背景資料三：15只恒河猴——SARS疫苗研究的替身

背景資料三：15只恒河猴——SARS疫苗研究的替身

今年7月份，我國第一個SARS冠狀病毒感染動物模型在中國醫(yī)科院動物所成功建立，這標志著困擾SARS疫苗和藥物研究的“瓶頸”被突破，人類SARS終于有了理想的“替身”——恒河猴。

SARS科技攻關戰(zhàn)役打響以來，由于研究難度極大，SARS冠狀病毒感染動物模型的建立一度成為影響攻關進程的“瓶頸”。以中國醫(yī)科院／協(xié)和醫(yī)大動物所常務副所長秦川教授為首的課題組及早動手，利用本所的P3實驗室在國內(nèi)率先展開相關研究。他們分成兩個小組，夜以繼日地埋頭苦干60天，終于取得重大突破。

據(jù)秦川教授介紹，在中國CDC病毒所專家協(xié)作下，她和同事們用從我國SARS病人分離經(jīng)Vero－E6細胞培養(yǎng)擴增的SARS冠狀病毒，經(jīng)鼻腔感染15只恒河猴。結(jié)果在病毒接種的第2～3天時，15只恒河猴均有一過性（4天左右）體溫升高。在病毒接種的第5天，經(jīng)套式RT－PCR檢測，在部分恒河猴的咽拭子標本中即檢測出SARS冠狀病毒RNA，病毒接種的第10天，在15只恒河猴的咽拭子標本中均檢測出SARS冠狀病毒RNA。在病毒感染的第7天及第13天，他們分別從4只猴咽拭子和肺臟組織、淋巴結(jié)標本中成功分離出SARS冠狀病毒。在病毒接種的第17天，15只恒河猴血清中抗SARS冠狀病毒抗體（LgG）呈陽性反應。

通過相關病理學觀察，他們發(fā)現(xiàn)，在病毒接種的第5、10、15、20、30天，恒河猴肺組織檢查可見間質(zhì)性肺炎，肺組織水腫、結(jié)構(gòu)破壞、出血，小血管玻璃樣變。30天后感染猴已經(jīng)出現(xiàn)肺纖維化?？傊愫雍锏牟±韺W改變與人類感染SARS冠狀病毒后出現(xiàn)的病理改變十分接近。

根據(jù)上述研究結(jié)果，秦川教授指出，恒河猴可作為SARS冠狀病毒感染的動物模型。其感染后出現(xiàn)的病理學改變、體液免疫應答和排毒現(xiàn)象均可作為SARS發(fā)病機制研究、有效治療藥物篩選、疫苗評價的重要指標。

小鼠感染新冠病毒能活多久

人冠狀病毒（hCoVs) 病原學涉及許多宿主，包括爬行動物、鳥、豬、狗、貓、牛、嚙齒動物、蝙蝠、駱駝和人。除了人外，hCoVs可通過動物與人之間的遷移過程，引起人畜共患病的發(fā)生。在過去15年里，包括2019發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒（SARS-CoV-2），已發(fā)現(xiàn)了7種hCoVs，比如OC43、NL-63、HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。一般認為，蝙蝠是所有冠狀病毒的天然宿主，然后通過中間宿主，引起hCoVs感染性疾病。比如，2003年的SARS-CoV（死亡率～10%）和2013年的MERS-CoV（死亡率～35%）兩種新型冠狀病毒，分別是通過中間宿主果子貍和駱駝，在全球引起嚴重急性呼吸道困難綜合癥的爆發(fā)流行。最近的SARS-CoV-2（死亡率約2～4%）已經(jīng)成為影響到141個國家地區(qū)的全球大流行。這些都再次表明，新型人傳人病毒感染性疾病的出現(xiàn)，已經(jīng)并將繼續(xù)對全球公共衛(wèi)生及經(jīng)濟造成潛在的巨大威脅與挑戰(zhàn)。因此，深入研究hCoVs與宿主分子相互作用機制，探討病毒致病過程，從而指導臨床治療、疫苗和藥物研發(fā)，將具有非常重要的意義。

