沈陽藥大開展中藥指紋圖譜信息化研究

沈陽藥科大學藥學院孫國祥副教授、畢開順教授、董鴻曄教授等聯(lián)合申請的“中藥指紋圖譜在線專家系統(tǒng)研究”課題日前獲國家自然科學基金重大研究計劃面上項目資助。該項目是國家自然科學基金重大研究計劃“以網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)的科學活動環(huán)境研究”的子課題，將建立我國自主知識產(chǎn)權(quán)的中藥指紋圖譜在線專家系統(tǒng)技術(shù)平臺，使中藥指紋圖譜研究建立在網(wǎng)絡(luò)信息高速公路上，聚合中藥指紋圖譜研究成果，整合分析儀器設(shè)備，開發(fā)服務(wù)資源以節(jié)約人力、物力，避免重復性研究，提升中藥現(xiàn)代化速度。

該項目具體完成的指標是：中藥HPLC指紋圖譜在線專家系統(tǒng)；中藥氣相色譜指紋圖譜在線專家系統(tǒng)；中藥HPCE指紋圖譜在線專家系統(tǒng)；中藥TLC指紋圖譜在線專家系統(tǒng)；中藥光譜指紋圖譜在線專家系統(tǒng)；中藥X射線衍射指紋圖譜在線專家系統(tǒng)；中藥DNA指紋圖譜在線專家系統(tǒng)和中藥GAP基地在線專家系統(tǒng)的研究。

目前，孫國祥副教授和畢開順教授等已開發(fā)出“中藥指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評價系統(tǒng)”軟件，初步解決了中藥指紋圖譜定性評價和定量評價的關(guān)鍵性技術(shù)，并且他們所承擔的艾迪注射液、復方苦參注射液、射干抗病毒注射液、清熱解毒注射液指紋圖譜研究和中藥指紋圖譜相似度評價軟件等課題，已經(jīng)順利通過國家藥典委員會中藥注射劑指紋圖譜研究項目驗收工作，為率先進入中藥指紋圖譜信息化研究領(lǐng)域奠定了堅實的基礎(chǔ)。

