法暫停一項(xiàng)抗艾藥物試驗(yàn)

法國(guó)醫(yī)藥和衛(wèi)生安全管理局日前叫停了一項(xiàng)艾滋病疫苗藥物的臨床試驗(yàn)，理由是這種藥物被懷疑有引發(fā)骨髓炎的風(fēng)險(xiǎn)。

據(jù)法國(guó)《費(fèi)加羅報(bào)》報(bào)道，這個(gè)名為VAC18的疫苗為一種含有脂肽(lipopeptides)成分的抗艾滋病藥，其在歐美國(guó)家已廣泛進(jìn)入第二階段臨床試驗(yàn)。法國(guó)不久前發(fā)現(xiàn)有一名接受試驗(yàn)的患者出現(xiàn)了骨髓炎癥狀。盡管目前的研究沒(méi)能證明脂肽必然導(dǎo)致患者患上骨髓炎，而且在其他國(guó)家尚未發(fā)現(xiàn)這種情況，但醫(yī)藥和衛(wèi)生安全管理局出于謹(jǐn)慎，還是叫停了這一藥物的臨床試驗(yàn)。

暫停試驗(yàn)的艾滋病疫苗藥物由綜合型氨基酸（構(gòu)成艾滋病病毒的蛋白碎片）和脂類物質(zhì)合成，并以脂肽成分為主。這種合成疫苗被認(rèn)為可以激活艾滋病患者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，并殺死積存于體內(nèi)的艾滋病病毒。

什么是進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)的基礎(chǔ)

1 概述

測(cè)定細(xì)菌在體外抗菌藥物敏感性（以下稱藥敏試驗(yàn)）的試驗(yàn)方法很多。

絕大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室以瓊脂擴(kuò)散法作為常規(guī)方法測(cè)定常見(jiàn)的快速生長(zhǎng)的病原菌。

本文介紹的是標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法。

本文提出的一系列建議有助于藥敏試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化。

具體地?cái)⑹隽爽F(xiàn)行推薦方法的操作步驟，及其適應(yīng)性和局限性。

本文還重溫了國(guó)際協(xié)作研究會(huì)（ICS）的有關(guān)建議和食品藥物管理局（FDA）的有關(guān)規(guī)定，并采納了其中的有關(guān)章節(jié)。

只根據(jù)是否出現(xiàn)抑菌環(huán)而不考慮其大小來(lái)判斷細(xì)菌對(duì)抗菌藥物敏感性的試驗(yàn)方法，結(jié)果是不準(zhǔn)確的。

紙片擴(kuò)散法試驗(yàn)必須遵循標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)原理，并根據(jù)抑菌環(huán)與最低抑菌濃度的相關(guān)性，并結(jié)合臨床上已知敏感或耐藥菌株的狀況進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果才能可靠。

要得到可靠結(jié)果，必須嚴(yán)格地按照本文的方法進(jìn)行操作。

美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）下設(shè)的紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)分委員會(huì)推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法，以Bauer等介紹的方法為基礎(chǔ)，是目前敘述最完整的試驗(yàn)方法。

其中的解釋標(biāo)準(zhǔn)是綜合臨床和實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)發(fā)展而來(lái)，并得到證實(shí)。

本文介紹的是現(xiàn)行紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)的操作、質(zhì)量控制以及解釋標(biāo)準(zhǔn)。

當(dāng)發(fā)現(xiàn)新問(wèn)題并有所改進(jìn)時(shí)，將并入新版本，以非正式文件補(bǔ)充發(fā)布。

紙片法抗菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)

2 做藥敏試驗(yàn)的指證

任何細(xì)菌引起的感染均需要治療。

如果依細(xì)菌的種類不能預(yù)知其敏感性，就應(yīng)做藥敏試驗(yàn)。

通常，鑒定和藥敏試驗(yàn)是同時(shí)進(jìn)行的。

當(dāng)致病菌屬于一種對(duì)一般常用抗菌藥物耐藥的細(xì)菌，最需要做藥敏試驗(yàn)。

細(xì)菌耐藥機(jī)制包括：產(chǎn)生滅活藥物的酶，藥物耙位改變，或藥物進(jìn)入細(xì)胞的方式發(fā)生變化。

有些細(xì)菌的抗菌藥物敏感性可以預(yù)知。

當(dāng)感染由一種對(duì)某高效抗菌藥物敏感的細(xì)菌引起時(shí)，就不必做藥敏試驗(yàn)（如，化膿性鏈球菌對(duì)青霉素專性敏感）。

但對(duì)青霉素過(guò)敏的病人，分離出的化膿性鏈球菌也許要測(cè)一下紅霉素和四環(huán)素的敏感性，以便發(fā)現(xiàn)有無(wú)耐藥性。

