美發(fā)現(xiàn)肺癌化療藥物產(chǎn)生耐藥性機(jī)制

美發(fā)現(xiàn)肺癌化療藥物產(chǎn)生耐藥性機(jī)制

據(jù)中國醫(yī)藥報(bào)訊 美國約翰·霍普金斯大學(xué)的研究人員日前發(fā)現(xiàn)了抑制人體NRF2基因等“脫毒”基因、進(jìn)而導(dǎo)致肺癌化療抗性的機(jī)制。這項(xiàng)研究的結(jié)果刊登在10月3日出版的《公共科學(xué)圖書館·醫(yī)學(xué)》(PLoSMedicine)雜志上。

約翰·霍普金斯Bloomberg公共衛(wèi)生學(xué)院和Kimmel癌癥中心的助理教授Shyam Biswal博士等人發(fā)現(xiàn)，由NRF2基因編碼的產(chǎn)物通常能夠保護(hù)細(xì)胞不受環(huán)境污染物如香煙煙霧和油煙侵害，它能吸收并將這些物質(zhì)“泵”出細(xì)胞。它還能促使細(xì)胞排出有害化合物。另外一個被稱為KEAP1的基因編碼的產(chǎn)物能夠中止這種清理過程。但是肺癌細(xì)胞能破壞后者的表達(dá)，從而產(chǎn)生抵抗化療藥物攻擊腫瘤細(xì)胞的作用。

這項(xiàng)研究探索了肺癌細(xì)胞如何破壞KEAP1的表達(dá)來幫助腫瘤細(xì)胞逃避化療藥物對其攻擊的過程。他們發(fā)現(xiàn)，NRF2基因能夠編碼一種啟動蛋白質(zhì)——它能啟動另外一些能清除毒素的蛋白質(zhì)和酶的制造。為了中止脫毒過程，由KEAP1基因編碼的蛋白質(zhì)能夠與NRF2基因制造的這種啟動蛋白質(zhì)結(jié)合，并將它們標(biāo)記成需要摧毀的蛋白質(zhì)。在肺癌細(xì)胞中，NRF2基因的活性異?；钴S，它能將所有細(xì)胞毒素清除掉，包括化療藥物。Biswal表示，抑制NRF2基因的活性可能改善現(xiàn)有化療藥物的療效，尤其是廣泛用于治療肺癌的含鉑化合物。

在Biswal的研究中，6個肺癌細(xì)胞系和54個非小細(xì)胞肺癌患者組織樣本中的10個樣本都攜帶突變的KEAP1基因。這種突變使該基因失活，使其無法控制NRF2基因產(chǎn)生的脫毒過程。另外，其中一半的組織樣本中丟失了KEAP1基因的一個拷貝，而這些患者的正常肺臟組織中沒有出現(xiàn)基因拷貝的丟失或突變。NRF2的活性和它編碼的“清毒”蛋白和酶的活性在腫瘤樣本中要比正常的細(xì)胞中高。細(xì)胞培養(yǎng)檢測也顯示，攜帶突變的KEAP1基因的癌細(xì)胞對化療藥物的抵抗性比正常肺細(xì)胞的要強(qiáng)。而攜帶正常KEAP1基因的腫瘤樣本也表現(xiàn)出NRF2基因表達(dá)增強(qiáng)了，這表明了存在分解KEAP1基因的其他途徑，如對該基因進(jìn)行拼接來產(chǎn)生較短的、無活性的蛋白質(zhì)。

接下來，研究人員打算在更大的樣本分析試驗(yàn)中驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，然后篩選合適的抗癌新藥物。

腫瘤細(xì)胞對產(chǎn)生烷化劑耐藥性的可能機(jī)制有

【答案】：A、B、C、D、E
本題考查烷化劑的作用特點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞對此類藥的耐藥性產(chǎn)生，是由于自身DNA修復(fù)功能、限制化療藥進(jìn)入細(xì)胞、增加化療藥從細(xì)胞中排出、細(xì)胞內(nèi)滅活藥物和DNA受損后缺乏細(xì)胞凋亡機(jī)制等原因所致。故正確答案為ABCDE。

如何構(gòu)建耐藥細(xì)胞株？

腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是腫瘤治療失敗的重要因素之一，成為目前阻礙腫瘤治療的絆腳石。因此，探索腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的原因以及如何改善腫瘤細(xì)胞對化療藥物耐藥仍是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

腫瘤細(xì)胞耐藥的產(chǎn)生是一個復(fù)雜的過程，它的機(jī)制廣泛牽涉到藥物代謝學(xué)、病理學(xué)、生理學(xué)等多個學(xué)科，這就決定了腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥的機(jī)制是復(fù)雜的，因此體外建立化療藥物耐藥細(xì)胞株仍然是研究腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制的重要方法。

