Caco-2細(xì)胞模型助力新藥研發(fā)(單細(xì)胞新藥研發(fā)導(dǎo)論|| 藥靶發(fā)現(xiàn))

現(xiàn)代藥物研發(fā)成功與否，與藥物的代謝特性密切相關(guān)。目前，人工合成和篩選有限數(shù)量的化合物已被大規(guī)模的化合物合成和高通量篩選所取代。無論是開發(fā)新藥還是開發(fā)新的給藥途徑，化合物在體內(nèi)的吸收特性都非常重要。以往傳統(tǒng)的體內(nèi)藥代吸收篩選模型，由于所需藥物量大、難以批量化、耗時(shí)長以及費(fèi)用高等弊端，已經(jīng)無法滿足現(xiàn)代新藥的研發(fā)要求，因而開發(fā)新的快速、準(zhǔn)確以及需藥量少的藥物吸收篩選模型已成為新藥研發(fā)的必然趨勢。目前，被廣泛采用的三種篩選方法是：大鼠原位單次灌注法、大鼠外翻腸囊法以及體外人結(jié)腸腺癌（Caco-2）細(xì)胞系法。其中，Caco-2細(xì)胞模型已經(jīng)成為一種預(yù)測藥物人體小腸吸收以及研究藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的標(biāo)準(zhǔn)體外篩選工具。

結(jié)構(gòu)與功能決定其應(yīng)用價(jià)值

Caco-2細(xì)胞模型是最近十幾年來國外廣泛采用的一種研究藥物小腸吸收的體外模型，具有相對簡單、重復(fù)性較好、應(yīng)用范圍較廣的特點(diǎn)。其來源于人的直腸癌，結(jié)構(gòu)和功能類似于人小腸上皮細(xì)胞，并含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系。在細(xì)胞培養(yǎng)條件下，生長在多孔的可滲透聚碳酸酯膜上的細(xì)胞可融合并分化為腸上皮細(xì)胞，形成連續(xù)的單層，這與正常的成熟小腸上皮細(xì)胞在體外培育過程中出現(xiàn)反分化的情況不同。細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)研究表明，Caco-2細(xì)胞與人小腸上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上相似，具有相同的細(xì)胞極性和緊密連接。胞飲功能的檢測也表明，Caco-2細(xì)胞與人小腸上皮細(xì)胞類似，這些性質(zhì)可以恒定維持約20天。由于Caco-2細(xì)胞性質(zhì)類似小腸上皮細(xì)胞，因此可以在這段時(shí)間進(jìn)行藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

另外，存在于正常小腸上皮中的各種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、代謝酶等在Caco-2細(xì)胞中大都也有相同的表達(dá)，如細(xì)胞色素P450同工酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶、堿性磷酸酶、蔗糖酶、葡萄糖醛酸酶及糖、氨基酸、二肽、維生素B12等多種主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在Caco-2細(xì)胞中都有與小腸上皮細(xì)胞類似的表達(dá)。由于其含有各種胃腸道代謝酶，因此更接近藥物在人體內(nèi)吸收的實(shí)際環(huán)境。

研究藥物小腸吸收的標(biāo)準(zhǔn)工具

利用人小腸上皮Caco-2細(xì)胞單層來進(jìn)行藥物小腸吸收的細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)在已經(jīng)成為一種預(yù)測藥物在人體小腸吸收以及研究藥物轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的標(biāo)準(zhǔn)篩選工具。

評(píng)價(jià)新藥的吸收。在研究新的抗生素藥物時(shí)，如新藥為水溶性很差的化合物，則藥物性質(zhì)決定其不能制作成注射劑。為了改善其口服吸收生物利用度，國外研究人員使用了一些吸收增強(qiáng)劑，用Caco-2細(xì)胞來評(píng)價(jià)其吸收程度取得較好的結(jié)果。

還有研究者使用Caco-2細(xì)胞模型評(píng)價(jià)了系列難溶性藥物磷酸酯前藥與其母藥的吸收度，這些藥物包括可的松、苯妥英等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苯妥英等藥物磷酯化后吸收大為增加，而可的松磷酯化后吸收程度有顯著改變，這些結(jié)果在其他模型上也類似。在研究藥物賦形劑對藥物吸收的影響時(shí)，同時(shí)使用了Caco-2細(xì)胞模型和大鼠離體腸道進(jìn)行評(píng)價(jià)，兩模型的結(jié)果一致。這些都表明Caco-2細(xì)胞模型在新藥吸收評(píng)價(jià)方面的重要價(jià)值。