細(xì)菌耐藥性流行病學(xué)研究及新抗菌藥物的研究也需要做藥敏試驗(yàn)。

做藥敏試驗(yàn)，應(yīng)從分離平板上挑選各種疑為致病菌的單個(gè)菌落，同時(shí)做菌種鑒定。

不同菌種不可在同一平板上做混合細(xì)菌藥敏試驗(yàn)。

一般避免用臨床標(biāo)本（如無(wú)菌體液和尿液）直接做藥敏，除非臨床上急需且革蘭氏染色只見(jiàn)到單一菌種，但隨后應(yīng)再以標(biāo)準(zhǔn)方法重做。

對(duì)感染性質(zhì)不同，標(biāo)本中混有渾濁細(xì)菌或正常菌群的情況，其中的細(xì)菌也許與感染治療關(guān)系不大，常不必做藥敏，不然反會(huì)招致錯(cuò)誤的引導(dǎo)。

3 常規(guī)測(cè)定藥物的選擇

要測(cè)定和報(bào)告給哪些藥物，須與感染科醫(yī)生、醫(yī)院的藥品委員會(huì)及感染控制委員會(huì)協(xié)商，然后由實(shí)驗(yàn)室制定最合適的方案。

表1和表1A列出了治療各類細(xì)菌感染有效的藥物，其體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果也有助于感染的控制及流行病學(xué)研究。

3.1 常規(guī)報(bào)告

表1和表1A列出的抗菌藥物是我們目前認(rèn)為比較適合的。

選藥時(shí)做了多方面考慮，包括微生物學(xué)、臨床藥理學(xué)因素及美國(guó)FDA認(rèn)可的臨床適用性和療效。

為了避免誤導(dǎo)，給臨床醫(yī)生的報(bào)告應(yīng)只包括治療上有用的藥物，如表1和表1A。

根據(jù)情況需要，可在此基礎(chǔ)上增減。

為了積累分類學(xué)和流行病學(xué)資料也可選擇用于治療以外的藥物，但結(jié)果僅限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的感染控制醫(yī)生或醫(yī)院感染流行學(xué)專家用，不可報(bào)給臨床醫(yī)生。

3.2 使用認(rèn)可的名稱

所有抗菌藥物均采用官方認(rèn)可的名稱以避免混淆。

為了強(qiáng)調(diào)大多數(shù)現(xiàn)用抗生素之間的關(guān)系，按藥物的種類分組如下：

3.2.1 β－內(nèi)酰胺類 所有β－內(nèi)酰胺類藥物都具有相同的中央β－內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)，并以抑制細(xì)胞壁合成為主要作用機(jī)理。

β－內(nèi)酰胺環(huán)上的取代環(huán)結(jié)構(gòu)或取代基決定了藥物屬于青霉素類、頭孢烯類、碳頭孢烯類、碳青霉烯類或單環(huán)類。

3.2.1.1 青霉素類 青霉素主要針對(duì)不產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶的革蘭氏陽(yáng)性菌和某些嬌嫩革蘭氏陰性菌。

酰胺類青霉素（氨芐西林和阿莫西林）和酰脲基青霉素（美洛西林和哌拉西林）對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌范圍更大，對(duì)很多假單胞菌有效。

耐青霉素酶的青霉素（氯唑西林、雙氯西林、假氧西林、乙氧西林和苯唑西林）主要針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌如產(chǎn)青霉素酶的葡萄球菌。

3.2.1.2 β－內(nèi)酰胺類/β－內(nèi)酰胺酶抑制合劑類 這類藥物由一種青霉素和一種抗菌活性小但可抑制某些β－內(nèi)酰胺酶作用的物質(zhì)組成合劑。

目前使用的抑制劑有三種：棒酸、舒巴坦和他唑巴坦。

合劑的抗菌效果不可僅靠合劑中青霉素藥敏試驗(yàn)的結(jié)果預(yù)測(cè)。

3.2.1.3 頭孢烯類（包括頭孢菌素類）

3.2.1.4 碳青霉烯類 碳青霉烯類藥物在結(jié)構(gòu)上與青霉素稍有不同，對(duì)β－內(nèi)酰胺酶有更強(qiáng)抗水解力，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌的抗菌譜更廣。

3.2.1.5 單環(huán)類 單環(huán)類結(jié)構(gòu)獨(dú)特，僅對(duì)須氧革蘭氏陰性菌有作用。

目前，氨曲南是美國(guó)FDA唯一通過(guò)的單環(huán)類藥物。

3.2.2 粘肽類 粘肽類化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要抑制細(xì)胞壁合成，但作用位點(diǎn)不同于β－內(nèi)酰胺類。

這類藥物主要針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌。

萬(wàn)古霉素主要用于治療對(duì)青霉素過(guò)敏病人的革蘭氏陽(yáng)性菌感染。

還用于治療β－內(nèi)酰胺類藥物耐藥的革蘭氏陽(yáng)性菌，如MSRA和某些腸球菌。

3.2.3 氨基糖苷類 這類藥物結(jié)構(gòu)類似，在核糖體水平抑制蛋白質(zhì)合成。

由于對(duì)氨基糖苷滅活酶的耐受性的差異，不同藥物的抗菌譜也有所不同。

此類藥物主要治療須氧革蘭氏陽(yáng)性菌感染，或主要作用于細(xì)胞壁的抗生素聯(lián)合治療某些耐藥革蘭氏陽(yáng)性菌，如腸球菌。

3.2.4 大環(huán)內(nèi)脂類 此類藥物結(jié)構(gòu)相似，在核糖體水平抑制蛋白質(zhì)的合成。

此類中僅有幾種現(xiàn)仍用于測(cè)試革蘭氏陽(yáng)性菌或柔嫩革蘭氏陽(yáng)性菌。

3.2.5 四環(huán)素類 此類藥物在核糖體水平抑制某些革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌的蛋白質(zhì)合成。

