West（1957）首先肯定了顛茄根的愈傷組織中存在莨菪烷生物堿。檢查到根愈傷組織中阿托品含量為0.47—0.53%。但莖葉的愈傷組織中未檢查到。Chan等（1956）將曼陀羅、柏葉曼陀羅、無(wú)毒曼陀羅的各類(lèi)器官誘導(dǎo)出的愈傷組織，進(jìn)行靜置培養(yǎng)與振蕩培養(yǎng)，測(cè)定愈傷組織中生物堿含量。其中以曼陀羅和無(wú)刺曼陀羅種子愈傷組織中含量最高，達(dá)0.016—0.056%，根為0.012—0.015%，莖為0.004—0.014%，葉為0.007—0.010%。此結(jié)果表示因誘發(fā)愈傷組織的器官不同，生成生物堿的量亦有差異。West等還指出同一起源的曼陀羅的愈傷組織株之間，在合成生物堿的能力上也有差異。鄭光植等（1976）在三分三愈傷組織培養(yǎng)中，最初測(cè)定莨菪堿含量為0.025%、東莨菪堿的含量為0.009%，均低于原植物（分別為0.127%和0.016%）。但因改良培養(yǎng)條件、增加營(yíng)養(yǎng)、改變生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、補(bǔ)充前體物等各方面的研究，使兩種生物堿的含量總共達(dá)0.554%（原植物為0.139%），其中東莨菪堿最高含量達(dá)0.495%（莖為0.016%），比最初愈傷組織的含量高4—4.5倍。程克棣等（1987）研究結(jié)果表明山莨菪等細(xì)胞不僅能產(chǎn)生托品類(lèi)生物堿，還能將莨菪堿轉(zhuǎn)化為山莨菪堿和東莨菪堿。

（2）吡啶生物堿

在產(chǎn)生吡啶生物堿的組織培養(yǎng)研究中，煙草研究得最早最多。早在1948年Dawson就對(duì)煙草中生物堿的生物合成進(jìn)行了研究，他的1960年的報(bào)道粘毛煙草的組織培養(yǎng)中，煙堿的含量在最初階段急劇減少，當(dāng)成典型的愈傷組織時(shí)，就沒(méi)有煙堿了。但Speake等（1964）證明，煙草（Virginia品種）根、莖、葉的

13， 簡(jiǎn)述植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用意義？

1、通過(guò)有莖尖培養(yǎng)脫毒、花藥培養(yǎng)脫毒、愈傷組織脫毒、珠心胚培養(yǎng)脫毒、莖尖微體嫁接脫毒等實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的脫毒試管苗生產(chǎn)。2、省種，用試管苗進(jìn)行植物栽培可節(jié)省大量種子。3、快速繁殖新品種, 防止品種退化。4、保護(hù)生態(tài)環(huán)境、挽救瀕危植物。5、通過(guò)組織培養(yǎng)手段增加遺傳變異性來(lái)改良作物, 已成為一條育種新途徑。6、植物胚培養(yǎng)是采用人工的方法在無(wú)菌條件下從種子中將成熟胚和未成熟胚分離出來(lái), 然后放在人工合成的培養(yǎng)基上培養(yǎng), 使它發(fā)育成正常的植株, 從而有效地克服遠(yuǎn)緣雜交不實(shí)的障礙, 獲得雜種植株。7、用單細(xì)胞培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)單細(xì)胞突變, 篩選需要的突變體培養(yǎng)成植株, 經(jīng)有性繁殖使遺傳性狀穩(wěn)定下來(lái)。8、利用植物組織培養(yǎng)進(jìn)行體細(xì)胞雜交育種。9、利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)建立植物的遺傳再生體系。10、植物組織培養(yǎng)能產(chǎn)生很多種藥物, 主要有苷類(lèi)、生物堿、固醇類(lèi)、醌類(lèi)、黃酮類(lèi)、蛋白質(zhì)及其它生理活性物質(zhì)。利用細(xì)胞培養(yǎng)的方法, 可以獲得次生代謝產(chǎn)物, 如色素、紫杉醇、人參皂甙、生物堿、萜內(nèi)酯等。11、利用組織培養(yǎng)保存植物種質(zhì)資源。

植物細(xì)胞工程可以利用組織培養(yǎng)技術(shù)豐富藥用植物的有效成分嗎

可以。植物組織培養(yǎng)是一種利用植物細(xì)胞、組織或器官，在特定的培養(yǎng)基中，以體外培養(yǎng)的方式，獲得植物細(xì)胞，從而獲得有效成分。因此植物細(xì)胞工程可以利用組織培養(yǎng)技術(shù)豐富藥用植物的有效成分。細(xì)胞（英文名：cell）并沒(méi)有統(tǒng)一的定義。

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