熒光檢查可以檢查什么,熒光檢查的那些事

一、到底什么是熒光檢測(cè)熒光檢測(cè)是一種自然發(fā)光反應(yīng)，通過(guò)熒光素酶與ATP進(jìn)行反應(yīng)，可檢測(cè)人體細(xì)胞、細(xì)菌、霉菌、食物殘?jiān)?，?5秒鐘內(nèi)得到反應(yīng)結(jié)果。光照度通過(guò)專用設(shè)備進(jìn)行測(cè)量，并以數(shù)字形式予以表示，在1975年首先被應(yīng)用到食品工業(yè)中，在1985年在化妝品制造業(yè)中得到應(yīng)用。

熒光檢查法是一種婦科生殖系統(tǒng)疾病檢查診斷方法，比傳統(tǒng)的肉眼觀察法更客觀，靈敏度更高，實(shí)用性更強(qiáng)。提高婦科檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性，有利于及時(shí)診斷病癥，起到早治療早康復(fù)的效果，更能進(jìn)行宮頸癌和一些瘤變病癥的的早期篩查，保護(hù)婦女健康。在皮膚病中適用于細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體等病原體感染的快速診斷，以及紅斑狼瘡、皰疹樣皮炎、類天皰瘡等病的診斷。用以檢查病人的皮膚組織中有無(wú)免疫球蛋白或補(bǔ)體沉積，用特異熒光抗體直接滴加于待檢的標(biāo)本上，由熒光標(biāo)記的抗體與抗原發(fā)生特異結(jié)合。使之呈現(xiàn)熒光，根據(jù)熒光分布和形態(tài)確定抗原部位和性質(zhì)。

二、熒光檢查法的具體詳細(xì)情況（1）直接免疫熒光法

用以檢查病人的皮膚組織中有無(wú)免疫球蛋白或補(bǔ)體沉積，用特異熒光抗體直接滴加于待檢的標(biāo)本上，由熒光標(biāo)記的抗體與抗原發(fā)生特異結(jié)合。使之呈現(xiàn)熒光，根據(jù)熒光分布和形態(tài)確定抗原部位和性質(zhì)。此法用已知的抗體檢查未知的抗原，但一種標(biāo)記抗體只能查一種抗原，可直接采用病人的病變組織。如：紅斑狼瘡、皰疹樣皮炎、類天皰瘡等作冰凍切片，熒光染色。此法簡(jiǎn)單、特異。采集標(biāo)本后，直接涂于載玻片上，自然干燥后，丙酮固定10分鐘，待丙酮完全揮發(fā)后，加30 l特異性的熒光素標(biāo)記的抗體，室溫濕盒內(nèi)孵育30min，使標(biāo)記的抗體與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，取出后 蒸溜水沖洗去未結(jié)合的抗體，置熒光顯微鏡下觀察。

（2）間接免疫熒光法

用以檢測(cè)病人血清中是否存在某種特異抗體或自身抗體，反應(yīng)中的兩對(duì)抗原抗體相對(duì)應(yīng)的特異結(jié)合，而第二抗體（熒光抗體）則針對(duì)第一抗體的結(jié)合體，由于第一抗原分子可與若干個(gè)抗體分子結(jié)合，因而第二結(jié)合反應(yīng)后，靈敏度大大提高。本法常用于各種自身抗體的檢測(cè)。如：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病等。標(biāo)本采后，保存于轉(zhuǎn)送培養(yǎng)基中，臨用前混勻后取懸液涂片，固定后加入50 l用PH 7.2 PBS 1:16稀釋的特異性抗體，35℃孵育30分鐘，取出后用PH 9.0的0.01 M的磷酸鹽緩沖液浸泡10分鐘，干燥后用50 l 1:500稀釋的熒光抗體（第二抗體），35℃孵育30min，蒸溜水沖洗，干燥后甘油封固加蓋玻片鏡下觀察。