此類藥物極為相似，少有例外，常規(guī)測(cè)四環(huán)素即可。

3.2.6 喹諾酮類 此類藥物結(jié)構(gòu)相似，主要是抑制許多革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的DNA螺旋酶活性。

各藥的抗菌譜不完全一致，應(yīng)分別測(cè)定。

3.2.7 磺胺類和甲氧芐氨嘧啶（TMP） 此類藥物包括幾種化療制劑，抗菌譜相同，可抑制細(xì)菌的葉酸代謝。

磺胺甲基異惡唑最常用，主要用于治療尿路感染。

藥敏試驗(yàn)可選此藥。

磺胺甲基異惡唑常與TMP合用，它們分別在革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌葉酸代謝的兩個(gè)步驟中起抑制作用。

3.2.8 其他藥物 氯霉素、克拉霉素和利福平均是抑制蛋白質(zhì)合成，但彼此在結(jié)構(gòu)上沒(méi)有關(guān)系，均需作體外測(cè)試。

呋喃妥因在核糖體水平抑制蛋白質(zhì)合成，此藥在體液中濃度極低，通常只用于泌尿系感染。

3.3 選藥指南

為使常規(guī)藥敏試驗(yàn)合理，應(yīng)限制測(cè)定藥物的數(shù)量。

表1和表1A足以滿足大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)工作的需要。

該表按特定菌或菌群分若干組，將各種抗生素?fù)駜?yōu)次序排列，供常規(guī)實(shí)驗(yàn)室選擇。

表中每格列的一組相似抗生素，療效相似，不必重復(fù)選擇。

以“或”相連的藥物，抗菌譜類似，表現(xiàn)為交叉耐藥。

因此，每格（一類或相關(guān)組）中的藥物只需選擇一種。

一般，每種藥物的藥敏結(jié)果必須經(jīng)過(guò)測(cè)定后才能報(bào)告，個(gè)別情況可以根據(jù)另外的藥物的結(jié)果推測(cè)（如葡萄球菌對(duì)頭孢類的結(jié)果可根據(jù)苯唑西林的結(jié)果推測(cè)）。

選擇的藥物應(yīng)與醫(yī)院常用藥物吻合。

3.4 常規(guī)報(bào)告和選擇性報(bào)告的原則

如表1和表1A所列，屬于A組的藥物，是常規(guī)首選藥物，對(duì)每一特定的菌類應(yīng)做相應(yīng)的報(bào)告。

B組包括了臨床上重要的藥物，特別是對(duì)院內(nèi)感染，應(yīng)該作為首選藥。

但是，報(bào)告是有條件的：只有當(dāng)A組中同類藥物不敏感時(shí)才報(bào)告。

其他情況還有：特定的標(biāo)本（如CSF中分離的腸桿菌應(yīng)測(cè)三代頭孢菌素，或泌尿系菌株測(cè)TMP/SMZ）；混合感染；多部位感染；藥物敏感，明顯副作用，或?qū)組藥物治療失??；為控制感染收集流行病學(xué)指標(biāo)等。

C組包括替代或后備藥物，其適用的情況包括：治療某些地方或流行性疾病，或?qū)κ走x藥物（特別是同類藥，如β－內(nèi)酰胺類或氨基糖苷類藥物）多重耐藥的菌株；治療對(duì)首選藥物過(guò)敏的病人；治療不常見(jiàn)的菌種（如氯霉素治療沙門氏菌或某些假單胞菌）以及為控制感染收集流行病學(xué)資料（如產(chǎn)桿菌測(cè)氯霉素和卡那霉素）的等。

D組包括僅限于泌尿系感染使用的藥物（如呋喃妥因和有機(jī)酸類），其他部位感染的細(xì)菌無(wú)需測(cè)定。

每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)決定哪些藥物（表1和表1A）作為常規(guī)（A組）報(bào)告，哪些只是作為選擇性報(bào)告（B組）報(bào)告，這需要與傳染科醫(yī)生、藥品委員會(huì)及醫(yī)院感染控制委員會(huì)成員共同商討。

選擇性報(bào)告須有助于對(duì)該報(bào)告的理解，并促進(jìn)降低由于濫用抗菌藥物所造成的耐藥菌增加。

雖然B組藥物的試驗(yàn)結(jié)果不作為常規(guī)報(bào)告，但是，一旦臨床需要應(yīng)該及時(shí)提供，或者對(duì)特定的標(biāo)本作為常規(guī)報(bào)告。

