發(fā)現(xiàn)新熱穩(wěn)定性的rna連接酶

連接酶（ligase）是在細胞中發(fā)揮著關鍵性功能的酶，協(xié)助將斷裂的dna和rna鏈連接在一起。這些酶也是重要的生物工程工具，可用于基因測序、突變檢測和其他的用途。

如今，在一項新的研究中，來自美國布朗大學工程學院的研究人員發(fā)現(xiàn)一種新的實驗室使用的rna連接酶。這種被稱作kod1rnl的rna連接酶是從一種在火山熱出氣口附近茁壯成長的古生菌thermoccocus kodakarensis中獲得的，能夠在適合一些實驗室程序的高溫下發(fā)揮作用。它也是在某些被稱作模板的rna結構存在下具有最強的活性，這就使得它適用于rna測序和檢測。相關研究結果于2016年10月7日在線發(fā)表在rna biology期刊上，論文標題為“archaeal rna ligase from thermoccocus kodakarensis for template dependent ligation”。論文第一作者、布朗大學生物醫(yī)學工程研究生lei zhang說，“這種新的連接酶具有所有我們認為適合于rna操縱的性質。我們認為這可能是一種有用的加入到生物醫(yī)學工程工具箱的工具。”zhang在論文通信作者、布朗大學工程學教授anubhav tripathi實驗室開展研究。tripathi說，“我們的研究團隊的關注點總是在設計醫(yī)學診斷和分子療法（特別涉及rna）上。在很多近期的研究中，我們設計新的分子檢測和平臺來快速地檢測病毒感染和病毒突變的存在。盡管我們設計和構建微流體平臺和室內檢測，但是我們總是依靠現(xiàn)成的試劑來啟動這些檢測?！彪S著我們的設計變得更加復雜，我們在缺乏連接酶等特定酶的存在下越來越感到困難重重?！?特別地，很少有熱穩(wěn)定性的rna連接酶，即能夠在高溫下發(fā)揮作用的rna連接酶。tripathi說，在更高溫度下研究rna能夠讓事情變得更加容易。在室溫或體溫下，rna分子處于交錯雜亂中。但是，當加熱時，這種交錯雜亂的結構會松弛下來，這些分子就會伸直。 tripathi說，“當研究rna時，你經(jīng)常想要讓一種互補的核酸與它進行雜交。當rna分子是線性時，這會變得非常容易。當它混亂時，許多雜交位點被阻斷?！?問題是讓rna伸直所需的溫度經(jīng)常對rna連接酶而言太高而不能有效地將rna分子連接在一起。但是kod1rnl在高達將近140華氏度（即60攝氏度）下是有活性的，這就使得它能夠在超過體溫的條件下用于實驗室研究。 這種酶的模板依賴性也是比較重要的。一種模板依賴性的rna連接酶僅當一種模板上的一條rna鏈與另一條rna鏈在近鄰匹配時才會將這兩條rna鏈連接在一起。在這項新的研究中，zhang和tripathi利用kod1rnl將設計的探針連接在一起以便用于檢測實驗室制造出的埃博拉病毒rna轉錄本。 模板依賴性也用于檢測rna中的突變。這是通過構建rna探針---含有感興趣的突變的rna鏈---來做到這一點的。這些探針在rna鏈上發(fā)生突變的地方存在小的“缺口”。在模板依賴性的rna連接酶存在下，這些探針隨后與靶rna進行雜交或者說配對。如果突變存在于靶rna鏈上，那么這些rna探針將正確地發(fā)生雜交，而且這種缺口將被rna連接酶縫補上。如果突變不存在的話，所形成的雜合分子的結構將被破壞，rna連接酶就不會縫補這種缺口。通過研究這種缺口是否被縫補上，研究人員就能夠判斷這種突變是否存在。 這一切都依賴于這種連接酶具有多大程度的模板依賴性和結構特異性。一些連接酶天然地要比其他的連接酶具有更高的特異性。在談及kod1rnl時，zhang說，“我們發(fā)現(xiàn)它是一種高度特異性的rna連接酶。事實上，它比在實驗室中使用的現(xiàn)存的酶具有更高的特異性。” 研究人員已對這種新的rna連接酶提交了專利申請，并且希望與行業(yè)合作伙伴攜手合作，將它推向市場。

