靶向蛋白酶：成功、失敗與前景（二）

鑒別和確認(rèn)蛋白酶靶標(biāo)

了解健康與病變中蛋白酶信號(hào)的一個(gè)關(guān)鍵是鑒別蛋白酶的內(nèi)生底物，目前已經(jīng)應(yīng)用許多方法來(lái)達(dá)到這一目的，計(jì)算生物學(xué)、遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)展也為其提供了有力手段。例如，通過(guò)采用噬菌體展示庫(kù)、組合熒光底物庫(kù)或基于共價(jià)抑制劑的位置掃描庫(kù)，一旦確定蛋白酶的擴(kuò)展底物特性，就可以在基因組范圍的基礎(chǔ)上獲得生物信息學(xué)知識(shí)，根據(jù)已確定的蛋白酶底物特性來(lái)發(fā)現(xiàn)潛在的底物。

底物搜索的遺傳途徑通常是采用經(jīng)典的基因敲除動(dòng)物模型、RNA干擾（RNAi）技術(shù)。在靶標(biāo)確認(rèn)中應(yīng)用的另一種方法往往是動(dòng)物模型與經(jīng)典的蛋白酶基因敲除動(dòng)物模型的結(jié)合。這種方法已經(jīng)用于研究半胱氨酸組織蛋白酶在不同癌細(xì)胞模型（例如Rip1-Tag2實(shí)驗(yàn)鼠胰島腫瘤模型）中的作用。

蛋白質(zhì)組學(xué)這一工具非常適合于鑒定和確認(rèn)潛在的蛋白酶靶標(biāo)。一些蛋白酶底物最近已經(jīng)用這種方法確定，包括MMP底物和顆粒酶B底物。

蛋白酶活性的調(diào)節(jié)

蛋白酶活性是在轉(zhuǎn)錄水平受不同表達(dá)調(diào)控的，在蛋白質(zhì)水平受無(wú)活性酶原的激活和抑制劑及輔因子的結(jié)合調(diào)控。

活性調(diào)節(jié)的基本機(jī)制存在于大多數(shù)的蛋白酶中。潛在的蛋白酶原等待一個(gè)激活的信號(hào)，這種信號(hào)可能來(lái)自變構(gòu)激活體或者其他的蛋白酶。一旦激活后，底物和抑制劑競(jìng)爭(zhēng)與蛋白酶的結(jié)合。蛋白酶活性也受到輔因子的調(diào)控，蛋白質(zhì)往往是以變構(gòu)的方式可逆地與蛋白酶和/或抑制劑結(jié)合，影響其最終活性。蛋白酶活性的其他重要調(diào)控物是它們內(nèi)生或外生的抑制劑。一種抑制劑可以抑制幾種蛋白酶，如所有金屬肽鏈內(nèi)切酶（180種以上）的主要抑制劑僅由4種蛋白質(zhì)組成：金屬蛋白酶的組織抑制劑1（TIMP1）、TIMP2、TIMP3和TIMP4。

迄今為止，在靶向蛋白酶信號(hào)的一些途徑中，對(duì)蛋白酶進(jìn)行抑制的探索最為廣泛。除了直接阻滯靶標(biāo)蛋白酶的活性外，蛋白酶抑制劑也阻滯下游蛋白酶的激活，或者與輔因子聯(lián)合影響蛋白酶的活性。

直接抑制

大分子 在血液凝固領(lǐng)域已經(jīng)開發(fā)出一些以蛋白酶為靶標(biāo)的新型大分子抑制劑。

第一個(gè)例子是水蛭素的衍生物，這是一種從醫(yī)用水蛭中提純的強(qiáng)力可逆的凝血酶抑制劑，被批準(zhǔn)作為抗凝血?jiǎng)┕┡R床應(yīng)用。第二個(gè)是來(lái)自犬鉤口線蟲的重組線蟲類抗凝血?jiǎng)┑鞍祝╮NAP）。據(jù)報(bào)告，rNAP具有令人滿意的安全性，在一項(xiàng)IIa臨床試驗(yàn)中，治療急性冠脈綜合征（ACS）患者，劑量達(dá)10克/千克體重時(shí)耐受性良好。

從大豆分離出來(lái)的Bowman-Birk抑制劑濃縮物是幾種絲氨酸蛋白酶抑制劑的混合物，它主要具有糜蛋白酶抑制活性，也有一些胰島素的抑制活性，幾年前的II期臨床試驗(yàn)已表明其治療口癌有肯定效果。