一種藥物長期作用于某類細(xì)胞，殺死其中沒有抗性的細(xì)胞，而對這類細(xì)胞中具有抗性的細(xì)胞不能殺死，即進(jìn)行了選擇。具有抗性的細(xì)胞大量繁殖產(chǎn)生很多抗性后代，但再用這種藥物時表現(xiàn)出的藥效大大下降的現(xiàn)象就是細(xì)胞的耐藥性，采用體外低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對特定藥物產(chǎn)生耐藥性，從而構(gòu)建出對特定藥物產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細(xì)胞株。

細(xì)胞與低劑量的藥物長期接觸，引起細(xì)胞本身藥物化學(xué)過程的改變，細(xì)胞膜上出現(xiàn)Pgp糖蛋白，使細(xì)胞逐漸對藥物耐受，隨著藥物濃度的遞增，其耐受程度逐漸加強(qiáng)。

耐藥細(xì)胞株構(gòu)建方法

A.檢測親本細(xì)胞株的IC50

IC50(half maximal inhibitory concentration),即半抑制濃度,指某一種物質(zhì)對某些生物程序抑制達(dá)到50%抑制效果時的濃度。對細(xì)胞增殖方面,可以理解為對細(xì)胞增殖的抑制效果達(dá)到細(xì)胞正常增殖水平50%時的藥物濃度。通常用IC50來衡量藥物對細(xì)胞的毒性或者細(xì)胞對藥物的耐受能力,在藥物實(shí)驗(yàn)中,常用IC50來評估實(shí)驗(yàn)中使用的藥物濃度。IC50的計(jì)算方法很多,常用的有Excel、graphpad prism、SPSS等。

B.藥物濃度遞增法/大劑量藥物沖擊法

1) 大劑量藥物沖擊法： 將處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞（匯合度60%-80%）置于含有濃度的藥物濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，更換不含藥物培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞恢復(fù)生長，培養(yǎng)一段時間后重復(fù)上述操作，將篩選出的細(xì)胞在一定濃度的藥物濃度培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)依這樣不斷改變作用時間，共經(jīng)過1h、2h、4h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h共10個作用時間段，約6-8個月的培養(yǎng)，最終使得細(xì)胞能夠在一定濃度的藥物的培養(yǎng)液中持續(xù)穩(wěn)定生長并傳代，然后脫藥培養(yǎng)1個月在檢測細(xì)胞的生物特性及耐藥指標(biāo)。

大劑量藥物沖擊法優(yōu)點(diǎn)是與臨床上大劑量化療藥物沖擊的治療方式相接近，但是缺點(diǎn)在于大劑量藥物沖擊法的藥物濃度很高，細(xì)胞培養(yǎng)由于外環(huán)境驟變，細(xì)胞可能難以耐受，細(xì)胞狀態(tài)較難控制，且耐藥性能不穩(wěn)定。

2) 藥物濃度遞增法： 取處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞（匯合度60%-80%），加入起始濃度為低濃度（建議為親本細(xì)胞株的IC50的1/10-1/5）的藥物作用24h，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2遍，更換不含藥物培養(yǎng)基，細(xì)胞恢復(fù)生長后，消化傳代復(fù)以低濃度作用細(xì)胞24h，待細(xì)胞增殖至正常形態(tài)后，重復(fù)上述藥物沖擊，每種濃度沖擊6-8次。待細(xì)胞在此濃度穩(wěn)定生長后，提高藥物濃度繼續(xù)培養(yǎng)，藥物依次遞增濃度加藥。藥物誘導(dǎo)歷時6-8個月，直到細(xì)胞能夠在濃度的藥物中穩(wěn)定生長。

藥物濃度遞增法優(yōu)點(diǎn)在于誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞的藥物劑量循序漸進(jìn)，細(xì)胞培養(yǎng)的外環(huán)境逐漸改變，細(xì)胞較易耐受，狀態(tài)較好，缺點(diǎn)在于誘導(dǎo)耐藥過程耗時很長，且其化療藥物的作用方式與臨床上化療藥物大劑量短療程的化療原則存在一定的差異；

C.檢測耐藥細(xì)胞株的IC50　 　

檢測耐藥細(xì)胞株的IC50，根據(jù)IC50值計(jì)算出耐藥指數(shù)（resistanceindex, RI），RI=耐藥細(xì)胞系的IC50/親代細(xì)胞系的IC50，RI>5則認(rèn)為耐藥細(xì)胞系的耐藥性符合耐藥株的要求。

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