hCoVs基因組（～30 kb) 的組成包括，編碼高度保守的16個非結(jié)構(gòu)性蛋白基因，hCoVs都含有的4種結(jié)構(gòu)蛋白基因，比如Spike(S)蛋白、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）、以及其他非保守的具有hCoVs特性的輔助蛋白基因。生化與體外培養(yǎng)研究已經(jīng)表明，hCoVs與宿主細胞表面蛋白間的相互作用，是確保病毒侵入宿主細胞與復制，引起機體免疫反應的基礎。研究已證實，S蛋白在多數(shù)hCoVs與宿主細胞受體相互作用中，發(fā)揮著重要的決定因素。S蛋白在病毒表面形成三聚體，其中每個單體都含有受體結(jié)合區(qū)（RBD），該RBD能與宿主細胞表面同源受體發(fā)生相互作用，幫助病毒侵入細胞內(nèi)。有研究表明，hCoV的RBD與其相應的細胞受體結(jié)合具有物種特異性，比如對SARS-CoV和SARS-CoV-2來說，人ACE2已被證實為其宿主細胞上相應的結(jié)合受體，而不能與蝙蝠ACE2受體結(jié)合；同樣，bSARS-CoV(蝙蝠冠狀病毒）也只與其相應的bACE2受體結(jié)合，不與hACE2受體結(jié)合。并且發(fā)現(xiàn)，位于SARS-CoV的RBD中310～518氨基酸區(qū)域是決定hCoV結(jié)合其相應受體活性的最小受體結(jié)合域。而對于MERS-CoV，DPP4則是其宿主細胞表面的結(jié)合受體。

位于S蛋白中的RBD被認為是研發(fā)保護性抗體與疫苗的關鍵靶點，而其他高度保守區(qū)結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)蛋白，以及主要酶活性蛋白，也可作為廣譜抗hCoVs的有效治療靶點。另外，hCoVs中的那些非保守的輔助蛋白，則被認為在介導宿主免疫反應的種屬致病特異性方面，發(fā)揮了決定性作用。

SARS-CoV、SARS-CoV-2和MERS-CoV三種hCoVs引起的疾病臨床表現(xiàn)都有嚴重急性呼吸道疾病的癥狀，包括彌漫性肺泡損傷與透明膜形成、肺泡纖維沉積、水腫、出血、細胞碎片、肺泡與間質(zhì)性炎癥及肺組織壞死等臨床表現(xiàn)。因此，研究該類hCoVs感染疾病有效的小鼠模型，至少需要小鼠在受到病毒攻擊后，表現(xiàn)出和hCoVs感染疾病相似的病理變化，且能引起嚴重致死性呼吸道疾病。

二、 應用小鼠模型研究

SARS-CoV感染致病性有哪些策略與方法？

根據(jù)小鼠構(gòu)建策略與方法不同，目前SARS-CoV感染小鼠模型分為三種：1. 應用人SARS-CoV病毒直接感染近交系小鼠；2. 應用基因編輯小鼠技術(shù)，敲除小鼠相關基因，或?qū)⑷怂拗骷毎《窘Y(jié)合受體（比如ACE2）轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)；3. 將野生型SARS-CoV病毒在小鼠體內(nèi)進行反復適應進化過程，獲得致病性更強的小鼠適應病毒，從而建立能引起明顯臨床表型的病毒感染小鼠模型。關于SARS-CoV感染疾病小鼠模型，主要的研究進展集中于以下幾個方面：

直接應用近交系小鼠模型研究病毒致病性

最早開展SARS-CoV感染小鼠模型的研究，是直接在近交系BALB/c小鼠上進行的。在年輕BALB/c小鼠（4-6周）鼻腔里感染SARS-CoV臨床株(Urbani)的實驗發(fā)現(xiàn)，小鼠上/下呼吸道出現(xiàn)病毒復制現(xiàn)象，第3天達高峰，到第7天被清除。但小鼠體重持續(xù)增加，沒有出現(xiàn)任何相關的臨床癥狀。幼鼠被注射免疫血清后，其呼吸道出現(xiàn)明顯抵抗病毒復制的作用，提示人SARS-CoV可以誘導小鼠產(chǎn)生有效的體液免疫反應。另外，也有應用年輕C57BL/6小鼠（5-6周）進行類似的實驗，結(jié)果如同BALB/c小鼠一樣，伴隨體重緩慢增加的同時，也有小鼠的上/下呼吸道以及大腦的病毒復制現(xiàn)象，而在SARS-CoV感染患者中，還未見該病毒在大腦中有復制現(xiàn)象。所以，這種只有病毒復制，但缺乏致病作用的所謂感染小鼠模型，很難有效準確用于評估干預治療效果等方面的研究。

