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熒光檢查可以檢查什么,熒光檢查的那些事

夕陽(yáng)紅 2023-07-29 12:16:42

一、到底什么是熒光檢測(cè)熒光檢測(cè)是一種自然發(fā)光反應(yīng)

,通過熒光素酶與ATP進(jìn)行反應(yīng)
,可檢測(cè)人體細(xì)胞、細(xì)菌
、霉菌
、食物殘?jiān)?div id="4qifd00" class="flower right">
,?5秒鐘內(nèi)得到反應(yīng)結(jié)果。光照度通過專用設(shè)備進(jìn)行測(cè)量
,并以數(shù)字形式予以表示
,在1975年首先被應(yīng)用到食品工業(yè)中,在1985年在化妝品制造業(yè)中得到應(yīng)用

熒光檢查法是一種婦科生殖系統(tǒng)疾病檢查診斷方法

,比傳統(tǒng)的肉眼觀察法更客觀,靈敏度更高
,實(shí)用性更強(qiáng)
。提高婦科檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性,有利于及時(shí)診斷病癥
,起到早治療早康復(fù)的效果
,更能進(jìn)行宮頸癌和一些瘤變病癥的的早期篩查,保護(hù)婦女健康
。在皮膚病中適用于細(xì)菌
、病毒、衣原體
、支原體等病原體感染的快速診斷
,以及紅斑狼瘡、皰疹樣皮炎
、類天皰瘡等病的診斷
。用以檢查病人的皮膚組織中有無免疫球蛋白或補(bǔ)體沉積
,用特異熒光抗體直接滴加于待檢的標(biāo)本上
,由熒光標(biāo)記的抗體與抗原發(fā)生特異結(jié)合。使之呈現(xiàn)熒光
,根據(jù)熒光分布和形態(tài)確定抗原部位和性質(zhì)

二、熒光檢查法的具體詳細(xì)情況(1)直接免疫熒光法

用以檢查病人的皮膚組織中有無免疫球蛋白或補(bǔ)體沉積

,用特異熒光抗體直接滴加于待檢的標(biāo)本上
,由熒光標(biāo)記的抗體與抗原發(fā)生特異結(jié)合。使之呈現(xiàn)熒光
,根據(jù)熒光分布和形態(tài)確定抗原部位和性質(zhì)
。此法用已知的抗體檢查未知的抗原,但一種標(biāo)記抗體只能查一種抗原
,可直接采用病人的病變組織
。如:紅斑狼瘡、皰疹樣皮炎
、類天皰瘡等作冰凍切片
,熒光染色
。此法簡(jiǎn)單、特異
。采集標(biāo)本后
,直接涂于載玻片上,自然干燥后
,丙酮固定10分鐘
,待丙酮完全揮發(fā)后
,加30 l特異性的熒光素標(biāo)記的抗體
,室溫濕盒內(nèi)孵育30min
,使標(biāo)記的抗體與抗原發(fā)生特異性結(jié)合
,取出后 蒸溜水沖洗去未結(jié)合的抗體
,置熒光顯微鏡下觀察

(2)間接免疫熒光法

用以檢測(cè)病人血清中是否存在某種特異抗體或自身抗體

,反應(yīng)中的兩對(duì)抗原抗體相對(duì)應(yīng)的特異結(jié)合
,而第二抗體(熒光抗體)則針對(duì)第一抗體的結(jié)合體
,由于第一抗原分子可與若干個(gè)抗體分子結(jié)合
,因而第二結(jié)合反應(yīng)后,靈敏度大大提高
。本法常用于各種自身抗體的檢測(cè)
。如:系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病等
。標(biāo)本采后
,保存于轉(zhuǎn)送培養(yǎng)基中,臨用前混勻后取懸液涂片
,固定后加入50 l用PH 7.2 PBS 1:16稀釋的特異性抗體
,35℃孵育30分鐘,取出后用PH 9.0的0.01 M的磷酸鹽緩沖液浸泡10分鐘
,干燥后用50 l 1:500稀釋的熒光抗體(第二抗體)
,35℃孵育30min,蒸溜水沖洗
,干燥后甘油封固加蓋玻片鏡下觀察