異常耐藥應(yīng)該報(bào)告，如對(duì)二線藥物耐藥但對(duì)一線藥物敏感的現(xiàn)象。

4.0 試劑

4.1 Mueller-Hinton瓊脂

在現(xiàn)有的許多培養(yǎng)基中，我們認(rèn)為Mueller-Hinton瓊脂最適合于常規(guī)敏感試驗(yàn)，理由是：（1）產(chǎn)品批間試驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好；（2）磺胺、甲氧芐氨嘧啶、四環(huán)素的抑制物含量低；（3）絕大多數(shù)致病菌生長(zhǎng)較好；（4）大量有關(guān)敏感試驗(yàn)的數(shù)據(jù)是由此培養(yǎng)基得出的。

盡管Mueller-Hinton瓊脂通常是可靠的，但是偶然產(chǎn)品也有批間差。

如果一批培養(yǎng)基不能很好地保證細(xì)菌生長(zhǎng)，抑菌環(huán)則增大，超出質(zhì)控范圍，造成錯(cuò)誤結(jié)果。

只有按NCCLS M6-P做過(guò)試驗(yàn)并符合規(guī)定的培養(yǎng)基才能使用。

4.1.1 制備Mueller-Hinton瓊脂

制備Mueller-Hinton瓊脂的步驟如下：（1）按產(chǎn)品說(shuō)明用干粉培養(yǎng)基制備；（2）高壓滅菌后立即放40－50℃水浴；（3）平皿置水平臺(tái)上，新制備的培養(yǎng)基待涼后倒平板，瓊脂厚度為4mm。

內(nèi)徑14cm的平皿需要培養(yǎng)基約60－70ml，內(nèi)徑9cm平皿約需25－30ml。

玻璃或塑料平皿均可使用，但平皿底應(yīng)平坦；（4）待平板冷至室溫，留下當(dāng)日使用的，其他放入冰箱（2－8℃）保存；（5）平板許在7日內(nèi)用完。

如用塑料袋包裹，水份不蒸發(fā)的可適當(dāng)延長(zhǎng)使用期。

過(guò)期培養(yǎng)基須以質(zhì)控菌株按4.3節(jié)介紹的方法測(cè)定，合格者方可使用；（6）每批制備的平板，應(yīng)抽樣30－35℃ 24小時(shí)以上，檢查是否無(wú)菌。

抽樣的平板不可再用。

4.1.2 pH值

每批Mueller-Hinton瓊脂，制備時(shí)應(yīng)檢查pH值。

檢查方法依實(shí)驗(yàn)室所具備的設(shè)備條件。

培養(yǎng)基的pH值室溫下應(yīng)為7.2-7.4，測(cè)pH值應(yīng)在瓊脂凝固后進(jìn)行。

如果pH值偏低，某些藥的活性會(huì)下降（如氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)脂類），另一些藥的活性可能會(huì)增強(qiáng)（如青霉素類）；如果pH值偏高，效果相反。

pH值測(cè)定方法有：（1）將pH電極浸入融化的瓊脂培養(yǎng)基中；（2）瓊脂放入燒杯中融化，然后使其凝固在pH電極上；（3）使用平面電極。

4.1.3 水份

使用前，瓊脂平板表面如有水份，須放恒溫箱（35℃），恒溫箱門半開(kāi)，使水份蒸發(fā)（10－30分鐘）。

瓊脂表面應(yīng)潮濕，但不應(yīng)有水珠。

培養(yǎng)時(shí)，平皿蓋上也不應(yīng)有水珠。

4.1.4 胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶的作用

如培養(yǎng)基含有過(guò)量的胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶，磺胺藥和甲氧芐氨嘧啶的活力被抵消，則抑菌環(huán)較小或不清楚，甚至無(wú)抑菌環(huán)，導(dǎo)致假耐藥的報(bào)告。

購(gòu)買培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)注意挑選無(wú)胸腺嘧啶核苷的Mueller-Hinton瓊脂。

可以用標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)控菌株糞腸球菌ATCC29212或33186測(cè)試復(fù)方磺胺的紙片，評(píng)價(jià)新批號(hào)的Mueller-Hinton瓊脂。

培養(yǎng)基上出現(xiàn)直徑大于20mm的抑菌環(huán)為合格。

不合格的培養(yǎng)基上不出現(xiàn)抑菌環(huán)、環(huán)內(nèi)有細(xì)菌生長(zhǎng)或抑菌環(huán)小于20mm。

4.1.5 二價(jià)離子的影響

二價(jià)離子，主要是鎂和鈣離子，影響四環(huán)素、多粘菌素、氨基糖苷類藥物對(duì)綠膿假單胞菌的測(cè)定結(jié)果。

陽(yáng)離子過(guò)量抑菌環(huán)變小，濃度過(guò)低抑菌環(huán)增大。

鋅離子可影響羧基青霉素的結(jié)果。

每批培養(yǎng)基都應(yīng)測(cè)試，看是否符合表3的質(zhì)量控制要求。

應(yīng)細(xì)致觀察質(zhì)控菌株的測(cè)定結(jié)果，觀察是否有由培養(yǎng)基引起的誤差。

4.1.6 被測(cè)菌株生長(zhǎng)不好的解決辦法

只有能夠在未強(qiáng)化的Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的須氧菌或兼性厭氧菌才能在此培養(yǎng)基上做藥敏試驗(yàn)。