另一種大分子抑制劑是人源性抗體。雖然對(duì)以蛋白酶為靶標(biāo)的抑制性抗體研究處于早期階段，但已有一些這類藥物處于臨床前和早期臨床開發(fā)中，包括尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）和組織蛋白酶B的抑制性抗體用于癌癥的治療，組織因子的抑制性抗體用于廣泛的血栓性疾病的治療，VIIIa因子抑制性抗體用于靜脈血栓癥的治療。

小分子

發(fā)現(xiàn)蛋白酶抑制藥物的主要成就仍然是在小分子抑制劑上。通常，將虛擬篩選、基于結(jié)構(gòu)的篩選和化合物小型集中庫(kù)的篩選結(jié)合起來(lái)進(jìn)行篩選。

開發(fā)可逆還是不可逆的抑制劑是發(fā)現(xiàn)蛋白酶藥物要考慮的重要因素之一。可逆的抑制劑，尤其是選擇性好的可逆抑制劑可能僅部分阻滯其他蛋白酶的活性。但不可逆的抑制劑，根據(jù)結(jié)合動(dòng)力學(xué)不同，遲早會(huì)阻滯它能結(jié)合的所有蛋白酶。已開發(fā)的一些不可逆的抑制劑就存在這種選擇性問(wèn)題。理想的抑制劑應(yīng)是非共價(jià)的可逆抑制劑——通常能提供更好的選擇性，引起的副作用要比共價(jià)抑制劑少。不過(guò)，非共價(jià)抑制劑的設(shè)計(jì)要困難得多。迄今為止，已經(jīng)開發(fā)出為數(shù)不多的非共價(jià)可逆抑制劑，有些已經(jīng)上市，例如絲氨酸蛋白酶抑制劑阿加曲班(Argatroban)，有些則仍處于早期實(shí)驗(yàn)階段。

生物利用度也是蛋白酶抑制劑最優(yōu)化的關(guān)鍵問(wèn)題之一。對(duì)于在動(dòng)物模型中可以觀察到良好的生物利用度，而在人體上則不能重復(fù)這一難題，解決的一個(gè)策略是設(shè)計(jì)能在體內(nèi)轉(zhuǎn)換成活性代謝物的前體藥物，比如ACE抑制劑主要就是作為酯前體藥物設(shè)計(jì)的。

蛋白酶藥物設(shè)計(jì)的另一個(gè)考慮因素是，抑制劑是競(jìng)爭(zhēng)性還是非競(jìng)爭(zhēng)性的。除了第一種抗蛋白酶治療藥物肝素——血凝蛋白酶的一種變構(gòu)間接抑制劑以外，目前應(yīng)用或開發(fā)的所有其他蛋白酶抑制劑都是競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。由于采用的活性實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單，發(fā)現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑通常較容易。但這種途徑也有缺陷，例如，競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑可以引起底物競(jìng)爭(zhēng)的飽和，必須要應(yīng)用相當(dāng)高的藥物劑量，安全窗狹窄。

雖然開發(fā)要困難得多，但變構(gòu)小分子抑制劑對(duì)拮抗許多蛋白酶可能有用。最近Sunesis制藥公司完成了一項(xiàng)突破，開發(fā)出第一種變構(gòu)半胱天冬酶抑制劑。

上調(diào)蛋白酶

在一些情形中，上調(diào)蛋白酶的活性可能是必須的，要達(dá)到這一目的，策略之一是阻滯內(nèi)生蛋白酶抑制劑的活性。美國(guó)伯納姆研究所的一個(gè)小組應(yīng)用基于聚苯基脲架構(gòu)的化合物來(lái)拮抗蛋白質(zhì)的凋亡抑制劑（IAP），由于它能抑制半胱天冬酶的活性，因此能刺激癌細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞培養(yǎng)的初期研究表明，其對(duì)癌細(xì)胞具有明顯的凋亡作用和很好的選擇性，包括能增強(qiáng)其他化療藥物的敏感性。此外，這類化合物在腫瘤異種移植物的實(shí)驗(yàn)鼠模型中也有效，未顯示毒性。

阻滯內(nèi)生蛋白酶抑制劑的另一條途徑是運(yùn)用反義分子。Aegera Therapeutics公司最近宣稱，已開始AEG35156的I期臨床試驗(yàn)——這是X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)的第二代反義寡核苷酸抑制劑，能促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。單克隆抗體也可能具有潛力，新上市的抗血纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑1（PAI1）單克隆抗體33H1F7顯示，能將活性PAI1轉(zhuǎn)換成組織型纖溶酶原激活劑（tPA）的底物，從而促進(jìn)實(shí)驗(yàn)鼠腸系膜動(dòng)脈模型的的溶栓治療。

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