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       首頁 >> 中醫(yī)基礎(chǔ)常識 >> 雜談
    
      

      


      
    
      
        
      雙參通冠方血清藥理研究有新發(fā)現(xiàn)
      
        
      
            醫(yī)案日記
            2023-06-19 21:03:50
        
      

        
      
           
      日前
      ，中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院科研人員，以中藥有效組分配伍方劑雙參通冠方不同灌胃劑量
      、藥后不同取血時間所得的“藥物血清”為受試藥物
      ，進(jìn)行缺氧復(fù)氧實驗，摸索出了在中藥血清藥理研究中
      ，作用強度與體內(nèi)給藥量效
      、時效的關(guān)系，使中藥含藥血清藥理研究向規(guī)范化
      、標(biāo)準(zhǔn)化方向更進(jìn)一步
      。
      中藥血清藥理學(xué)研究方法是以含藥血清在體外的藥理效應(yīng)來反映藥物在機體內(nèi)的作用，它與含藥血清中的藥物濃度直接相關(guān)
      。中藥含藥血清藥理研究的規(guī)范化
      、標(biāo)準(zhǔn)化依賴于其方法學(xué)研究的不斷發(fā)展
      。近年來
      ，在中藥含藥血清藥理研究方法上進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究
      ，其中，藥物血清的時效、量效關(guān)系是研究的重要部分
      。
      科研人員以有效組分配伍方劑雙參通冠方（人參
      、丹參
      、延胡索）不同灌胃劑量、藥后不同取血時間所得的藥物血清為受試藥物
      ，進(jìn)行缺氧復(fù)氧實驗，并在復(fù)氧同時給予不同雙參通冠方藥物血清處理
      ，實驗結(jié)束后取培養(yǎng)上清檢測乳酸脫氫酶（LDH）值
      ，以LDH釋放抑制率為指標(biāo)，觀察含藥血清藥理作用強度與體內(nèi)給藥的量效
      、時效關(guān)系。
      雙參通冠方藥物血清的時效
      、量效關(guān)系研究結(jié)果表明
      ，45毫克·千克-1/90分鐘
      、45毫克·千克-1/120分鐘
      、90毫克·千克-1/30分鐘、90毫克·千克-1/90分鐘
      、180毫克·千克-1/60分鐘
      、180毫克·千克-1/90分鐘
      、360毫克·千克-1/90分鐘的藥物血清抑制缺氧復(fù)氧心肌LDH釋放作用最佳
      ，與空白血清相比具統(tǒng)計學(xué)差異(P
      在對含藥血清的量效關(guān)系研究中，研究人員認(rèn)為
      ，如果把含藥血清作為一種藥物來看待
      ，那么，藥量的大小主要取決于兩個方面:一是動物的給藥量
      ，在一定范圍內(nèi)
      ，動物給藥劑量越多
      ，進(jìn)入血循環(huán)的藥物就越多
      ，血藥濃度就高
      ，因而所取含藥血清的體外藥理效應(yīng)就越強
      ；二是培養(yǎng)體系或反應(yīng)體系中的含藥血清濃度(體積比)
      ，血清濃度愈高則藥量愈大
      。含藥血清的量效是由動物給藥量和血清濃度共同決定的
      ，由于培養(yǎng)體系中血清濃度的增減是十分有限的(血清濃度過高會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用
      ，在研究含藥血清抑制細(xì)胞增殖或促細(xì)胞凋亡作用時，有可能得出假陽性結(jié)果)
      ，所以
      ，相對固定含藥血清濃度
        ，通過改變動物給藥量來調(diào)整藥物血清的含藥量
        ，是一種較為現(xiàn)實的辦法。
      中藥藥理的最新進(jìn)展
       常用單味中藥藥理研究是中藥藥理研究的重要內(nèi)容
        。仍以對整體動物藥理效應(yīng)觀察及對器官
        、組織