由于SARS-CoV感染人群造成病死率的增加，與年紀較大的患者（大于60歲）發(fā)生嚴重急性呼吸道困難綜合癥（ARDS）的增加有關，為了探討能模擬老年人感染SARS-CoV更適合的小鼠模型，有研究分別應用12-14月大的BALB/c、C57BL/6和129S6近交系野生小鼠進行實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此三種老年小鼠經(jīng)SARS-CoV感染后，都有短暫（平均約7天左右）的臨床癥狀表型，比如體重減少、亂的毛發(fā)、弓背和脫水等，更為重要的是，在組織病理學方面，表現(xiàn)有血管周圍和細支氣管周圍炎性細胞滲入，細支氣管細胞壞死，以及間質(zhì)性肺炎發(fā)生等現(xiàn)象。而且，BALB/c小鼠的廣泛肺泡破壞可持續(xù)到第9天，非常接近人SARS-CoV感染的臨床病理癥狀。該研究也是第一次闡明了不同宿主遺傳及年齡特征，可以顯著影響SARS-CoV感染致病性強弱，同時也再次表明，病毒感染性疾病的發(fā)生，不僅與病毒本身特性有關，宿主自身相關因素也發(fā)揮極為重要的作用。

應用基因編輯技術(shù)建立病毒感染疾病小鼠模型

直接應用SARS-CoV臨床分離株感染野生小鼠和免疫缺陷小鼠模型，都不能引起小鼠感染死亡?？赡艿脑蚴?，與人群比較，這些小鼠對SARS-CoV易感性較低，或人病毒對小鼠致病性較弱等有關。因此，應用基因編輯技術(shù)，建立對SARS-CoV易感的小鼠模型，已經(jīng)成為當前該研究領域更加關注的研究方向。關于基因編輯小鼠模型構(gòu)建的基本策略與方法可參考我在中國實驗動物信息網(wǎng)中的相關專訪資料（ /Category_2287/Index.aspx）。

最早應用基因敲除小鼠模型，研究先天性免疫缺陷小鼠發(fā)現(xiàn)，這些小鼠常常會出現(xiàn)體重減輕，并伴隨有進行性惡化肺部疾病的表現(xiàn)。比如Stat1基因敲除小鼠，在受到SARS-CoV臨床分離株感染后，病毒復制3天達高峰，并持續(xù)至22天，且可出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，雖然不是所有的病理變化都與人的一樣，但一些病理特征卻與人感染SARS-CoV后常見的臨床特癥相似，比如伴有嚴重呼吸上皮細胞壞死的細支氣管損傷等。而野生對照小鼠則只表現(xiàn)有下呼吸道病毒復制，無相關肺部疾病表型。因此，經(jīng)過基因編輯的小鼠模型比野生型小鼠對SARS-CoV感染更易感，而且表現(xiàn)出更接近SARS-CoV感染患者呼吸道的臨床病變。

目前已經(jīng)證明，SARS-CoV是通過S蛋白中RBD與細胞受體人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（hACE2) 結(jié)合啟動入侵。該hACE2基因位于X性染色體上，表達于人上皮細胞及血管內(nèi)皮細胞，廣泛表達于人包括胃腸道、心臟、腎、肺、肝和骨骼肌等多個組織器官，且具有在人睪丸高表達的特點。因此，成功構(gòu)建能表達hACE2受體的基因編輯小鼠，已被證實是更能有效被SARS-CoV感染，引起小鼠呼吸道明顯的病理改變的解決策略與方法。同時也表明，相比于小鼠自身ACE受體，hACE2受體對人SARS-CoV臨床分離株S蛋白RBD的結(jié)合更加有效。

關于hACE2遺傳修飾人源化小鼠模型的構(gòu)建策略，目前通常應用不同的組織特異性或廣泛表達啟動子與hACE2基因構(gòu)建的表達載體，通過原核注射的方法，獲得隨機插入的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，比如，細胞角蛋白（上皮細胞特異性表達-K18）啟動子；CAG啟動子（廣泛表達）或小鼠ACE2基因啟動子。應用這些ACE2人源化小鼠模型的研究結(jié)果表明，hACE2的表達水平高低與其疾病的嚴重程度直接相關。雖然，這些小鼠模型都表現(xiàn)有呼吸道上皮細胞感染，但同時在小鼠腦部也可見高表達的hACE2基因，并在SARS-CoV感染模型中發(fā)現(xiàn)，病毒量在小鼠腦部的增加與廣泛擴散，最終導致小鼠發(fā)生腦炎而死亡。