某些嬌嫩細(xì)菌，如嗜血桿菌、淋病奈瑟氏菌、肺炎鏈球菌、草綠色鏈球菌、β溶血鏈球菌在未強(qiáng)化的Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不良。

這類細(xì)菌，需用經(jīng)強(qiáng)化或另外的培養(yǎng)基，具體做法見(jiàn)第六節(jié)。

（另見(jiàn)表4）

4.2 藥敏紙片的保存

藥敏紙片應(yīng)注意保存在干燥環(huán)境。

按下法保存：（1）在8℃以下保存，或－14℃以下冷凍保存。

β－內(nèi)酰胺類藥的紙片應(yīng)密封冷凍保存，僅取少量作為日常使用，在冰箱里保存約一周。

有些不穩(wěn)定的抗生素（如頭孢拉定、棒酸合劑）須冷凍保存，用時(shí)取出；（2）紙片應(yīng)在使用前1－2小時(shí)從冰箱取出，暖至室溫再打開(kāi)，以避免出現(xiàn)冷凝水；（3）紙片啟封后應(yīng)放入可密封的有干燥劑的容器中；（4）紙片只能在有效期內(nèi)使用，過(guò)期應(yīng)棄去。

4.3 標(biāo)準(zhǔn)比濁管

用硫酸鋇比濁管（0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)），標(biāo)定接種菌液濃度。

比濁管制備方法如下：（1）0.048mol/L BaCl2，（1.175% w/v BaCl2·2H2O）0.5ml，加到99.5ml的0.18 mol/L（0.36N）H2SO4（1％v/v）溶液中，制成比濁管；（2）用光徑為1cm的分光光度計(jì)測(cè)定光吸收來(lái)標(biāo)定比濁管。

0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管在625nm波長(zhǎng)的吸收光度應(yīng)為0.08-0.1；（3）選管徑與制備菌液試管相同的螺口試管，每管分裝4－6ml；（4）將試管帽擰緊，放室溫暗處保存；（5）用前，將比濁管在旋轉(zhuǎn)振蕩器上混勻。

如出現(xiàn)大顆粒，應(yīng)更換；（6）每個(gè)月更換比濁管或復(fù)檢比濁管的濁度。

5 操作步驟

5.1 制備接種菌液

5.1.1 增菌法 步驟如下：（1）選瓊脂平板上形態(tài)相同的菌落至少4－5個(gè)，用接種環(huán)挑其頂部，移至4－5ml肉湯或大豆酪蛋白消化液中；（2）置35℃培養(yǎng)至菌液濃度達(dá)到或超過(guò)比濁管濃度（一般需2－6小時(shí)），濃度約1－2×108CFU/ml；（3）用生理鹽水或肉湯校正菌液濃度，與比濁管相同。

可用光電比濁。

目測(cè)比濁須在適當(dāng)光照下以黑色線條為反襯。

5.1.2 直接菌懸液法 步驟如下：（1）做常規(guī)藥敏試驗(yàn)，可直接用過(guò)夜培養(yǎng)的菌落（必須用無(wú)選擇性培養(yǎng)基平板，如普通瓊脂培養(yǎng)基）在鹽水或肉湯中制備接種菌液。

菌液濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)瞎埽?2)此法適用于在肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)不好的細(xì)菌如嗜血桿菌、淋病奈瑟氏菌和鏈球菌及葡萄球菌的甲氧苯青霉素或苯唑青霉素的耐藥試驗(yàn)；（3）當(dāng)用此法做復(fù)方磺胺藥的試驗(yàn)時(shí)，從平板上直接挑菌落時(shí)會(huì)攜帶相當(dāng)量的拮抗劑，造成敏感菌株的抑菌環(huán)內(nèi)出現(xiàn)輕微的生長(zhǎng)菌膜。

5.2 接種平板 步驟如下：（1）校正的菌液須在15分鐘內(nèi)使用。

用一無(wú)菌棉試子蘸取菌液并在上端管壁旋轉(zhuǎn)擠壓幾次，去掉過(guò)多的菌液；（2）用試子涂布整個(gè)瓊脂平板表面，反復(fù)涂布幾次，每次將平皿旋轉(zhuǎn)60度，保證涂布均勻。

（3）將平皿蓋打開(kāi)3－5分鐘，使培養(yǎng)基表面的水份吸收掉。

然后貼藥敏紙片；（4）注意：避免用過(guò)濃的菌液，禁用未經(jīng)稀釋菌或其他不標(biāo)準(zhǔn)菌液接種平板。

5.3 貼紙片 （1）接種平板后，貼上藥敏紙片。

用鑷子或針尖壓一下紙片使其與培養(yǎng)基表面貼牢。

紙片要貼得均勻，紙片與紙片中心距離不得小于24mm。

原則上，直徑150mm得平板貼12張紙片，直徑100mm平板貼5張紙片。

紙片貼后不應(yīng)再移動(dòng)，因?yàn)橛行┧幬飼?huì)立即擴(kuò)散；（2）貼上紙片15分鐘內(nèi)，須把平板倒放在35℃恒溫箱中。