TE溶液中EDTA 和 Tris-CI 可以同時配成1L嗎？，TE 是現(xiàn)配現(xiàn)用還是可以低溫保存的？保存溫度是多少

分子生物學實驗的基礎分子生物學實驗的基礎知識2006-11-17 16:31

分子生物學的發(fā)展，核酸和蛋白質的結構，功能和生命的本質，核酸，蛋白質分子水平上的發(fā)病率，診斷，治療和預后機制的研究學科的生化基礎。基因工程（基因技術，基因重組）是一種分子生物學研究的熱點，這些技術可以改造或擴增基因和基因產(chǎn)物的痕跡對象實現(xiàn)層次分析法是研究基因表達調控，分子水平的疾病的機理，基因診斷和基因治療方法。轉換（轉換），轉，轉，轉，通常用自然的方式重組存在，而且人工重組的方式。的重組基因的克隆的目的之一（基因的克?。?，克隆理解為與模板完全的基因相同的分子結構的分子基因為模板擴增。需要分析的痕跡的研究，并將該混合靶基因易于純化，可以是增量的，便于分析。
？外源基因，導致細胞生物性狀的變化過程稱為轉化（轉化），噬菌體外源基因導入細菌稱為轉（轉）。載體（噬菌體或病毒）的遺傳物質傳遞從一臺主機到另一臺主機的過程稱為轉導（轉導）。從轉移到另一個過程的基因組的基因中的一個或一組被稱為可轉位的轉位，這些游動的基因，稱為轉座子。
？，基因工程的常用工具
？（A）載體
？向量（向量）的外源DNA（目標基因）導入宿主細胞的傳代，擴增，表達工具。的載體質粒（質粒），噬菌體，噬菌體和粘性末端的單鏈質粒（粘土），病毒，和類似物。載體具有自我復制;另外，為了方便遺傳標記的篩選和鑒定;外源DNA插入位點本身體積小等特點。
？質粒存在于多種細菌，是獨立的染色體（核）組成的雙鏈環(huán)狀DNA幾乎完全裸露，很少的蛋白質結合，比其他的遺傳因素。質粒緊與松。嚴緊型由DNA聚合酶Ⅲ復制，一個細胞可以被復制到1-5質粒。弛張型DNA聚合酶Ⅰ副本，一個細胞可以復制30-50個質粒，氯霉素阻止蛋白質的合成，有效地利用原材料，拷貝質粒載體。將所述質粒轉化常用的pBR322，pUC系列各種各樣的。這些質粒含有多個基本基因，如復制起始區(qū)域（原點的復制ORI），便于復制擴增;抗生素抗性標記（氨芐青霉素抗性四月四環(huán)素抗性TCR，等）或大腸桿菌的乳糖操縱子（大腸桿菌LacZ基因）等，以促進基因重組體的篩選;基因啟動子（乳糖操縱子的Lac，色氨酸操縱子的色氨酸，等）和轉錄終止序列，以方便插入的外源基因的轉錄，翻譯，表達。的質粒的限制性核酸內切酶的切點，即基因的插入位點，也稱為基因重組位點，基因的克隆位點。
？常見的噬菌體載體的單鏈噬菌體M13系統(tǒng);雙鏈噬菌體系統(tǒng)。噬菌體和相應的宿主細胞配合使用。最重要的載體都有自己的特點，靈活應用的方便選擇。
（B）工具酶
？工具酶的重組DNA技術是不可缺少的工具。限制性核酸內切酶，連接酶，DNA聚合酶，逆轉錄酶和核酸內切酶。
？限制性內切酶Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA切割酶分，Ⅱ嚴格識別核酸序列和切割DNA雙鏈區(qū)域的特定核苷酸的認可。它通常被稱為是Ⅱ型限制核酸內切酶。四核苷酸和六核苷酸識別序列旋轉對稱圖形。的切口分開始和粘性的端部產(chǎn)生的5'-P和3'-OH端。應用核酸內切酶的品種，要注意的溫度，緩沖液的量（平均0.1微克DNA/2-5單位的酶）和其它反應條件。
內切酶識別序列的切口
鋁Ⅰ... AGCT ...... AG CT ...四核苷酸
？... TCGA ...... TC GA ...平端的切口
生態(tài)R1 ... GAATTC ...... ?AATTC ...六核苷酸
？... CTTAAG ...... CTTAA G ...粘性末端的切口
？連接酶是噬菌體T4 DNA連接酶，T4噬菌體RNA連接酶，大腸桿菌DNA連接酶。 DNA連接酶可連接到的平面?zhèn)?，并且還連接到的粘性末端。反應中存在的Mg2 +和ATP，pH7.5的-7.6。最佳溫度為37℃，30°C或更少的活性顯著降低，但考慮到穩(wěn)定性，以被連接的DNA，和退火溫度的粘性末端，用20-25℃，大致平坦的一端連接粘端連接用12℃左右。