雖然，關于SARS-CoV感染ACE2人源化小鼠后，小鼠為什么最終會因為相關神經(jīng)系統(tǒng)損傷而死亡，而不是如同人感染后因嚴重肺部組織損傷導致死亡的原因，目前尚無很好的解釋，也許這就是人們常強調(diào)的物種間的差異吧。但是，成功構(gòu)建對人SARS-CoV易感的ACE2人源化小鼠模型，無疑有助于SARS-CoV致病機制，以及評價疫苗與藥物安全性及有效性等方面的研究。

應用適應實驗進化方式獲得SARS-CoV變異強毒株

通過將病毒種植在小鼠特異性組織中，進行適應進化，迫使病毒適應其特定生存環(huán)境，并在特定的選擇壓力下發(fā)生突變，以達到更有利于其有效復制的目的。為了讓SARS-CoV適應在野生小鼠肺部復制，并引起嚴重急性呼吸道疾病表型， 研究者通過對BALB/c小鼠（6周齡）鼻腔反復接種SARS-CoV臨床株15次,直到野生小鼠出現(xiàn)明顯的人感染SARS-CoV的臨床癥狀（比如體重下降等）。

在小鼠肺部感染反復傳代15次后的適應病毒被稱為MA15病毒株，應用該適應株MA15病毒感染不同周齡的野生BALB/c小鼠，肺部出現(xiàn)高滴度病毒量與病毒血癥，并擴散至肺外組織等；表現(xiàn)體重快速下降，淋巴細胞減少，中性白細胞增多，以及與肺炎相關的組織病理改變。最后，由于病毒大范圍復制，導致小鼠肺細胞與上皮細胞壞死。分析該毒力增強型MA15病毒的變化發(fā)現(xiàn)，與原始SARS-CoV臨床分離株比較，雖然MA15病毒株只發(fā)生了6個編碼氨基酸的突變，但卻能分別導致4周齡，6-8周齡和老年BALB/c小鼠100%的致死率。后來的研究也證實，該MA15病毒株也可引起其他野生小鼠品系（比如C57BL/6) 的感染及死亡。在MA15基礎上進一步感染適應傳代，目前已經(jīng)分別獲得MA20和MA25相應毒力的致死病毒株。通過比較不同傳代獲得的適應致死病毒株，有助于分析病毒引起嚴重呼吸道致病毒力的變化與其蛋白特定突變間的相互關系，為進一步研究特異性SARS-CoV蛋白適應性突變在病毒宿主間作用聯(lián)系提供了方便。

應用協(xié)同交配（Collaboratory Cross-CC）技術(shù)建立遺傳背景多樣性小鼠品系

關于建立CC小鼠品系的策略與方法，可參考我在中國實驗動物信息網(wǎng)“小鼠模型在研究病毒感染性疾病中的應用”內(nèi)容。應用CC小鼠品系建立SARS-CoV感染模型，有助于尋找在病毒致病過程中，是哪些遺傳相關影響因素，決定了宿主對病毒感染性疾病的不同反應。通過用SARS-CoV感染CC小鼠后，分析比較不同表型的CC品系小鼠，比如體重減少的高與低，或病毒滴度的高與低等，達到快速確定與表型相關基因的目的。

利用CC小鼠技術(shù)，有研究者從SARS-CoV感染致病過程中，尋找到對病毒敏感性完全相反的CC小鼠品系（CC003和CC053/Unc)，基因定位分析發(fā)現(xiàn)，在Toll樣受體信號通路中的適配體蛋白Ticam2，是決定嚴重呼吸道疾病表型的潛在關鍵因子?；谶@類研究的結(jié)果表明，CC小鼠可作為更加客觀模擬人病毒感染疾病臨床表型的一種新型小鼠模型。

三、應用小鼠模型研究MERS-CoV致病性有哪些策略與方法？

研究者們在利用MERS-CoV直接感染野生小鼠時發(fā)現(xiàn)，以前對SARS-CoV感染/復制相對易感的野生小鼠品系，對MERS臨床分離株完全不易感，只有非人靈長類(NHPs)動物對MERS-CoV易感。進一步研究發(fā)現(xiàn)，免疫缺陷小鼠也對該病毒不易感，說明該病毒感染與宿主免疫反應限制可能沒有直接關系。