中藥指紋圖譜的構(gòu)建方法

目前，中藥指紋圖譜技術(shù)已涉及眾多方法，包括薄層掃描（TLCS）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）和高效毛細管電泳法（HPCE）等色譜法以及紫外光譜法（UV）、紅外光譜法（IR）、質(zhì)譜法（MS）、核磁共振法（NMR）和X—射線衍射法等光譜法。其中色譜方法為主流方法，尤其是HPLC、TLCS和GC已成為公認的三種常規(guī)分析手段。由于HPLC具有分離效能高、選擇性高、檢測靈敏度高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等特點；中藥成分絕大多數(shù)可在高效液相色譜儀上進行分析檢測，且積累較豐富的應(yīng)用經(jīng)驗。因此高效液相色譜法已成為中藥指紋圖譜技術(shù)的首選方法。隨著HPLC— MS和GC—MS等聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用，中藥指紋圖譜技術(shù)更趨完善。
1 薄層色譜法（TLC） 薄層色譜具有選用范圍廣,重現(xiàn)性好等優(yōu)點，常用于中藥各種成分的鑒別。用固定波長對薄層展開的各斑點作薄層掃描圖譜比目測的層析圖譜更為客觀準確，因而具有更好的指紋鑒別意義。但由于受薄層板的質(zhì)量和開放式層析系統(tǒng)等外界因素的影響，易引起一定的實驗誤差。
2 氣相色譜法 (GC) 氣相色譜是封閉性色譜，受外界影響較少，具有高性能、高選擇性、高靈敏度等優(yōu)點，適合于藥材及制劑中揮發(fā)性成分指紋圖譜的研究。一般使用質(zhì)量型檢測器-氫火焰離子化檢測器（FID）。錢浩泉等[5]用氣相色譜法建立了高良姜及其邊緣植物揮發(fā)油成分的指紋圖譜。具體應(yīng)用中多與質(zhì)譜聯(lián)用，不僅具有 GC 的高分離效能，而且兼?zhèn)淞速|(zhì)譜鑒定的高靈敏度和準確性。
3 高效液相色譜法 (HPLC) 高效液相色譜具有分離效率高，分析速度快，定量精密度高，檢測器種類多，穩(wěn)定性好等特點。不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，比氣相色譜法應(yīng)用范圍更廣，樣品中大多數(shù)成分均可在高效液相色譜儀上進行分析檢測，是構(gòu)建指紋圖譜的主要方法之一。由于中藥成分的復雜性，構(gòu)建指紋圖譜一般采用梯度洗脫，因為逐步提高流動相洗脫能力可獲得較多色譜峰，提供更多指紋信息。在考察條件時，要對指標成分和非指標成分都予以考慮，由于藥材中各種成分的吸收波長及對不同檢測器的響應(yīng)不同，在構(gòu)建指紋圖譜時也需要加以考慮。實際應(yīng)用中多使用多種聯(lián)用技術(shù)，充分利用各檢測器的互補性，從不同角度反映藥材及制劑的全貌，從各種圖譜中得到結(jié)構(gòu)信息。
4 高速逆流色譜法 (HSCCC) 它是目前國際上較新型的液－液分配色譜技術(shù)，利用相對移動的兩種互不相溶溶劑，在處于動態(tài)平衡的兩相中將具有不同分配比的組分分離。已有報道[6]將 HSCCC應(yīng)用于生物堿、黃酮、木脂素、蒽醌等天然產(chǎn)物的分離分析。具有分離效率高，溶劑用量少，無吸附，樣品回收率高,重現(xiàn)性好和適用范圍廣等優(yōu)點。
5 高效毛細管電泳法 (HPCE) 高效毛細管電泳技術(shù)是以高壓電場為驅(qū)動，毛細管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)高效快速分離的新型電泳技術(shù)。毛細管電泳的廣泛應(yīng)用取決于其多變的分離模式，幾乎涉及分析化學中所有的分離對象，小到無機離子，大到蛋白質(zhì)和高分子聚合物，也能夠分析不帶電荷的中性物質(zhì)[7]。具有所需樣品少、溶劑消耗少、抗污染能力強、可直接分析水溶液等優(yōu)點。其中毛細管區(qū)帶電泳 (CZE) 和膠束電動毛細管電泳色譜 (MECC) 是中草藥分析中最常見的兩種模式。但該方法的重現(xiàn)性有待提高。
6 紫外可見光譜 (UV) 紫外可見光譜反映不同化學物質(zhì)的電子共扼體系特征，具有加和性，對于混合物的鑒別專屬性差，分辨率低，故紫外光譜很少用于指紋圖譜的構(gòu)建。
7 紅外光譜和近紅外光譜 (IR) 紅外光譜是由分子的振動－轉(zhuǎn)動能級躍遷產(chǎn)生的光譜，紅外光譜具有高度的特征性。近紅外光譜法在中藥質(zhì)量控制方面有較好的應(yīng)用前景。
8 核磁共振法 (NMR) 從純有機化合物的核磁共振氫譜上可獲得結(jié)構(gòu)信息，包括各類質(zhì)子的化學位移、數(shù)量核偶合關(guān)系。核磁共振譜具有高度的重現(xiàn)性和特征性，易于解析和進一步研究，可評價藥材和中成藥質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性。
9 質(zhì)譜法 (MS) 將中藥提取液置質(zhì)譜儀中進行電子轟擊電離，可獲得提取液中化學成分的質(zhì)譜指紋譜，不同中藥提取液所含成分不同，所得質(zhì)譜圖顯示的分子離子峰及進一步，裂解碎片峰不一致，可供鑒別。
10 X射線衍射法 物質(zhì)被X射線照射可產(chǎn)生不同程度的衍射現(xiàn)象，只要某一混合物的組成是恒定的，其衍射圖譜可以作為該混合物的特征圖譜。該法具有圖譜指紋專屬性強，信息量大,所需樣品量小等諸多優(yōu)點，X射線衍射法在動物類藥材鑒定與辨別中有獨特的優(yōu)勢[8]。
11 分子生物學法 (DNA) 利用聚合酶鏈反應(yīng)從不同生物樣品中人工合成 DNA片斷，而這種 DNA片斷的大小、數(shù)目可因不同的生物而異，故稱之為 DNA指紋圖譜。該技術(shù)具有重復性好、靈敏度高的優(yōu)點。限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（RFLP）是最常用的構(gòu)建 DNA指紋圖譜的方法，但該法費時費力，應(yīng)用受到限制。隨機擴增多態(tài) DNA（RAPD）標記，可以在特異 DNA序列尚不清楚的情況下，檢測DNA的多態(tài)性，這是構(gòu)建中藥指紋圖譜的新方法，具有極好的應(yīng)用前景。 羅志勇等[9]采用 RFLP技術(shù),分析了人參、西洋參基因 DNA指紋圖譜。

