靶向蛋白酶：成功、失敗與前景（完）

靶向蛋白酶：成功、失敗與前景（完）

許多新的蛋白酶抑制劑目前正在開發(fā)之中，至少有50種不同的蛋白酶被考慮作為潛在的靶標(biāo)。許多靶標(biāo)是采用動物模型確定的，尤其是嚙齒動物基因敲除模型，然后用于篩選抑制劑。

腎素抑制劑治療高血壓

腎素是與激活血管緊張素原產(chǎn)生血管緊張素I有關(guān)的天冬氨酸蛋白酶。腎素抑制可能優(yōu)于腎素-血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制，因為腎素對單一底物具有特異性，因此可能引起的副作用較少。

不過，早期的腎素抑制劑是底物類似物，易于很快降解，生物利用度較低。Zankiren屬于肽轉(zhuǎn)換態(tài)類似物抑制劑，首次在一些動物模型中顯示能改善蛋白分解的穩(wěn)定性和生物利用度，并且在人體也顯示很好的療效。但是，最新一代的腎素抑制劑是非肽類的。目前，美國Speedel公司與諾華公司已經(jīng)共同開發(fā)出Alkanecarboxamide Aliskiren（SPP100）。Aliskiren作為單一治療或聯(lián)合治療藥物的III期試驗數(shù)據(jù)早在2005年9月就已透露，可有效阻滯腎素-血管緊張素原系統(tǒng)使得血壓降低，安全性與終末器官保護(hù)的結(jié)果亦顯示出很好效果。諾華公司已于今年4月向美國FDA遞交了Aliskiren的新藥申請書。

Speedel公司還從羅氏公司獲得了另一個腎素研究計劃。羅氏公司過去集中研究過3-烷氧基-4-芳基-哌啶及其進(jìn)一步的最優(yōu)化，其中一種化合物——3,4,5-三元哌啶Ro66-1132能有效地降低表達(dá)人腎素和血管緊張素原基因的雙轉(zhuǎn)基因工程實驗鼠的血壓，減輕終末器官損害。2005年10月，Speedel公司宣稱，兩種抑制劑（SPP630和SPP635）對上述的雙轉(zhuǎn)基因工程實驗鼠模型的臨床前研究和志愿者的微劑量試驗已獲成功，顯示出很好的生物利用度和半衰期。SPP635在2005年10月進(jìn)入I期臨床試驗。

DPPIV抑制劑用于2型糖尿病

2型糖尿病是一種重要的消耗性疾病，由葡萄糖動態(tài)平衡異常引起。在20世紀(jì)80年代后期，腸促胰島素（Incretins），包括胰高血糖素樣肽1（GLP1）和糖依賴性胰島素釋放肽（GIP）被確定為能降低血糖水平的激素，成為糖尿病治療的潛在靶標(biāo)。人們也發(fā)現(xiàn)，在試管中和體內(nèi)GLP1和相關(guān)肽能迅速被絲氨酸氨基肽酶DPPIV（CD26）降解，這提示DPPIV抑制劑具有潛在的治療價值。

最近，有一些DPPIV抑制劑處于后期臨床試驗之中。維格列?。╒ildagliptin，LAF237）的III期臨床試驗顯示，患者耐受性很好，沒有體重增加，血糖明顯降低。今年3月，諾華公司已經(jīng)遞交了維格列汀的新藥申請書。

目前在開發(fā)的其他DPPIV抑制劑包括默克公司的西他列汀（Sitagliptin，MK-0431）。在臨床前研究中，人們發(fā)現(xiàn)這種非共價的可逆抑制劑能選擇性地拮抗其他相關(guān)的蛋白酶，顯示出良好療效。該藥2004年進(jìn)入III期試驗，今年2月，默克公司遞交了西他列汀的新藥申請書。正在研究的另一種可逆非共價抑制劑是Probiodrug公司開發(fā)的一些化合物，其中一種（P93/01）處于II期臨床試驗之中。此外，共價可逆的DPPIV抑制劑Saxagliptin也正在進(jìn)行III期臨床試驗，II期臨床研究顯示良好的選擇性和口服生物利用度。