同時在研究MERS-CoV感染細胞的結(jié)合受體二肽基肽酶（DPP4）時發(fā)現(xiàn)，不同于SARS-CoV病毒S蛋白中RBD可與小鼠ACE2受體相互作用，小鼠DPP4受體并不支持與MERS-CoV病毒中S蛋白相互作用。分析MERS-CoV病毒S蛋白與人DPP4受體相互作用的晶體結(jié)構(gòu)進一步表明，在與MERS-CoV 的S蛋白中RBD結(jié)合過程中，人DPP4受體中某些特異氨基酸組成發(fā)揮了決定性作用，而對應位置上的小鼠DPP4氨基酸組成（比如A288和T330）與人是不同的。更為重要的是，與其他包括人、NHPs、蝙蝠和駱駝等易感物種同源DPP4不同的是，小鼠DPP4中獨特的T330位氨基酸N-糖基化位點，有可能成為空間上阻礙了MERS-CoV感染小鼠的原因。另外，雪貂和豚鼠的DPP4也含有類似的糖基化位點，這也間接解釋了為什么這兩種小動物對MERS-CoV不感染的可能原因。目前，關于MERS-CoV感染疾病小鼠模型的研究進展如下。

基因編輯DPP4人源化小鼠模型

最早構(gòu)建DPP4人源化小鼠模型，是通過直接注射能短暫表達人DPP4受體的腺病毒至野生小鼠肺部來實現(xiàn)的。結(jié)果表明，短暫表達人DPP4的小鼠對MERS-CoV易感，且引起病毒在肺部復制，并伴隨輕度肺炎以及短暫的體重減少，在老齡和免疫缺陷的小鼠中表現(xiàn)更加明顯。雖然，沒有見到嚴重呼吸道疾病癥狀及死亡現(xiàn)象，但應用該策略構(gòu)建特殊Ad-hDPP4小鼠模型，對于新型未知病毒出現(xiàn)時，實現(xiàn)快速評估針對MERS-CoV感染肺部病毒復制的抑制干預治療對策，提供了簡便實用的方法。 當然，在明確相應治療對策是如何防治嚴重呼吸道疾病過程的機制方面，此類小鼠模型的構(gòu)建方法，則存在明顯的局限性。

與SARS-CoV構(gòu)建遺傳修飾小鼠模型的策略與方法相似，為了構(gòu)建與感染MERS-CoV病人臨床表型相關的小鼠模型，應用基因編輯技術(shù)，將人DPP4基因?qū)胄∈篌w內(nèi)，使小鼠全身過表達人DPP4基因。比如，有研究者選用CAG廣泛表達啟動子建立的人DPP4轉(zhuǎn)基因小鼠模型，該小鼠經(jīng)MERS-CoV感染后，其肺部出現(xiàn)高滴度的病毒量，并引起嚴重呼吸道疾病癥狀及死亡。但同時也發(fā)現(xiàn)，小鼠其他組織器官包括腦、心、脾、腎和小腸等，也見有高滴度的病毒量，并出現(xiàn)多器官損傷的表型。而且，小鼠腦部的病毒量也顯著高于肺部的病毒量，并在小鼠感染的第9天出現(xiàn)病毒性腦炎，表現(xiàn)為癱瘓癥狀。

也有研究者應用組織特異性啟動子，建立上皮細胞特異性表達人DPP4的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，比如應用細胞角蛋白（K18）或表面活性C蛋白（SPC）啟動子。應用SPC啟動子表達人DPP4小鼠經(jīng)MERS-CoV感染后，并不引起小鼠死亡，或呼吸道疾病癥狀。相反，K18啟動子表達人DPP4的小鼠感染MERS-CoV后，體重下降，肺出血，并在第6-7天死亡。肺部的病理表現(xiàn)符合嚴重呼吸道疾病特征。不幸的是，這種小鼠模型，表型不僅會出現(xiàn)在肺部，也出現(xiàn)在腦部，表現(xiàn)為神經(jīng)疾病相關癥狀。

相對以上的基因編輯小鼠策略，再生元（Regeneron）公司應用其獨特的VelociGene技術(shù)，將整個小鼠DPP4基因組區(qū)域（～79 kb) 替換成人DPP4基因組區(qū)域 (～82 kb) ，但保留小鼠DPP4基因的5’內(nèi)源性啟動子和3’ RNA終止的非翻譯區(qū)域，這樣插入的人DPP4基因的表達則與小鼠DPP4基因表達水平和組織分布相一致。該定點插入性人源化DPP4小鼠經(jīng)MERS-CoV感染后，可引起明顯的體重下降與死亡。該感染小鼠肺部病理學表明，小鼠產(chǎn)生中等程度的呼吸道感染癥狀，伴有少部分的嚴重呼吸道疾病癥狀。該研究結(jié)果第一次顯示，CD8 T細胞和巨噬細胞在MERS-CoV致病過程中，發(fā)揮了顯著作用。更加重要的是，MERS-CoV感染/復制主要集中在小鼠肺部，只有少量肺外組織有病毒入侵，且無小鼠腦部損傷。因此，相比于全身過表達或組織特異性表達人DPP4的隨機插入的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，該種定點插入DPP4基因的人源化小鼠模型，更能準確模擬MERS-CoV感染患者急性呼吸道疾病的臨床特征。