因?yàn)橐志h(huán)解釋標(biāo)準(zhǔn)是在普通環(huán)境中標(biāo)定的，所以除嗜血桿菌和淋病奈瑟氏菌外，平板不可放在高CO2的環(huán)境中。

CO2與某些因素作用可使抑菌環(huán)增大。

5.4 讀取結(jié)果 （1）經(jīng)16－18小時(shí)培養(yǎng)后，觀察結(jié)果。

菌液濃度適合且涂得好，抑菌環(huán)規(guī)則，細(xì)菌呈融合生長(zhǎng)。

如果出現(xiàn)單個(gè)菌落，說(shuō)明接種量小，需重做試驗(yàn)，測(cè)量抑菌環(huán)直徑須包含紙片直徑：手持平皿從背面目測(cè)檢查每快平板，借反射光（黑色無(wú)放光背景），用卡尺、普通尺或特制的模板量取抑菌環(huán)直徑，單位為毫米。

培養(yǎng)基中如果加了血液，須打開(kāi)平皿蓋，借反射光，從正面量抑菌環(huán)。

如果是葡萄球菌或腸球菌，須培養(yǎng)24小時(shí)后，經(jīng)投射光檢查苯唑青霉素和萬(wàn)古霉素的抑菌環(huán)內(nèi)有無(wú)耐藥菌株的生長(zhǎng)。

抑菌環(huán)內(nèi)有任何生長(zhǎng)的表現(xiàn)都表明是耐藥菌株。

（2）肉眼見(jiàn)不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)的區(qū)域?yàn)橐志h(huán)邊緣，有很難辨認(rèn)的細(xì)小菌落不算。

如抑菌環(huán)內(nèi)有大量細(xì)菌生長(zhǎng)，須再移植出來(lái)，重新鑒定，重新做藥敏試驗(yàn)。

變形菌在某些抗菌藥物紙片周圍可彌漫生長(zhǎng)到抑菌的區(qū)域內(nèi)，當(dāng)抑菌環(huán)邊緣清楚，彌漫生長(zhǎng)不算。

甲氧芐氨嘧啶和磺胺藥的拮抗劑會(huì)支持細(xì)菌生長(zhǎng)，因而測(cè)這類藥時(shí)可忽略輕微生長(zhǎng)（80％以上受抑制），以濃密生長(zhǎng)的區(qū)域作為抑菌環(huán)的界限。

用加血的培養(yǎng)基測(cè)鏈球菌，測(cè)量抑菌環(huán)時(shí)不包括溶血環(huán)。

（3）參照表2的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)抑菌環(huán)的大小作出解釋，以敏感、中介或耐藥的形式解釋結(jié)果。

6 嬌嫩細(xì)菌

Mueller-Hinton培養(yǎng)基只適用于快速生長(zhǎng)的細(xì)菌，一般不適于測(cè)定嬌嫩細(xì)菌。

嬌嫩細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)如果要用紙片法做，培養(yǎng)基、質(zhì)量控制方法、解釋標(biāo)準(zhǔn)都須做修改以適合每種細(xì)菌。

以下介紹的紙片方法用于流感嗜血桿菌，淋病奈瑟氏菌和肺炎鏈球菌等嬌嫩細(xì)菌，結(jié)果是準(zhǔn)確的。

其他細(xì)菌須用稀釋法測(cè)定。

厭氧菌不能用紙片擴(kuò)散法測(cè)定抗菌藥物敏感性。

6.1 嗜血桿菌

6.1.1 培養(yǎng)基 紙片擴(kuò)散法試驗(yàn)適用的培養(yǎng)基稱為：嗜血桿菌試驗(yàn)培養(yǎng)基（HTM），配方如下：（1）Mueller-Hinton瓊脂；（2）15μg/mlNAD；（3）15μg/ml牛血紅素；（4）5μg/ml酵母粉；（5）pH7.2-7.4；配制HTM，先配制血紅素貯存液：50mg血紅素加到100ml 0.01M熱NaOH液中，攪拌至粉末完全融解。

此貯存液30ml加入到1000mlM-H瓊脂中，再加入5g酵母粉。

高壓滅菌，冷卻后，加入3mlNAD貯存液（50mgNAD溶于10ml蒸餾水，過(guò)濾除菌）。

不能用巧克力M-H瓊脂做嗜血桿菌的藥敏試驗(yàn)。

6.1.2 操作步驟 用過(guò)夜培養(yǎng)的巧克力平板上的菌落制備接種菌液，操作如下：（1）直接用過(guò)夜培養(yǎng)的巧克力平板上的菌落在M-H肉湯或生理鹽水中調(diào)制菌懸液，用光度儀與0.5麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?，校正濃度?/p>