組織蛋白酶K與骨質(zhì)疏松癥

組織蛋白酶K是一種溶酶體半胱氨酸組織蛋白酶，主要位于破骨細(xì)胞，是涉及骨質(zhì)再吸收的主要酶。最近的臨床數(shù)據(jù)表明，組織蛋白酶K抑制劑優(yōu)于現(xiàn)有的骨質(zhì)疏松癥治療藥物（包括二磷酸鹽），因為它們不僅能防止骨質(zhì)丟失，而且還允許骨再生。組織蛋白酶K抑制劑的開發(fā)較早，但非常困難，因為在涉及底物和抑制劑識別的關(guān)鍵殘基中種類特異性變異，導(dǎo)致這類化合物對嚙齒動物和人體中靶標(biāo)的親和力有極大的不同。鑒于人組織蛋白酶K與靈長類動物之間的高度類似，葛蘭素史克公司的研究人員研究出一種獼猴模型，用于組織蛋白酶K抑制劑的實驗。

現(xiàn)在有幾種組織蛋白酶抑制劑處于臨床試驗之中：一種是由諾華公司開發(fā)的AAE581和AFG-495；一種是由葛蘭素史克公司開發(fā)的SB-462795；另一種是由默克公司與Celeraw公司聯(lián)合開發(fā)的未泄露名稱的抑制劑，可能與CRA-013783化合物相似。其中最新的藥物是AAE581，為一種肽腈，在試管中對人組織蛋白酶K高度特異，對組織蛋白酶K的選擇性比其他組織蛋白酶大1000倍。在140例每天一次接受治療的絕經(jīng)后婦女中進(jìn)行的II期臨床試驗表明，AAE581成功地降低了膠原的分解和骨的再吸收，未報告副作用。諾華公司最近正在為今年開始的III期臨床試驗征集患者。

MMP抑制劑開發(fā)新策略

開發(fā)金屬蛋白酶（MMP）抑制劑治療癌癥和關(guān)節(jié)炎早期的失敗意味著大多數(shù)公司對新MMP抑制劑的開發(fā)興趣受到嚴(yán)重挫傷，他們開始轉(zhuǎn)向靶向MMP用于其他適應(yīng)證的可能性。

CollaGenex制藥公司已經(jīng)集中研究改良的非抗生素強(qiáng)力霉素衍生物。Perios-tat（多西環(huán)素）是MMP的一種廣譜抑制劑，美國FDA1998年批準(zhǔn)將其用于治療牙周疾病，目前正在進(jìn)行III期臨床試驗用于慢性成人牙周炎。CollaGenex公司最近已經(jīng)遞交了另一種強(qiáng)力霉素衍生物Oracea的新藥申請書，這是口服、全身釋藥治療紅斑痤瘡的首個藥物。CollaGenex公司還宣稱，另一項Incyclinide治療痤瘡的II期臨床研究也獲得了肯定結(jié)果。

目前，科研人員也正在研究MMP抑制劑用于治療血管病、心肌梗死、卒中、急性肺損傷和慢性阻塞性肺?。–OPD）等其他疾病，但大多處于臨床研究前期。

其間，癌癥的治療并未完全被忘記。法國圣母瑪利亞大學(xué)的一個小組已經(jīng)開發(fā)出一種新的對白明膠酶（MMP2和MMP9）特異的基于環(huán)硫乙烷型機(jī)制的MMP抑制劑。該藥雖然具有較低的水溶性，但能增加T細(xì)胞淋巴瘤侵襲型實驗鼠模型的生存，同時也能挽救暫時性大腦局灶性缺血模型的神經(jīng)元，顯示出良好的治療潛力。最近報告，新的選擇性MMP抑制劑的可溶性得到了改進(jìn)。