也有研究者提出，無論是人DPP4基因的隨機還是定點插入修飾，需要考慮這類DPP4人源化小鼠模型自身的局限性，因為先天DPP4本身就有物種特異性，且具有參與多種特定生理過程的作用。比如，DPP4參與了許多細胞因子和趨化因子的修飾過程，而這些相關因子對維持免疫球蛋白穩(wěn)定狀態(tài)，具有至關重要的作用。所以，經(jīng)基因修飾的DPP4小鼠有可能明顯改變了小鼠原本DPP4所具有的生物學和免疫學特征，從而人為改變MERS-CoV感染的病理結(jié)果以及評價治療策略的免疫學反應。

因此，為了避免基因修飾過程可能對小鼠DPP4基因功能造成的影響，也有研究者應用CRISPR/Cas9技術(shù)，對小鼠DPP4基因中兩個關鍵氨基酸（A288L和T330R）進行修飾，成功構(gòu)建了MERS-CoV感染DPP4點突變的最新小鼠模型。分析該DPP4點突變小鼠模型表明，該小鼠表現(xiàn)出正常內(nèi)源性DPP4基因的表達特征及其生理學功能（比如糖代謝和T細胞激活等）。該DPP4點突變小鼠經(jīng)MERS-CoV臨床株感染后，雖可出現(xiàn)肺部高滴度病毒復制現(xiàn)象，但無臨床疾病癥狀的出現(xiàn)。另外，最近也有將小鼠DPP4基因的10-12外顯子區(qū)域替換（KI）成人DPP4相應區(qū)域基因組，成功構(gòu)建DPP4基因的部分定點修飾的KI人源化小鼠模型。該種DPP4 KI人源化小鼠模型比再生元的人源化小鼠模型的修飾區(qū)域要小，但比DPP4點突變小鼠模型修飾程度大。研究表明，該DPP4 KI人源化小鼠對MERS-CoV臨床株易感，出現(xiàn)肺部病毒復制，但無呼吸道疾病癥狀。

就目前而言，有觀點認為，小鼠需要表達完整的人DPP4基因（比如再生元公司策略），才能在受到MERS-CoV臨床株攻擊后，建立感染死亡的病毒感染小鼠模型。通過隨機過表達人DPP4基因，或者點突變/定點插入替換部分小鼠DPP4基因等方法，難以真正模擬感染MERS-CoV的患者臨床特征，并有可能破壞了小鼠原有存在的免疫學平衡，從而增加了分析該病毒感染疾病的病原學，以及相關防治對策的的難度。

MERS-CoV小鼠適應進化獲得強毒株病毒

在DPP4點突變小鼠基礎上，應用病毒適應實驗進化方法，在DPP4點突變小鼠中傳代15次后獲得適應株MERS-CoV，再用該適應株病毒感染DPP4點突變小鼠，可引起小鼠呼吸道功能喪失、嚴重急性呼吸困難綜合癥的病理變化、并導致小鼠死亡。進一步的研究分析表明，該小鼠模型中出現(xiàn)的嚴重呼吸道疾病與死亡，可以通過針對MERS-CoV S蛋白的疫苗及相應的抗體療法，得到預防與治療。且在小鼠大腦中檢測不到任何病毒。 然而，需要強調(diào)的是，構(gòu)建該種病毒感染小鼠模型，仍然需要高濃度的適應株MERS-CoV (比如5x10 6PFU)。為了降低病毒用量，對已傳代15次的適應株MERS-CoV，再繼續(xù)20次傳代適應，最終獲得傳代35次的毒力較高的小鼠適應株MERS-CoV，從而降低了DPP4點突變感染小鼠模型的病毒的使用量（10 3-10 5PFU）。而DPP4 KI人源化小鼠，經(jīng)過傳代31次的小鼠適應株MERS-CoV感染后，出現(xiàn)嚴重呼吸道疾病癥狀且死亡。適應小鼠MERS-CoV強力株的相關分析發(fā)現(xiàn)，病毒S蛋白上第222位氨基酸的突變，可能在該病毒毒力增強中起了關鍵作用。