？聚合酶DNA聚合酶（DNA為模板合成DNA的大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ，大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段），T4或T7噬菌體DNA聚合酶等）; RNA聚合酶（DNA作為模板合成RNA，T7或T3噬菌體RNA聚合酶），逆轉錄酶（RNA為模板合成DNA，除了RNA病毒中發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌DNA聚合酶I和Taq DNA聚合酶的逆轉錄酶活性）。
？大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'，3'→5'外切核酸酶活性。 Klenow片段的DNA聚合酶I的酶枯草溶菌素生成的大片段的5'→3'聚合酶的5'→3'外切核酸酶活性，沒有3'→5'外切核酸酶活性?？捎糜谠谌笨诜g（尼克翻譯）標記的核酸也可以使用用于DNA序列測定，DNA鏈的貼劑。
？核酸酶的DNA酶，核糖核酸酶，核酸酶S1和等，可水解的相應的DNA和RNA，核酸酶S1降解單鏈DNA和RNA，增加的可生物降解的雙鏈核酸的量。它可以用于發(fā)夾環(huán)剖開的ds-cDNA的合成中產(chǎn)生。
末端轉移酶選擇的單鏈DNA的3'-OH端的Mg2 +的存在，核苷酸引物的添加，Co2 +離子存在，選擇的3'-OH末端添加核苷酸的雙鏈DNA？作為引物，以形成聚核苷酸最新。常用的一個互補的核酸末端標記和核酸連接聚尾巴（連接器）。
？堿性磷酸酶以除去5'-P防止使兩個DNA片段的5'末端的P組空間障礙影響DNA分子之間的連接，典型的載體DNA用堿性磷酸酶處理以除去5'末端的P基的P的第一載體3'末端OH基，連接酶目的基因5'端的連接，然后通過復制另一個鏈固定，從而使兩條鏈完全連接。這種方法大大提高了工作效率結扎（圖18-1）。
？
圖18-1堿性磷酸酶處理后的載體DNA靶基因的DNA連接
？其次，頭
？經(jīng)常需要研究的基因為目標基因，需要分析的基因為靶基因，被稱為插入基因的克隆過程，有時兩個，有時三個類似的意思。簡單的原核細胞的靶基因可從細胞核中直接分離，但人類基因的分布在23對染色體中，更難以得到直接的方法。簡短的目的基因的結構的理解中，或核苷酸序列編碼的結構氨基酸的多肽鏈通過理解合成的基礎上。但是，大多數(shù)的靶基因的mRNA合成的cDNA（互補的DNA，反轉錄的DNA）。 CDNA通過各種手段連接到載體，克隆的全長cDNA或其片段，可以得到用于制備探針，序列分析，基因表達等。反映基因的mRNA轉錄和后續(xù)的翻譯為研究材料，即反映了外顯子基因（DNA）的情況下。 （圖18-2）。
？
圖18-2靶基因的cDNA合成
？建立的基因庫
？基因文庫的建立的目的是為了便于保存所需的基因，擴增和純化。基因庫是使用通過基因重組技術建立的工具酶和轉化，篩選，克隆過程。實際上，使用較低的生物體，如細菌，病毒，噬菌體和其它特征與一個快速增長，生殖能力，并作為中的核酸擴增的載體，過濾器，以及更高的生物，如人類的基因或它們的片段插入工具酶，重組其中，后篩選，克隆的基因重組靶基因的載流子復合，容易保存，存取方便的基因庫?；驇斓陌谢蛑g的溝通，交換實驗室常用的方法。
？（A）重組
？許多簡單的可以用限制性核酸內切酶，分別在載體和目的籍Yinqie中相應的切口，容易連接的重組方案。也可用于結束連接酶合成的連接器（圖18-3）。在最近幾年，岡山實驗室常用的方案中，該方法可以得到全長的cDNA。
（B）轉換
？轉換目的是復制的能力，但在細胞外無復制活性的靶基因 - 裝入的細胞（E.coli）的載體的重組細胞內的復制，放大，從而使目的基因與載體。實驗過程描述如下：