蛋白酶作為生物標(biāo)記物

由于蛋白酶在疾病中的表達(dá)不同，所以蛋白酶及其抑制劑可用作早期診斷的標(biāo)記物，在癌癥診斷中尤其如此。例如，絲氨酸蛋白酶血纖維蛋白溶酶原激活劑及其抑制劑PAI1就是與乳腺癌最相關(guān)的診斷與預(yù)兆標(biāo)記物，現(xiàn)在也應(yīng)用于一些其他類型的癌癥。另一個是絲氨酸蛋白酶血管舒緩素3，即PSA（前列腺特異性抗原），其作為前列腺癌的主要診斷標(biāo)記物已經(jīng)有數(shù)年時間了。

新近，半胱氨酸組蛋白酶也顯示可作為癌癥相關(guān)的生物標(biāo)記物。此外，人們還發(fā)現(xiàn)蛋白酶可作為寄生蟲感染的診斷標(biāo)記物，例如發(fā)現(xiàn)半胱氨酸蛋白酶克魯茲蛋白酶（Cruzipain，蛋白質(zhì)CA族的一員），是查格斯病枯氏錐蟲的主要免疫原蛋白。

從目前進(jìn)行后期臨床試驗的新化合物和到2006年為止遞交美國FDA針對蛋白酶靶標(biāo)的新藥申請數(shù)量來判斷，預(yù)期在未來的幾年中，以蛋白酶為靶標(biāo)的抑制劑將迅速增長，治療的主要領(lǐng)域可能仍然是心血管、炎癥和傳染病領(lǐng)域，另外，針對癌癥和神經(jīng)退變性疾病的應(yīng)用將可能增加。