合格的菌液濃度為：1－4×108CFU/ml。

制備菌液應(yīng)特別注意，菌液濃度過(guò)高可導(dǎo)致出現(xiàn)對(duì)某些β－內(nèi)酰胺類藥物的假耐藥結(jié)果，特別是某些產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶的流感嗜血桿菌。

菌液須在15分鐘內(nèi)使用。

（2）其他步驟按5.2操作，不同處在于：直徑150mm平板至多貼9張紙片。

（3）平板放5－7％CO2環(huán)境，35℃過(guò)夜孵育16－18小時(shí)，測(cè)量抑菌環(huán)直徑。

6.1.3 抑菌環(huán)解釋標(biāo)準(zhǔn) 嗜血桿菌應(yīng)測(cè)的藥物濃度見(jiàn)表1A，按表2A列出的抑菌環(huán)解釋標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

除此之外無(wú)需測(cè)定其他藥物。

6.2 淋病奈瑟氏菌

6.2.1 培養(yǎng)基 測(cè)定淋病奈瑟氏菌的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基是加有1％添加劑的GC瓊脂，不必補(bǔ)充其他添加劑，也不能用強(qiáng)化的巧克力瓊脂。

6.2.2 操作步驟 （1）直接用過(guò)夜培養(yǎng)的巧克力平板上的菌液在M-H肉湯或生理鹽水中調(diào)至菌懸液，用光度儀與0.5麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?，校正濃度?/p>

菌液須在15分鐘內(nèi)使用。

（2）其他步驟按5.2操作，不同之處在于：直徑150mm平板至多貼9張紙片，100mm平板至多貼4張。

（3）平板放5－7％CO2環(huán)境35℃孵育20－24小時(shí)后，測(cè)量抑菌環(huán)直徑。

6.2.3 抑菌環(huán)解釋標(biāo)準(zhǔn) 淋病奈瑟氏菌應(yīng)測(cè)的藥物見(jiàn)表1A，按表2B列出的抑菌環(huán)解釋標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

除此之外無(wú)需測(cè)其他藥物。

注：在10U青霉素紙片周圍產(chǎn)生的抑菌環(huán)≤19mm的菌株，一般均產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶。

確認(rèn)這種由質(zhì)粒決定的耐藥性菌株，應(yīng)當(dāng)做β－內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)。

質(zhì)粒決定的對(duì)四環(huán)素耐藥的菌株，抑菌環(huán)直徑≤19mm（30μg四環(huán)素紙片）。

此外，由染色體決定的對(duì)青霉素和四環(huán)素耐藥的菌株所產(chǎn)生的抑菌環(huán)較大，解釋標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2B。

6.3 肺炎鏈球菌和其他鏈球菌

6.3.1 培養(yǎng)基 用加5％脫纖維羊血的M-H瓊脂做肺炎鏈球菌和其他鏈球菌的藥敏試驗(yàn)。

6.3.2 操作步驟 （1）直接用過(guò)夜培養(yǎng)的血平板上的菌落在M-H肉湯或生理鹽水中調(diào)制菌懸液，用光度儀與0.5麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷幔Ｕ凉舛取?/p>

菌液須在15分鐘內(nèi)使用。

（2）其他步驟按5.2操作，不同處在于：直徑150mm平板至多貼9張紙片，100mm平板至多貼4張。

（3）平板放5％CO2環(huán)境35℃孵育20－24小時(shí)后，測(cè)量抑菌環(huán)直徑。

6.3.3 抑菌環(huán)解釋標(biāo)準(zhǔn) 肺炎鏈球菌和其他鏈球菌應(yīng)測(cè)的藥物見(jiàn)表1A，按表2C列出的抑菌環(huán)解釋標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

注：對(duì)青霉素敏感的菌株，苯唑西林抑菌環(huán)直徑≥20mm。

耐藥和相對(duì)耐藥的菌株抑菌環(huán)直徑≤19mm，不能報(bào)告對(duì)青霉素耐藥或中度耐藥，須測(cè)MIC。

苯唑西林藥敏結(jié)果只能推測(cè)肺炎鏈球菌對(duì)青霉素的藥敏，不能推測(cè)其他鏈球菌對(duì)青霉素的藥敏。

從無(wú)菌部位（如腦脊液、血液、骨髓等）分離的草綠色鏈球菌須測(cè)青霉素MIC。

草綠色鏈球菌的青霉素藥敏試驗(yàn)不能用紙片法。

6.4 甲氧苯青霉素耐藥的葡萄球菌 仍有不少實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)MRS時(shí)會(huì)遇到問(wèn)題，為了更好檢出這種菌株，需了解以下幾點(diǎn)：（1）用苯唑西林紙片而不是甲氧西林或乙氧西林。

因此，用1μg苯唑西林紙片檢測(cè)甲氧西林/苯唑西林的耐藥性。

（2）直接用菌懸液法（5.1.2）接種。

（3）檢測(cè)MRS必須在35℃孵育滿24小時(shí)（而不是16－18小時(shí)）。

（4）借透射光仔細(xì)檢查苯唑西林紙片周圍抑菌環(huán)內(nèi)有無(wú)細(xì)小菌落或輕微彌漫生長(zhǎng)。

（5）MRS通常對(duì)多種抗生素耐藥，包括β－內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)脂類、氯霉素類和四環(huán)素類。