      、細(xì)胞的影響等為主，現(xiàn)代生物技術(shù)如分子生物學(xué)研究方法 也受到廣泛關(guān)注和應(yīng)用
      。研究的藥味相對集中
      ，以補益藥
      、活血化瘀藥居多，不少常用中藥的新藥理作用機理被揭示
      。
      冬蟲夏草 研究發(fā)現(xiàn)黃芪對自然衰老大鼠腦皮質(zhì)
      、海馬、紋狀體3個腦區(qū)降低的M膽堿受體和M1亞型受體密度有顯著的上調(diào)作用，并可調(diào)節(jié)老年大鼠血漿環(huán)核苷酸含量
      ；衰老大鼠心肌β受體密度及T3
      、T4、皮質(zhì)醇含量均降低
        ，黃芪、人參
        、枸杞子可升高之
        ；對肝硬化大鼠存在的下丘腦血管加壓素系統(tǒng)異常有改善作用；可以明顯提高腎病綜合征大鼠血漿白蛋白水平
        ，改善腎小球濾過率和尿鈉排泄
        ；對環(huán)磷酰胺所致免疫功能抑制小鼠細(xì)胞毒活性有顯著增強作用
        ，并可能 通過調(diào)控巨噬細(xì)胞C1q的分泌功能來增強免疫和抗腫瘤作用
        ；還發(fā)現(xiàn)黃芪煎劑及含黃芪小鼠血清均對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖
        、混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)及IL-2的產(chǎn)生有促進(jìn)作用。冬蟲夏草水提液能降低正常心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 的濃度
        ，減輕缺氧再給氧時細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載現(xiàn)象
        ，并明顯減輕缺氧再給氧時細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化
      。紅參在預(yù)防高血壓性視網(wǎng)膜動脈硬化起重要作用
      ，能使內(nèi)皮細(xì)胞膜的光整性、細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及內(nèi)皮細(xì)胞分泌各種血管舒縮 物質(zhì)保持正常，抑制平滑肌細(xì)胞的異常增生
      ，還有擴(kuò)張血管、減少外周阻力及調(diào)節(jié)血壓的作用
      。生地黃可明顯抑制皮質(zhì)酮致“陰虛”模型小鼠巨噬細(xì)胞Ia抗原的高水平表達(dá)
      ，降低其提呈抗原能力，從而表現(xiàn)出一定的免疫抑制作用
      。丹參注射液可明顯降低缺血再灌注引起的大鼠腦水腫
      ，減少腦皮層及海馬組織丙二醛含量
      ，提高過氧化氫酶
        、超氧化物歧化酶活性和還原型谷胱甘肽、三磷酸腺苷的含量
        。 復(fù)方是中醫(yī)用藥的主要形式
        ，以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)
      ，運用現(xiàn)代科學(xué)手段，對古方和現(xiàn)代經(jīng)驗方進(jìn)行多指標(biāo)的系統(tǒng)藥理研究
      ，可以在更深的層次揭示方劑的治療原理
      ，有效地指導(dǎo)臨床用藥和中藥新產(chǎn)品研創(chuàng)
      。中藥復(fù)方在藥效學(xué)
      、藥代動力學(xué)和分子藥理研究等方面取得了較好的進(jìn)展。
      藥理實驗 古方的藥理研究有數(shù)十首
      ，其中桂枝湯
      、六味地黃湯、四君子湯
      、四物湯
      、大承氣湯、補中益氣湯、當(dāng)歸補血湯等研究較多
      。在古方研究中較多地探討了方劑的作用機制
      ，給方劑的傳統(tǒng)功效描述賦予現(xiàn)代藥理學(xué)內(nèi)容。如桂枝湯可能通過影響興奮胃腸運動的胃泌素
      、胃動素
      、P物質(zhì)以及抑制胃腸運動的生長抑素、血管活性腸肽等在下丘腦和胃腸道中的含量來調(diào)節(jié)胃腸運動；桂枝湯對與呼吸道感染有關(guān)的10株病毒致細(xì)胞病變均有不同程度的抑制作用
      ，其含藥血清能抑制單純皰疹病毒等4株病毒對Hep-2細(xì)胞的增殖