預(yù)測吸收過程中的藥物相互作用。Caco-2細(xì)胞中存在有與小腸上皮相同的各種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、代謝酶，因此可以用來作為研究與吸收相關(guān)的藥物相互作用的體外模型。

小腸上皮的代謝、受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)、p-gP對藥物分子的泵出，是一個(gè)飽和過程。聯(lián)合用藥時(shí)，因?yàn)橛锌赡艽嬖谒幬锔偁幟?、載體或p-gP泵的作用，所以會(huì)與單獨(dú)給藥時(shí)的生物利用度存在差異。這種藥物吸收過程中存在的相互作用可以應(yīng)用Caco-2細(xì)胞模型進(jìn)行研究。此外，與藥物吸收有關(guān)的相互作用還可來源于代謝酶、載體、p-gP泵被特定藥物重復(fù)給藥引起的誘導(dǎo)。當(dāng)藥物經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑被吸收時(shí)，p-gP泵成為藥物吸收的一個(gè)重要生化屏障，它把進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出，從而減少了藥物的吸收，因此成為口服藥物生物利用度低、波動(dòng)大的一個(gè)重要影響因素。具有這種p-gP泵出性質(zhì)的藥物分子在與p-gP泵抑制劑共同口服給藥時(shí)，其透過細(xì)胞膜吸收的程度增強(qiáng)。

研究吸收機(jī)制。Caco-2細(xì)胞除了在吸收評(píng)價(jià)方面的大量應(yīng)用外，也比較適合用于吸收機(jī)制的研究。有研究人員分別利用Caco-2細(xì)胞作為鈉和鐵吸收的模型細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LR(lipidraft)在決定PI3K/AKT2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起到重要作用，包括增加了腸道的Na吸收。

拓展藥物小腸代謝研究

人體小腸中存在著豐富的細(xì)胞色素P450同工酶，其中P4503A4占到該組織中所有細(xì)胞色素P450同工酶的約50％，而其在Caco-2細(xì)胞單層中的表達(dá)已見報(bào)道。

與人體小腸甚至空腸微粒體相比，Caco-2細(xì)胞中的細(xì)胞色素P450同工酶為低水平表達(dá)，這是限制其作為口服給藥化合物的小腸一相代謝研究模型的一個(gè)因素。為了克服這一局限，國外研究人員等利用1α，25-二羥基維生素D3處理過的Caco-2細(xì)胞單層作為研究小腸代謝動(dòng)力學(xué)首過作用的體外模型。當(dāng)將該系統(tǒng)應(yīng)用于研究細(xì)胞色素P4503A4底物咪唑安定的代謝動(dòng)力學(xué)時(shí)，顯示出與體內(nèi)研究相似的結(jié)果。

盡管細(xì)胞色素P450同工酶在Caco-2細(xì)胞中的表達(dá)水平較低，但其他許多藥物代謝酶的表達(dá)水平不經(jīng)誘導(dǎo)就可以用于藥物小腸代謝的研究。比如，像羧酸酯酶、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶和兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶等在Caco-2細(xì)胞中仍保持其功能特點(diǎn)。在這些酶中，二相磺基轉(zhuǎn)移酶和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶對于口服給藥化合物的生物利用度尤其重要，因?yàn)榫哂兴幚砘钚缘幕衔锱c它們發(fā)生結(jié)合反應(yīng)后通常會(huì)導(dǎo)致活性降低或消失。例如，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在Caco-2細(xì)胞中，類黃酮物質(zhì)5，7-二羥黃酮產(chǎn)生硫酸鹽和葡(萄)糖苷酸的變化，5，7-二羥黃酮硫酸鹽的產(chǎn)生速度是其葡(萄)糖苷酸化的兩倍。類似研究也表明，Caco-2細(xì)胞模型中酶的表達(dá)可以使其應(yīng)用于藥物的小腸代謝研究。

盡管Caco－2細(xì)胞模型尚存在不足，如細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間過長（21天）；該模型本身為純細(xì)胞系，缺乏在小腸上皮細(xì)胞中的黏液層；缺少細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)以及試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，使結(jié)果有時(shí)缺乏可比性；由于Caco-2細(xì)胞來源于人結(jié)腸，因而該細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)特性、酶的表達(dá)以及跨膜電阻相對更能反映結(jié)腸細(xì)胞而非小腸細(xì)胞等等。但是，不可否認(rèn)的是，建立與應(yīng)用Caco－2細(xì)胞模型可以被認(rèn)為是藥物吸收研究方面取得的重要成就，而且隨著改進(jìn)細(xì)胞模型的建立和培養(yǎng)裝置、檢測設(shè)備等新技術(shù)的應(yīng)用，其在新藥研發(fā)中必將發(fā)揮出重要作用。