三、熒光檢測(cè)的缺點(diǎn)熒光檢測(cè)是一種自然發(fā)光反應(yīng)

,通過熒光素酶與 ATP進(jìn)行反應(yīng)
,可檢測(cè)人體細(xì)胞、細(xì)菌
、霉菌
、食物殘?jiān)?5秒鐘內(nèi)得到反應(yīng)結(jié)果
。光照度通過專用設(shè)備進(jìn)行測(cè)量
,并以數(shù)字形式予以表示
,在1975年首先被應(yīng)用到食品工業(yè)中,在1985年在化妝品制造業(yè)中得到應(yīng)用

熒光檢測(cè)的主要缺點(diǎn)在于只有少數(shù)化合物產(chǎn)生熒光

。大多數(shù)的分子不發(fā)熒光,但含有可衍生的官能團(tuán)用于合成能發(fā)熒光的衍生物
,例如
,鄰苯二甲醛是一種常用熒光基團(tuán)用于柱后衍生氨基酸。雖然熒光檢測(cè)很靈敏
,但對(duì)于常見的樣品分析來說不需要如此高的靈敏度
。因?yàn)镋LSD的響應(yīng)不依賴于熒光基團(tuán),所以不需要衍生
,因此大大降低了樣品預(yù)處理和分析時(shí)間

此外,熒光免疫檢測(cè)技術(shù)具有專一性強(qiáng)

、靈敏度高
、實(shí)用性好等優(yōu)點(diǎn),因此它被用于測(cè)量含量很低的生物活性化合物
,例如蛋白質(zhì)(酶
、接受體、抗體)
、激素(甾族化合物
、甲狀腺激素、酞激素)
、藥物及微生物等

四、熒光檢測(cè)的使用流式

優(yōu)點(diǎn)是速度快

,非常適合做大數(shù)量統(tǒng)計(jì)
,且樣品只被檢測(cè)一次
,完全 不用擔(dān)心熒光淬滅的問題
。缺點(diǎn)是只能檢測(cè)熒光的有無、強(qiáng)度大小
,無法提供空間定位信息
,無法做熒光定位變化的實(shí)驗(yàn);由于樣品只被檢測(cè)一次
,因此無法對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行連續(xù)觀察
。例如,做膜蛋白定位時(shí)會(huì)得到這么一個(gè)結(jié)果——用流式可以檢測(cè)出信號(hào)
,但是用顯微鏡卻看不到東西
,排除儀器和濾光片選擇問題
,很可能是核的自發(fā)熒光或非特異標(biāo)記造成流式的假陽(yáng)性結(jié)果。

熒光顯微鏡

剛好與流式互補(bǔ)

,可很好地進(jìn)行空間觀察
,判斷目標(biāo)蛋白的定位,但是不適合做大流量檢測(cè)
,估計(jì)沒人能經(jīng)得起時(shí)間的考驗(yàn)
。有不同倍率的物鏡選擇,可以使用高倍物鏡看精細(xì)結(jié)構(gòu)
,或用小倍率物鏡做少量統(tǒng)計(jì)
。與之搭配的CCD和軟件,是系統(tǒng)能否發(fā)揮性能的關(guān)鍵
。尤其是CCD
,從那么多商品里選一款合適的不容易,需要了解很多知識(shí)否則只能聽別人忽悠

共聚焦

熒光顯微鏡的升級(jí)產(chǎn)品

,具有很好的光學(xué)層切效果,能得到很好三維定位信息
。但是
,如果使用共聚焦的目的僅僅是為你的樣品拍一張靚照,取得一張好看的圖片
,就讓人覺得可惜了
。共聚焦基本都是全自動(dòng)系統(tǒng),可隨意定義照明區(qū)域
、選擇多個(gè)熒光通路和設(shè)定定時(shí)取圖
,所以,做Time-laps
、FRAP和FRET有其獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)
。另外,4Pi和STED又是其中的極品
,具有超高的空間分辨率
,只是使用不方便,未必適合做生物實(shí)驗(yàn)

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