      。當(dāng)歸補血湯含藥血清隨給藥劑量增加可使造血祖細(xì)胞集落數(shù)明顯增多
      。將六味地黃湯方視為一個整體
      ，以活性評價為導(dǎo)向
      ，從六味地黃湯中定向追蹤分離
      ，獲得了具有調(diào)節(jié)免疫功能的活性部位
      ，該部位對TH及TC的功能有調(diào)節(jié)作用
      。這些研究都在一定程度上說明了方劑的作用原理
      。經(jīng)驗方的藥理研究開展得更為廣泛，其研究內(nèi)容多結(jié)合新藥研究的有關(guān)要求
      ，著重于藥效及安全性評價
      ，不少方劑已經(jīng)或即將開發(fā)為新藥
      。
      配伍是中醫(yī)用藥的特點和優(yōu)勢所在
      ，用藥理研究方法觀察方劑配伍與藥理效應(yīng)變化之間的關(guān)系
      ，探討方劑的配伍規(guī)律
      ，仍然是復(fù)方藥理研究的重要內(nèi)容
      。雖然還是以方劑藥味加減 
      、正交設(shè)計等方法為主，但在應(yīng)用中也有明顯提高，采用一些新方法來更好地分析方劑的配伍問題
      。關(guān)于復(fù)方配伍規(guī)律的基礎(chǔ)研究99年納入國家自然科學(xué)基金重點研究 項目，強調(diào)運用高新技術(shù)手段探討方劑的物質(zhì)基礎(chǔ)
      ，綜合分析配伍-化學(xué)成分變化-藥理效應(yīng)三者之間的聯(lián)系
      ，闡明配伍內(nèi)涵，成為新的探索方向
      。生脈散復(fù)方化學(xué)動態(tài)變化與藥效關(guān) 系研究表明
      ，各藥配伍后藥效的變化可能與產(chǎn)生新物質(zhì)有關(guān)。以方劑的物質(zhì)基礎(chǔ)研究為核心
      ，注重方劑配伍理論與現(xiàn)代藥理交互作用理論結(jié)合
      ，物質(zhì)基礎(chǔ)分析與藥理效應(yīng)觀察相結(jié)合，從組成方劑的單味藥
      、方劑的化學(xué)部分以及化學(xué)成分三個層次探討方劑的配伍與物質(zhì)基礎(chǔ)的變化的關(guān)系
      ，在整體動物
      、器官組織
      、細(xì)胞亞細(xì)胞及分子生物學(xué)四個水平上探討方劑的配伍
      、物質(zhì)基礎(chǔ)的變化與藥理效應(yīng)間的聯(lián)系
      ，已成為復(fù)方配伍研究的基本思路。 中藥的品種
      、產(chǎn)地、采藥季節(jié)
        、貯藏條件及劑量、劑型
        、給藥途徑等
        ，均對中藥作用的發(fā)揮有著顯著的影響。
      （1）中藥基原（原植物
        、動物和礦物）的影響
      中藥材絕大多數(shù)是中國自產(chǎn)的
        ，少數(shù)為移植或進(jìn)口的
      。在品種上，歷代本草著作中屢有增加
      。不少本草書指出了歷史上中藥品種的混亂情況
      。故對其進(jìn)行認(rèn)真的考證
      、分析
      、鑒定的工作
      ，是十分重要的
      。例如，中國用的貫眾
      、獨活
      、厚樸等中藥，就來源于20多種不同種屬植物
      ；同一中藥大青葉
        ，各地用的藥材又有不同
        ，有蓼科蓼蘭、十字花科松蘭
        、爵床科馬蘭
        、馬鞭草科大青等
        ，藥用部分也有用葉及帶葉莖枝的不同
        。而且
        ，同名異物的現(xiàn)象也很普遍
        。由于品種不清
        ，其化學(xué)成分的含量和藥理作用均有差異。
      （2）中藥產(chǎn)地及采集季節(jié)的影響
      人參 a) 中藥產(chǎn)地：藥材產(chǎn)地對藥物質(zhì)量和療效有著直接關(guān)系
      ，為歷代醫(yī)家所重視，自古即有“道地藥材”的講法。中藥之中大部分為植物藥
      ，自然生長環(huán)境具有一定的區(qū)域性
      ，各地區(qū)的土壤
      、水質(zhì)、氣候
      、雨量等自然條件都能影響藥用植物生長
      、開花
      、結(jié)果等一系列生態(tài)過程，特別是土壤成分更能影響中藥內(nèi)在成分的質(zhì)和量