指紋圖譜的技術(shù)

如前所述，中藥指紋圖譜的研究以反映中藥的整體化學特征為立論依據(jù)，提出以解決兩個關(guān)鍵技術(shù)為突破口，實現(xiàn)指紋圖譜技術(shù)在中藥質(zhì)量控制方面的應(yīng)用。它的特色主要表現(xiàn)在三個方面：1、用規(guī)范化的程序獲得中藥特征性總成分提取物，并用1HNMR、HPLC、UV、IR等多種手段表征其組成和結(jié)構(gòu)。不同的表征手段間的區(qū)別主要表現(xiàn)在所得到的信息多少不同和操作上的方便程度不同。同此，核心的問題在于這種特征性總成分提取物要有真正的特征性，它的組成和結(jié)構(gòu)要能真正代表這種中藥。
2、由于同時采用多種檢測手段來表征中藥特征總提物的結(jié)構(gòu)和相對組成方式，因此，方便了各部門在質(zhì)量控制方面可以根據(jù)自己的實際情況選擇應(yīng)用。其中，由于1HNMR具有操作簡便、快速、檢測成本低、重現(xiàn)性好和信息量大等優(yōu)點，更是中藥指紋圖譜研究的主要特色之一。
3、中藥指紋圖譜的解析研究以及中藥特征總提物和各單體成分的生理活性研究體現(xiàn)了這一技術(shù)的科學性。
中藥指紋圖譜的研究將近代分離手段和儀器分析技術(shù)應(yīng)用于中藥的質(zhì)量控制，目的在于建立一種新的質(zhì)量控制方法，因此，是一種具有創(chuàng)新性的研究工作。另外，每種中藥指紋圖譜的建立和對其進行的解析也均具有顯著的創(chuàng)新性。

中藥指紋圖譜的不足之處

在實際應(yīng)用中，中藥指紋圖譜還面臨許多問題，主要有四點：一是中藥來源的混亂無序，指紋圖譜研究首先需要解決這個源頭問題。中藥材作為一種天然產(chǎn)物，受品種、產(chǎn)地、生長環(huán)境、種植管理、采收期、炮制加工方法等多種因素影響，難以控制，不同藥材其指紋圖譜有一定的差異，不利于指紋圖譜的應(yīng)用。因此在制定標準指紋圖譜時，所選取的藥材來源及成藥的工藝應(yīng)相對穩(wěn)定，有足夠的代表性，同時保證質(zhì)量，才能保持標準指紋圖譜的先進性和代表性；二是新技術(shù)的應(yīng)用還不夠前沿，對于中藥這樣一個復雜體系，需要解決分離與檢測兩大問題，而采用單一分離模式勉為其難，采用傳統(tǒng)的檢測手段或單一聯(lián)用技術(shù)也易丟失大量信息；三是由于實驗室條件，儀器設(shè)備的不同造成指紋圖譜差異，從藥材提取分離到分析檢測全過程的標準化、規(guī)范化程度不夠，影響實驗室之間的重現(xiàn)性，難以推廣。應(yīng)在實驗條件和儀器進行規(guī)范的條件下建立“標準圖譜”；四是對大量信息的化學計量處理方法還不夠完善，指紋圖譜的特征性不夠明確具體，指紋圖譜與藥理作用的相關(guān)性缺乏研究。在藥理方面，隋因等用血清指紋圖譜研究紅花對豚鼠離體心臟的作用，為研究中藥復方有效化學成分與藥理學之間的聯(lián)系，提供了思路。

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