MERS-CoV感染的CC小鼠模型

研究者認為，MERS-CoV感染的最理想小鼠模型，是直接應用臨床分離株感染未經(jīng)任何基因修飾的小鼠，并能引起臨床病人相似的急性嚴重呼吸道癥狀。也許直接應用CC小鼠品系是合適的選擇。比如，有研究者將DPP4點突變小鼠與CC小鼠品系交配，或者直接對CC小鼠品系進行相應的基因編輯，以確保基因修飾小鼠的DPP4內(nèi)源性表達、分布和功能不受影響，同時小鼠還具有遺傳背景多樣性的特征，從而有助于篩選對MERS-CoV臨床分離株差異敏感性的小鼠品系。然而，不同于SARS-CoV，目前的研究表明，CC小鼠對MERS-CoV也不敏感。

四、如何應用人冠狀病毒小鼠模型評價抗病毒治療效果？

構(gòu)建小鼠模型的最終目的，是準確找到能真實反映hCoVs 感染疾病的病原學，并在此基礎上，評價某一種疾病針對性的預防與治療方法是否有效。雖然已經(jīng)有不少對hCoVs 的潛在藥物、抗體和疫苗等相關預防治療進行評估的研究，但是到目前為止，還沒有FDA批準的專門治療SARS-CoV或MERS-CoV的相關藥物與疫苗。各種廣譜抗病毒藥物聯(lián)合應用，結(jié)合干擾素療法（alpha或beta)， 或者相關免疫調(diào)節(jié)劑（比如腎上腺皮質(zhì)激素）的治療，對SARS-CoV和MERS-CoV效果不佳，有時候還可能會加重該類病毒感染疾病的嚴重程度。

最近，抗hCoVs 新藥瑞德西韋（GS-5734，藥品名Remdesivir）的研究表明，瑞德西韋是一種小分子核苷酸類似物，有抑制RNA合成酶的作用。該藥在NHPs（比如恒河猴）動物實驗中，顯示出抗Ebola和MERS-CoV感染的作用，目前已進入臨床試驗階段。另外，在人氣道上皮細胞的進一步實驗也證實，該藥對多種人冠狀病毒（SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV和NL63等），以及新興的蝙蝠冠狀病毒（HKU3、HKU5、SCH014和WIV），都有較為廣譜的抗病毒效果。重要的是，小鼠體內(nèi)研究表明，如果GS-5734是預防性使用，或在感染后24小時給藥，該藥能抑制SARS-CoV引起的免疫病理改變。但如果感染后48小時再用藥，則失去緩解疾病癥狀的效果。雖然，小鼠與人之間的SARS-CoV致病動力學會有不同，但這些結(jié)果提示，病毒感染后，引起的呼吸系統(tǒng)免疫病理學變化，出現(xiàn)在非常短的窗口期內(nèi)，這也使藥物發(fā)揮效果的窗口期相應縮短了。

另外，再生元研究者應用前面介紹的DPP4人源化小鼠模型，對抗MERS-CoV S蛋白的人源化單克隆抗體的抗病毒作用進行了研究，結(jié)果表明，該單抗在MERS-CoV感染DPP4小鼠前一天，或感染后一天治療，都表現(xiàn)有明顯抑制病毒復制的作用。

有效的治療方法不僅能防止病毒復制，更加重要的是，還能有效限制呼吸系統(tǒng)的病理變化。要想實現(xiàn)這樣的治療干預策略，必須是通過抗hCoVs 治療與改善宿主免疫力相結(jié)合的療法，從而達到抑制急性呼吸道困難癥狀引起的免疫病理變化的目的。