三、熒光檢測(cè)的缺點(diǎn)熒光檢測(cè)是一種自然發(fā)光反應(yīng)，通過(guò)熒光素酶與 ATP進(jìn)行反應(yīng)，可檢測(cè)人體細(xì)胞、細(xì)菌、霉菌、食物殘?jiān)?，?5秒鐘內(nèi)得到反應(yīng)結(jié)果。光照度通過(guò)專用設(shè)備進(jìn)行測(cè)量，并以數(shù)字形式予以表示，在1975年首先被應(yīng)用到食品工業(yè)中，在1985年在化妝品制造業(yè)中得到應(yīng)用。

熒光檢測(cè)的主要缺點(diǎn)在于只有少數(shù)化合物產(chǎn)生熒光。大多數(shù)的分子不發(fā)熒光，但含有可衍生的官能團(tuán)用于合成能發(fā)熒光的衍生物，例如，鄰苯二甲醛是一種常用熒光基團(tuán)用于柱后衍生氨基酸。雖然熒光檢測(cè)很靈敏，但對(duì)于常見的樣品分析來(lái)說(shuō)不需要如此高的靈敏度。因?yàn)镋LSD的響應(yīng)不依賴于熒光基團(tuán)，所以不需要衍生，因此大大降低了樣品預(yù)處理和分析時(shí)間。

此外，熒光免疫檢測(cè)技術(shù)具有專一性強(qiáng)、靈敏度高、實(shí)用性好等優(yōu)點(diǎn)，因此它被用于測(cè)量含量很低的生物活性化合物，例如蛋白質(zhì)（酶、接受體、抗體）、激素（甾族化合物、甲狀腺激素、酞激素）、藥物及微生物等 。

四、熒光檢測(cè)的使用流式

優(yōu)點(diǎn)是速度快，非常適合做大數(shù)量統(tǒng)計(jì)，且樣品只被檢測(cè)一次，完全 不用擔(dān)心熒光淬滅的問(wèn)題。缺點(diǎn)是只能檢測(cè)熒光的有無(wú)、強(qiáng)度大小，無(wú)法提供空間定位信息，無(wú)法做熒光定位變化的實(shí)驗(yàn)；由于樣品只被檢測(cè)一次，因此無(wú)法對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行連續(xù)觀察。例如，做膜蛋白定位時(shí)會(huì)得到這么一個(gè)結(jié)果——用流式可以檢測(cè)出信號(hào)，但是用顯微鏡卻看不到東西，排除儀器和濾光片選擇問(wèn)題，很可能是核的自發(fā)熒光或非特異標(biāo)記造成流式的假陽(yáng)性結(jié)果。

熒光顯微鏡

剛好與流式互補(bǔ)，可很好地進(jìn)行空間觀察，判斷目標(biāo)蛋白的定位，但是不適合做大流量檢測(cè)，估計(jì)沒(méi)人能經(jīng)得起時(shí)間的考驗(yàn)。有不同倍率的物鏡選擇，可以使用高倍物鏡看精細(xì)結(jié)構(gòu)，或用小倍率物鏡做少量統(tǒng)計(jì)。與之搭配的CCD和軟件，是系統(tǒng)能否發(fā)揮性能的關(guān)鍵。尤其是CCD，從那么多商品里選一款合適的不容易，需要了解很多知識(shí)否則只能聽別人忽悠。

共聚焦

熒光顯微鏡的升級(jí)產(chǎn)品，具有很好的光學(xué)層切效果，能得到很好三維定位信息。但是，如果使用共聚焦的目的僅僅是為你的樣品拍一張靚照，取得一張好看的圖片，就讓人覺得可惜了。共聚焦基本都是全自動(dòng)系統(tǒng)，可隨意定義照明區(qū)域、選擇多個(gè)熒光通路和設(shè)定定時(shí)取圖，所以，做Time-laps、FRAP和FRET有其獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。另外，4Pi和STED又是其中的極品，具有超高的空間分辨率，只是使用不方便，未必適合做生物實(shí)驗(yàn)。

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