      ?div   id="4qifd00"   class="flower right">
      ！?a href="/ddjy_99/221.html">神農(nóng)本草經(jīng)》記載的記載的“采造時月、生熟
      、土地所出
        、真?zhèn)?div   id="d48novz"   class="flower left">
      、陳新，并各有法”和《新修本草》說的：“離其本土
      ，則質(zhì)同而效異；乖于采摘
      ，乃物是而實非”
      。都很強調(diào)產(chǎn)地。產(chǎn)地不同，同一植物所含有效成分不完全相同
      ，從而使藥理作用有別
      ，臨床療效不穩(wěn)定
      。如長白山的野山參，東北各省與朝鮮
      、日本的園參，不但含人參總皂甙的量不同
      ，而不同皂甙單體的含量也不一樣
      。又如人參莖葉中皂甙含量在吉林省七個產(chǎn)地所得樣品
      ，含量差別相當(dāng)懸殊。不同產(chǎn)地及不同加工方法
      ，以人參提取物的得量也不同
      。
      b) 采收季節(jié)：不同植物的根莖
      、葉
      、花
      、果
      、種子或全草都有一定的生長和成熟期，故采藥時間的采收方式則隨著中藥的品種和入藥部位而有不同
      。中國幅員遼闊
      ，從寒帶至亞熱帶
      ，氣候差異很大
      ，故采藥時間按照當(dāng)?shù)亓?xí)慣因地制宜
      ，但要選擇藥用植物有交效萬分含量最高時采收。有效成分的含量隨不同生長季節(jié)及不同入藥部位而異
      ，如人參中皂甙以八月后含量最高，麻黃中生物堿秋季含量最高，槐花在花蕾時蘆丁含量最高
      ，青蒿中青蒿素的含量以七月中至八月中花蕾出現(xiàn)前為高峰
      ，應(yīng)在開花前采收，薄荷在部分植株開始有花蕾時
      ，揮發(fā)油含量大
      。古人采藥全憑經(jīng)驗
      ，《本草經(jīng)集注》序錄說：“凡采藥時月…… 其根物以二月
      、八月采者
      ，謂春初津液始萌
      ，未沖枝葉
      ，勢力淳濃故也；至秋枝葉干枯
      ，津液歸流于下…… ”《本草蒙筌》說：“實已熟，味純
      ；葉采新
      ，力倍
        ?div   id="m50uktp"   class="box-center">  ！币猿粑嗤┑慕笛獕鹤饔脼槔?div   id="jpandex"   class="focus-wrap mb20 cf">，在五月開花前采摘的葉
      ，對動物的降壓作用強
      ，開花后所采集的葉，降壓作用減弱
      。再以人參為例，季節(jié)變化對園參根中皂甙和糖分含量有顯著影響，故采收應(yīng)在6～9月
      ，而不應(yīng)在冬季。
      （3）藥用部位的影響：不同的藥用部位所含化學(xué)成分的質(zhì)和量都可能不同
      ，所以其藥理作用也不同
      。曾有人比較研究了各地所產(chǎn)白參
      、紅參的不同部位的人參皂甙含量
      ，發(fā)現(xiàn)有較大差異。又如麻黃生物堿的含量，以麻黃莖的髓部含量最高
        ，麻黃節(jié)中含量較少，而根中則不含生物堿
        。
      （4）貯藏條件的影響：《本草蒙筌》說：“凡藥貯藏
        ，宜常提防
        ，倘陰干曝干烘干未盡去濕
        ，則蛀蝕霉垢朽爛，不免為殃
      。”貯藏不當(dāng)
      ，要霉?fàn)€變質(zhì)、走油
      、蟲蛀
      ，會直接影響藥理作用和醫(yī)療質(zhì)量
      。所以要選擇適宜的堆放場所，加強倉庫管理工作
      ，注意特殊藥材的保管（如貴重藥材、芳香性及膠類藥材等）
      ，還要定期檢查，防治蟲害
      。貯藏不當(dāng)
      ，也可使含揮發(fā)油的藥材氧化
      、分解或自然揮發(fā)（如樟腦、冰片
      、麝香）而使藥效降低
      。有的成分會因存放時間長
        ，而被酶所分解等。
      （5）炮制的影響：炮制前后
        ，藥材的成分質(zhì)和量會有所變化，藥理作用和臨床療效可因之不同