蛋白質(zhì)從哪里產(chǎn)生

蛋白質(zhì)生物合成過程：
1．氨基酸的活化與搬運(yùn)：氨基酸的活化以及活化氨基酸與tRNA的結(jié)合，均由氨基酰tRNA合成酶催化完成。反應(yīng)完成后，特異的tRNA3’端CCA上的2’或3’位自由羥基與相應(yīng)的活化氨基酸以酯鍵相連接，形成氨基酰tRNA。
2．活化氨基酸的縮合——核蛋白體循環(huán)：活化氨基酸在核蛋白體上反復(fù)翻譯mRNA上的密碼并縮合生成多肽鏈的循環(huán)反應(yīng)過程，稱為核蛋白體循環(huán)。核蛋白體循環(huán)過程可分為三個階段：
⑴起動階段：①30S起動復(fù)合物的形成。在IF促進(jìn)下，30S小亞基與mRNA的起動部位，起動tRNA（tRNAfmet），和GTP結(jié)合，形成復(fù)合體。②70S起動前復(fù)合體的形成。IF3從30S起動復(fù)合體上脫落，50S大亞基與復(fù)合體結(jié)合，形成70S起動前復(fù)合體。③70S起動復(fù)合體的形成。GTP被水解，IF1和IF2從復(fù)合物上脫落。
⑵肽鏈延長階段：①進(jìn)位：與mRNA下一個密碼相對應(yīng)的氨基酰tRNA進(jìn)入核蛋白體的受位。此步驟需GTP，Mg2+，和EF參與。②成肽：在轉(zhuǎn)肽酶的催化下，將給位上的tRNA所攜帶的甲酰蛋氨?；螂孽；D(zhuǎn)移到受位上的氨基酰tRNA上，與其α-氨基縮合形成肽鍵。給位上已失去蛋氨?；螂孽；膖RNA從核蛋白上脫落。③移位：核蛋白體向mRNA的3'- 端滑動相當(dāng)于一個密碼的距離，同時使肽?；鵷RNA從受體移到給位。此步驟需EF（EFG）、GTP和Mg2+參與。 此時，核蛋白體的受位留空，與下一個密碼相對應(yīng)的氨基酰tRNA即可再進(jìn)入，重復(fù)以上循環(huán)過程，使多肽鏈不斷延長。
⑶肽鏈終止階段：核蛋白體沿mRNA鏈滑動，不斷使多肽鏈延長，直到終止信號進(jìn)入受位。①識別：RF識別終止密碼，進(jìn)入核蛋白體的受位。②水解：RF使轉(zhuǎn)肽酶變?yōu)樗饷福嚯逆溑ctRNA之間的酯鍵被水解，多肽鏈釋放。③解離：通過水解GTP，使核蛋白體與mRNA分離，tRNA、RF脫落，核蛋白體解離為大、小亞基。
真核生物翻譯起始的特點：
1.真核起始甲硫氨酸不需甲?；?br>2.真核mRNA沒有S-D序列，但5'端帽子結(jié)構(gòu)與其在核蛋白體就位相關(guān)。帽結(jié)合蛋白（CBP）可與mRNA帽子結(jié)合，促進(jìn)mRNA與小亞基結(jié)合。
3.肽鏈的延長 ：延長階段為不斷循環(huán)進(jìn)行的過程，也稱核蛋白體循環(huán)。分為進(jìn)位、成肽和轉(zhuǎn)位三個步驟。
三、多肽鏈合成后的加工修飾：
1．一級結(jié)構(gòu)的加工修飾：
⑴N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除：N端甲酰蛋氨酸是多肽鏈合成的起始氨基酸，必須在多肽鏈折迭成一定的空間結(jié)構(gòu)之前被切除。其過程是：① 去甲酰化；② 去蛋氨酰基。
⑵氨基酸的修飾：由專一性的酶催化進(jìn)行修飾，包括糖基化、羥基化、磷酸化、甲?；?。
⑶二硫鍵的形成：由專一性的氧化酶催化，將-SH氧化為-S-S-。
⑷肽段的切除：由專一性的蛋白酶催化，將部分肽段切除。
2．高級結(jié)構(gòu)的形成：
⑴構(gòu)象的形成：在分子內(nèi)伴侶、輔助酶及分子伴侶的協(xié)助下，形成特定的空間構(gòu)象。
⑵亞基的聚合。 ⑶輔基的連接。
3．靶向輸送：蛋白質(zhì)合成后，定向地被輸送到其執(zhí)行功能的場所稱為靶向輸送。大多數(shù)情況下，被輸送的蛋白質(zhì)分子需穿過膜性結(jié)構(gòu)，才能到達(dá)特定的地點。因此，在這些蛋白質(zhì)分子的氨基端，一般都帶有一段疏水的肽段，稱為信號肽。分泌型蛋白質(zhì)的定向輸送，就是靠信號肽與胞漿中的信號肽識別粒子（SRP）識別并特異結(jié)合，然后再通過SRP與膜上的對接蛋白（DP）識別并結(jié)合后，將所攜帶的蛋白質(zhì)送出細(xì)胞。
信號肽假說：信號肽位于新合成的分泌蛋白N端。對分泌蛋白的靶向運(yùn)輸起決定作用。①細(xì)胞內(nèi)的信號肽識別顆粒（SRP）識別信號肽，使肽鏈合成暫時停止，SRP引導(dǎo)核蛋白體結(jié)合粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜；②SRP識別、結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的對接蛋白,水解GTP使SRP分離，多肽鏈繼續(xù)延長；③信號肽引導(dǎo)延長多肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔后，經(jīng)信號肽酶切除。分泌蛋白在高爾基體包裝成分泌顆粒出胞。

簡述真核生物中分泌型蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和主要的生理功能.

分泌型蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑:
首先在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,由mRNA和2個核糖體亞基組成復(fù)合物,經(jīng)翻譯得到蛋白原,經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運(yùn)輸(同時,對蛋白質(zhì)進(jìn)行多種修飾和加工),到高爾基體后,對蛋白質(zhì)進(jìn)行最后的糖基化修飾,并形成膜泡,向細(xì)胞膜運(yùn)輸,至膜表面后,膜泡與細(xì)胞膜融合,將蛋白質(zhì)分泌到胞外.
主要的生理功能有:
1.執(zhí)行抗體功能,如:IgA等分泌型抗體,在支氣管的黏液層,執(zhí)行抗體功能
2.激素功能,如:人生長激素,為蛋白質(zhì)類激素,由垂體分泌
3.消化酶,如:胰腺的外分泌部,分泌胰蛋白酶原,當(dāng)運(yùn)到小腸內(nèi)后被激活,表現(xiàn)分解蛋白質(zhì)的活性

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