五、如何應用小鼠模型研究SARS-CoV-2感染的新冠病毒肺炎？

無論是核酸還是氨基酸序列比較分析都證實，SARS-CoV-2與SARS-CoV的相似性非常高 （分別約為80%和76%），而且SARS-CoV-2也是通過細胞表面的ACE2受體與宿主發(fā)生相互作用，引起與SARS-CoV感染相似（雖然不是完全相同）的嚴重急性呼吸道困難綜合癥等臨床表現(xiàn)。因此，上面介紹的針對SARS-CoV感染的相關小鼠模型構(gòu)建策略與方法，也適合于SARS-CoV-2感染小鼠模型的建立。需要提醒的是，已報道的通過基因編輯技術(shù)構(gòu)建的SARS-CoV感染疾病小鼠模型，都是采用相應啟動子，隨機導入hACE2基因的策略實現(xiàn)的，而該種轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建策略的不足也是顯而易見的（可參考我在中國實驗動物信息網(wǎng)中的相關專訪資料 /Category_2182/Index.aspx）。這也許與該類hACE2轉(zhuǎn)基因出現(xiàn)的某些難以解釋的疾病癥狀表現(xiàn)有關，比如出現(xiàn)嚴重神經(jīng)系統(tǒng)損傷癥狀，且成為小鼠感染致死的原因。而我們也知道，對于SARS-CoV感染病人來說，出現(xiàn)嚴重呼吸道功能衰竭則應該是誘發(fā)死亡的主要原因。雖然，目前也有COVID-19患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)嚴重損傷（比如急性腦血管疾病、意識障礙和骨骼肌癥狀等）的報道。而對于SARS-CoV-2感染病人，現(xiàn)也有人認為，出現(xiàn)嚴重呼吸道功能損傷后，由嚴重的細胞因子風暴（比如IL-6顯著升高等），引起的多器官功能衰竭（比如心腎功能衰竭等）可能是COVID-19致死的主要原因。因此，選擇合適的更能反映人病毒感染性疾病臨床特征的小鼠模型構(gòu)建策略，就顯得相當重要了。比如，將hACE2基因以定點插入/替換小鼠自身ACE2基因的方式，構(gòu)建與小鼠內(nèi)源性ACE2表達水平與組織特性相似的ACE2人源化小鼠模型。

目前，國內(nèi)已有研究者，首先應用hACE2啟動子介導，以隨機插入的方式，在ICR小鼠背景上成功構(gòu)建了可表達hACE2的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，初步的研究結(jié)果表明，該小鼠在受到SARS-CoV-2臨床分離株（HB）感染后，可表現(xiàn)明顯的肺部炎癥等病理變化。另外，也見國內(nèi)其他研究者，通過應用高滴度SARS-CoV-2（比如～10 7 PFU) 直接攻擊野生小鼠，引起病毒成功感染的初步研究結(jié)果。

賽業(yè)生物作為提供遺傳修飾模式動物技術(shù)服務的全球?qū)I(yè)化商業(yè)平臺，也正在根據(jù)目前研究SARS-CoV-2感染性COVID-19的需要，努力研發(fā)更好更適合的hACE2基因修飾的人源化小鼠模型，希望能為生物醫(yī)藥研究領域的研究者們，提供可供SARS-CoV-2感染致病機制研究，以及疫苗與藥物研發(fā)等選擇的理想小鼠模型。

綜上所述，病毒通常是首先通過與細胞受體結(jié)合而發(fā)揮其致病作用，然而，人病毒感染人細胞受體與小鼠的細胞受體往往是不同，并且，人與小鼠的先天免疫應答反應也存在一定差異。因此，多數(shù)情況下，小鼠對能感染人的病毒不易感。也就是說，應用小鼠模型來研究人病毒感染存在物種間差異。所以，應用成熟的基因編輯技術(shù)，對小鼠基因組進行有目的的改造，可以從某種程度上克服人與小鼠間的物種差異。

在探索人病毒感染性疾病過程中，小鼠模型在揭示病毒是如何引起病理改變，以及機體免疫反應等相關機制方面，發(fā)揮著重要的作用。并且，小鼠模型也是評價疫苗、抗病毒藥物臨床前安全性與有效性驗證等方面的首選實驗動物模型。

其實，在過去漫長的生物界自然進化過程中，我們可以發(fā)現(xiàn)，人類與病毒之間的關系，就是一種持續(xù)不斷的相互戰(zhàn)爭、相互改變、以及相互完善的進化發(fā)展過程。相信，以后我們的關系也還會繼續(xù)如此。

非典疫苗研制用了多少時間

中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所、北京科興生物制品有限公司和中國醫(yī)科院實驗動物研究所組成的聯(lián)合課題組于4月底展開的滅活疫苗的研制工作
。在確定了用于疫苗研制的毒株，找到有效的病毒滅活方法后，現(xiàn)已為靈長類恒河猴接種了實驗性疫苗。
2004年1月，取得國家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的SARS病毒滅活疫苗臨床研究批件。
2004.05.23首次進行人體實驗。前后經(jīng)歷約1年。

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