了解是否多重耐藥有助于推測(cè)對(duì)甲氧西林耐藥性。

（6）如果紙片法結(jié)果有疑問(wèn)，需以篩選試驗(yàn)驗(yàn)證。

（7）甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）和甲氧西林耐藥凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)所有頭孢菌素類和β－內(nèi)酰胺類如阿莫西林/棒酸、阿莫西林/舒巴坦和依米配能耐藥，無(wú)論體外試驗(yàn)結(jié)果如何。

因?yàn)?，至今的文獻(xiàn)報(bào)道，β－內(nèi)酰胺類藥物治療甲氧西林耐藥的感染效果很差，幾乎沒(méi)有治療成功的資料。

6.5 耐藥腸球菌

6.5.1 青霉素/氨芐西林藥敏試驗(yàn) 腸球菌對(duì)青霉素和氨芐西林耐藥系因?yàn)楫a(chǎn)生低親和力的青霉素結(jié)合蛋白（PBPs），個(gè)別菌株是由于產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶。

紙片法藥敏試驗(yàn)可準(zhǔn)確測(cè)定PBPs改變的菌株，但對(duì)產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶的菌株結(jié)果不可靠。

此類菌株應(yīng)測(cè)β－內(nèi)酰胺酶。

6.5.2 萬(wàn)古霉素藥敏試驗(yàn) 腸球菌的紙片法萬(wàn)古霉素藥敏試驗(yàn)，平板必須孵育24小時(shí)（而不是16－18小時(shí)），借投射光仔細(xì)檢查抑菌環(huán)內(nèi)有無(wú)小菌落或彌漫生長(zhǎng)。

紙片法結(jié)果為中介度時(shí)應(yīng)測(cè)MIC.

6.5.3 氨基糖苷類高水平耐藥試驗(yàn) 對(duì)氨基糖苷類藥物高水平耐藥，可提示不能用青霉素或粘肽類與氨基糖苷類聯(lián)合用藥治療腸球菌的感染。

用高濃度慶大霉素（120μg）和鏈霉素（300μg）紙片篩選這類耐藥菌株。

無(wú)抑菌環(huán)為耐藥，抑菌環(huán)≥10mm為非高水平耐藥。

抑菌環(huán)在7－9mm之間再用稀釋法篩選試驗(yàn)測(cè)定。

特殊高濃度紙片的質(zhì)控見(jiàn)表3。

不必測(cè)其他氨基糖苷類藥物，因?yàn)闆](méi)有比慶大霉素或鏈霉素更強(qiáng)的同類藥。

6.6 測(cè)定產(chǎn)超廣譜β－內(nèi)酰胺酶的革蘭氏陽(yáng)性桿菌 超廣譜β－內(nèi)酰胺酶（ESBLs）是新認(rèn)識(shí)的一類由質(zhì)粒介導(dǎo)的β－內(nèi)酰胺酶，如TEM-1、TEM-2、SHV-1。

ESBLS導(dǎo)致肺炎克雷白氏菌、產(chǎn)酸克雷白氏菌、大腸埃希氏菌和另外幾種腸桿菌出現(xiàn)對(duì)頭孢三嗪、頭孢他啶、氨曲南和廣譜青霉素類及結(jié)構(gòu)相關(guān)的β－內(nèi)酰胺類藥物的耐藥。

某些ESBLs導(dǎo)致高水平耐藥，須用紙片法檢測(cè)。

另有低水平耐藥株或只能用某個(gè)β－內(nèi)酰胺類藥才能測(cè)出來(lái)。

這類菌株的MIC達(dá)不到NCCLS規(guī)定的耐藥分界點(diǎn)，但臨床治療無(wú)效。

克雷白氏菌和大腸埃希氏菌的臨床分離株如果對(duì)博拿霉素、頭孢他啶、氨曲南、頭孢胺噻肟或頭孢三嗪的抑菌環(huán)減小，提示具有ESBL。

細(xì)菌產(chǎn)生ESBL時(shí)，加入棒酸，抑菌環(huán)增大。

ESBL測(cè)定的可靠方法尚在研究中。

目前可參考表1和表4。

7 β－內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)

7.1 目的 對(duì)嗜血桿菌、淋病奈瑟氏菌和卡他莫拉氏菌，快速β－內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)比紙片法藥敏試驗(yàn)的結(jié)果快。

對(duì)產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶的腸球菌，這是唯一可靠方法。

β－內(nèi)酰胺酶試驗(yàn)陽(yáng)性可推測(cè)：（1）淋病奈瑟氏菌、嗜血桿菌、卡他布蘭漢氏菌對(duì)青霉素、氨芐青霉素和羥氨芐青霉素的耐藥；（2）葡萄球菌對(duì)青霉素及氨基、羧基和酰尿基青霉素類藥物的耐藥性。

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