        。《本草蒙筌》曾從臨床經(jīng)驗指出：“酒制升提
        ；姜制發(fā)散
        ；入鹽走腎而軟堅；用醋注肝而住痛；乳制潤枯生血
      ；蜜制甘緩益元……
      。”
      小鼠中藥炮制從以下一些方面影響藥理作用：
      ①減毒
      ，去毒
      。如半夏“生令人吐，熟令人下?div   id="4qifd00"   class="flower right">
      ！鄙胂膶ξ刚衬び袕姶蟮拇碳ぷ饔?div   id="4qifd00"   class="flower right">
      ，故致嘔吐；姜半夏卻顯示鎮(zhèn)吐作用
      。
      ②增效
      ，如杜仲含大量杜仲膠，生杜仲煎出的有效成分甚少
      ；炮制后則膠質(zhì)破壞，故炒杜仲煎劑降低血壓較生者為強
      。
      ③改變藥材成分的組成
      ，加強或突出某一作用
      。如生大黃主要有瀉下作用，炮制后的制大黃卻出現(xiàn)較強抗菌作用
      。
      ④改進(jìn)切制工藝
      ，增加藥效。藥材炮制加工過程
      ，可影響其內(nèi)在成分
      ，直接關(guān)系到其藥理反應(yīng)的性質(zhì)和強度
      。
      （6）劑型和制劑的影響：同一種中藥制成不同劑型，由于制造工藝和給藥途徑不同
      ，往往影響藥物的吸收和血液濃度
      ，直接關(guān)系到藥理作用的強弱
      ?div   id="d48novz"   class="flower left">
      ！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》指出“藥性有宜丸者
      ，宜散者
      ，宜水煮者
      ，宜酒漬者
      ，宜膏煎者
      ，亦有一物兼宜者，亦有不可入湯酒者
      ，并隨藥性，不得違越?div   id="jfovm50"   class="index-wrap">！闭f明古人早已注意到劑型對藥效的影響：如枳實或者青皮煎劑口服
      ，未見升高血壓記載，但制成注射劑靜脈注射
      ，卻出現(xiàn)強大的升壓作用
      。
      《本草經(jīng)集注》記載的“合藥分劑法則”，對藥衡
      、切制要求
      、劑型
      、制藥方法
      ，直至用蠟用蜜等，都有一定規(guī)定?div   id="d48novz"   class="flower left">
      ，F(xiàn)代制藥，要求更高
      ，同一中藥或復(fù)方
      ，即使劑量相等，劑型相同
      ，但臥于各藥廠生產(chǎn)制劑的工藝不同
      ，療效和毒性也往往有所區(qū)別。甚至同廠不同批號的產(chǎn)品
      ，也不盡相同。為了保證不伺批號不同藥廠的同名產(chǎn)品有相同的療效，應(yīng)當(dāng)采取一定措施加強質(zhì)量控制
      。制劑均按《中華人民共和國藥典》規(guī)定或各省市衛(wèi)生局批準(zhǔn)的藥品標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行
      。對指導(dǎo)中成藥制劑和統(tǒng)一產(chǎn)品的規(guī)格
      ，起到良好作用。 機體因素也是影響藥理作用重要因素
      ，它包括生理情況、病理狀態(tài)等
      。
      （1）生理情況的影響：體質(zhì)
      、年齡、性別
        、情志等
        ，對藥物的作用發(fā)揮
        ，影響甚大
        。中醫(yī)學(xué)很強調(diào)秉賦不同對藥效的影響
      。意指遺傳因素
      、身體素質(zhì)對抗病能力及藥物反應(yīng)，存在較大差異
      。臨床上也存在不同種族或不同個體
      ，對某藥的治療劑量相差多倍的現(xiàn)象。這種存于種屬或種族間的不同
      ，稱為種屬或種族差異
      ；存在于個體之間的差異，叫做個體差異
      。年齡不同，對藥物的反應(yīng)也不同
      。少兒期與老年人對藥物的反應(yīng)與一般成年人有區(qū)別
      。 少兒期正在發(fā)育階段
      ，許多器官
      、系統(tǒng)的發(fā)育尚未完善
        ，老年人肝腎功能普遍減退