單細(xì)胞新藥研發(fā)導(dǎo)論|| 藥靶發(fā)現(xiàn)

開刊詞||單細(xì)胞新藥研發(fā)導(dǎo)論
單細(xì)胞新藥研發(fā)導(dǎo)論|| 新藥研發(fā)管線

人類開展藥物篩選的方法與科學(xué)技術(shù)的發(fā)展密不可分，先后經(jīng)歷了活體評(píng)價(jià)（神農(nóng)嘗百草）、器官/組織篩選，再到現(xiàn)代的分子靶向、細(xì)胞表型等方法。在這個(gè)歷程中，單細(xì)胞技術(shù)將怎樣推進(jìn)藥靶的發(fā)現(xiàn)呢？

在講單細(xì)胞技術(shù)加速藥靶發(fā)現(xiàn)之前，我們先來理解一下什么叫藥靶以及相關(guān)的幾個(gè)問題：

藥物與機(jī)體生物大分子的結(jié)合部位即藥物靶點(diǎn)。藥物作用靶點(diǎn)涉及受體、酶、離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)體、免疫系統(tǒng)、基因等。可見，藥靶不是有機(jī)體中天然存在的，它是疾病固有的特征，舉兩個(gè)例子：

但是生物大分子依然使一類最大的經(jīng)典靶點(diǎn)，那么僅看人體的生物大分子的話，人體到底有多少潛在靶點(diǎn)呢？在后基因組時(shí)代我們可以回答這個(gè)問題，人類共有20000--25000個(gè)蛋白質(zhì)編碼的基因，加上人體微生物基因組編碼蛋白基因，這個(gè)總量是可以衡量的。研究表明大約有5000個(gè)潛在的 可成藥 的大分子靶點(diǎn)適合用于小分子藥物開發(fā)，另外有3200個(gè)靶點(diǎn)可適用與生物學(xué)治療。

以上，我們簡單明白了靶點(diǎn)的基本性質(zhì)，那么我的單細(xì)胞分析流程可以從哪些方面來入手藥靶發(fā)現(xiàn)呢？

首先，單細(xì)胞技術(shù)把我們認(rèn)識(shí)靶點(diǎn)的精度拉到組織器官和生物大分子之間，這就是生命的基本單位：細(xì)胞。把細(xì)胞的類型和狀態(tài)及其表達(dá)的基因、受體配體、通路、TCR/BCR、酶、離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)體的改變放入到新藥研發(fā)的流程中我們不難發(fā)現(xiàn)，單細(xì)胞技術(shù)幾乎重新為這個(gè)管線新著了一遍色。

單細(xì)胞水平的靶點(diǎn)更加接近真是世界。如EGFR調(diào)控的下游信號(hào)通路主要有RAS-RAF-MAPK通路和PI3K-AKT -mTOR通路，是細(xì)胞增殖和存活的重要信號(hào)通路，針對腫瘤細(xì)胞，EGFR是抗癌藥物的重要靶點(diǎn)。那么腫瘤細(xì)胞還有哪些特有的通路呢？這時(shí)候我們可以做一個(gè)差異分析，于是，單細(xì)胞水平的生物標(biāo)志物（biomarker）和靶點(diǎn)（target）是那樣的接近：

隨著單細(xì)胞多組學(xué)和空間技術(shù)的成熟，基于系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)的生物標(biāo)志物及靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)日益成熟，人們得以快速確定與疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵因素，以發(fā)現(xiàn)新生物標(biāo)志物和新靶標(biāo)。

參考：
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阿波斯托利亞－瑪?shù)賮啞J巴瑞多，等 編 趙維蒞，張俊 主譯《癌癥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中的靶向治療 》

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Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum 2011
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DRUG-NEM: Optimizing drug combinations using single-cell perturbation response to account for intratumoral heterogeneity

https://otd.harvard.edu/explore-innovation/technologies/single-cell-high-throughput-drug-screening

caco-2細(xì)胞限制藥物吸收的因素有

caco-2細(xì)胞限制藥物吸收的因素有細(xì)胞膜、細(xì)胞間各種連接處、不流動(dòng)水層。細(xì)胞膜能夠選擇性的讓物質(zhì)通過，讓某些小分子物質(zhì)透過，而一些有害的物質(zhì)或大分子物質(zhì)則限制通過，保持細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的穩(wěn)定。細(xì)胞間各種連接處能夠封閉相鄰細(xì)胞間的接縫，防止溶液中的分子沿細(xì)胞間隙滲入體內(nèi)，從而保證了機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。不流動(dòng)水層能夠限制某些脂溶性藥物的吸收。

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