        ，都會影響藥物的體內(nèi)代謝及排泄功能
        ，故用量應(yīng)適當(dāng)減少
        。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為老年人體虛，對藥物的耐受力較弱
        ，故用攻病法邪藥物時宜減量使用；幼兒稚陽之體不能峻補
        ，故小兒不宜用參
        、茸驟補
        。不同性別
        ，對藥物的反應(yīng)也有明顯差異
        ，婦女一方面因體重差異
      ，一方面由于激素的影響，對某些藥物的敏感性頗有不同
      。如定坤丹
      、調(diào)經(jīng)丸
      、烏雞白鳳丸適用于婦科
      ；而催吐藥
      、峻瀉藥則禁用于孕婦。情志、精神狀態(tài)對藥物的作用也有影響
      。所謂喜
      、怒
      、憂
      、思
        、悲、恐
        ，驚等七情對藥物作用的發(fā)揮，顯有影響。
      黃芩　 此外
        ，藥物的個體差異
      ，有量的和質(zhì)的兩種表現(xiàn)。既有藥理學(xué)上所謂高敏性
      、耐受性
      ；也有極個別病人對某種藥物發(fā)生的過敏反應(yīng)。如口服人參糖漿
      ，靜滴生脈液等
      ，都有過敏反應(yīng)的報道。
      （2）病理狀態(tài)的影響：病理狀態(tài)也可以影響藥物的作用
      ，例如黃芩、穿心蓮等藥
      ，對正常體溫并無降低作用
      ，只有發(fā)熱病人用后
      ，出現(xiàn)解熱作用。又如五苓散在實驗中對犬和小鼠不出現(xiàn)利尿作用，但對臨床上患有水腫
      、小便不利的病人，則具有利尿作用
      。肝腎患病
      ，功能減弱
      ，可以影響藥物體內(nèi)的代謝過程
      ，往往使藥物的作用時間延長
      。還有人工發(fā)熱動物模型所篩選出來的具有退熱作用的中藥
      ，臨床用于病人不夠滿意
      ，如穿心蓮
      ；也有一些清熱藥對病人甚效
      ，而實驗結(jié)果并不一定理想，如白虎湯
      。這也說明動物模型與人的疾病之間，還存在某些差異
      。 環(huán)境對藥物的影響
      ，也為眾所周知。例如地理條件
      、氣候寒暖、飲食起居
      、家庭環(huán)境
      、居住部位，都對人的健康有較大影響
      。人被環(huán)境影響精神不舒時
      ，可直接影響藥物的治療效果
      。一般在四肢運動時，腹腔內(nèi)臟的血流量減少
      ，這對一些腹部疾患的恢復(fù)是不利的
      。此外
      ，在肺部炎癥時
      ，如被迫過多勞動
      ，可使炎癥向周圍組織擴(kuò)散，病情惡化
      。
      根據(jù)生物活動表現(xiàn)的晝夜節(jié)律
      ，體溫、腎上腺素
      、皮質(zhì)激素分泌等的晝夜波動，常與外界環(huán)境的晝夜變化有關(guān)。藥物作用也?div   id="d48novz"   class="flower left">
      ；尸F(xiàn)此種晝夜節(jié)律
      ，例如附子、烏頭
      ，通過測定其所含烏頭堿量及參附注射液的急性毒性
      ，證實動物對其敏感性存在晝夜節(jié)律
      。烏頭堿的毒性午時（13點）最高（66．7%）；戌時最低（13．3%）
      ，兩組差異顯著
      。參附注射液靜脈注射
      ，子時LD50值為9．8629/kg
      ，午時為8．308/kg
      。又如雷公藤的醋酸乙酯提取物是一治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物
      ，于24小時內(nèi)按不同時辰，每4小時給小鼠分組給藥
      ，觀察給藥后一周內(nèi)的死亡率，發(fā)現(xiàn)其毒性具有明顯的時辰節(jié)律
      ，以中午12點給藥者死亡率最高
      ，20點至次晨8點給藥者死亡率最低
      。
      

      

          
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