？
圖18-3重組的選項之一
？⒈大腸桿菌處理（增加了膜的滲透性，易于進入細胞的基因）大腸桿菌（大腸桿菌細胞）接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。選擇3至5的菌落接種到50毫升LB培養(yǎng)基中，37℃，振蕩培養(yǎng)過夜后，A550測定，需要一定量的細菌（通常是細菌對數(shù)生長期），野生型（建議+，5x107cells /毫升）的0.2-0.3，和缺陷的類型（記錄，5x107cells/ml）為0.5-0.6。的離心的上清液被丟棄，20毫升的氯化鈣，50mmol / L時，懸浮液的細菌。冰上20分鐘，并離心。棄去上清液，用2.5毫升冰50毫摩爾/升氯化鈣懸浮。 4℃條件下48小時的轉換，感受態(tài)細胞。
？⒉質粒轉化的重組質粒（如基因重組，基因庫等創(chuàng)建的）的感受態(tài)細胞（BRL公司DH10B菌株，例如）被設置為在冰水浴。雖然Falcon2059（傳熱系數(shù)穩(wěn)定）塑料管置冰水浴。拍攝100μl的細菌懸浮液（DH10B），再加上10倍，在2059管巰基乙醇加入1μl稀釋，在冰浴中被搖動2分鐘，靜置10分鐘。 0.1加入50ng質粒轉入試管中，輕輕搖動冰浴30分鐘。此地時已經(jīng)準備就緒，42℃水浴中。和SOC培養(yǎng)基，42℃?zhèn)溆?。管被放置?2℃，45秒后，立即成立擺動冰浴中2分鐘。因此，主管細胞熱脹冷縮，質粒導入細菌細胞。再加上42℃的SOC培養(yǎng)基0.9毫升在試管中，37℃下進行1小時。 1000轉離心10分鐘，上清液懸浮的細菌200μlSOC介質。 LB-氨芐青霉素（100U/ml）接種在培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)過夜。將轉化的細胞可以形成菌落（該質粒上的氨芐青霉素抗性基因）。的菌落被確定的基礎上，約與靶基因或它們的產(chǎn)品。在LB肉湯培養(yǎng)物和擴大?；驇?，轉換，濾波，放大和純化過程是基因的克隆過程。
？LB培養(yǎng)基（1L）：10克蛋白胨，5克酵母提取物，10克氯化鈉，pH值7.5，高壓滅菌。
？SOB培養(yǎng)基（1L）：20克蛋白胨，5克酵母提取物，0.5克氯化鈉，并高壓滅菌。單獨制備的2mol / L的鎂溶液（1mol / L的氯化鎂和1mol / L硫酸鎂等量混合和過濾滅菌），在使用前加入1ml至百毫升介質。
？SOC培養(yǎng)基（100毫升）：添加1毫升使用前，2mol / L的葡??萄糖通過過濾滅菌。
？第四，分離和純化的核酸
？的核酸是存在于各種細胞，如病毒，細菌，寄生蟲，動物和植物細胞;各種標本，如血液，組織，唾液，尿等的其他來源的標本。分離方法是復雜多樣的。由于各種的DNA，RNA的豐度的差異，各種分析方法，核酸純度和量的要求是不同的，因此響應理解和選擇之前，在實驗中所使用的方法。在一般情況下，裂解細胞的基礎上，分離和純化的核酸分離和純化，通過使用苯酚和有機溶劑萃取法（核酸溶解在緩沖溶液中，即，水相）的有機溶劑如乙醇，丙酮沉淀收獲。由于不同的試樣有用SDS加氫氧化鈉有用蛋白酶溶解的細胞，一些使用方法，如超聲破碎，苯酚提取，使蛋白質變性沉淀物在有機相中，而核酸被保留在水相中，以達到目的的分離核酸。對生物標本最豐富的蛋白質實驗。為了除去殘留的有機溶劑，在分離過程中，常用的方法是添加冷乙醇和鹽以沉淀核酸，核酸中回收通過離心分離，然后用70％-80％的乙醇洗滌沉淀物以除去過量的鹽，所以不影響溶解和抑制隨后的酶促反應的步驟的核酸。除去蛋白質可與核糖核酸除去核糖核酸，得到純的DNA，用DNA酶以除去得到的RNA的DNA，以獲得純化的核酸蛋白酶。開發(fā)了許多商業(yè)核酸分離柱，可以簡單且迅速分離，從而獲得高純度的DNA或RNA。分離原理的一些使用中的核酸的分子量的差異，和一些使用的功能需要的分離的核酸，其特異性結合，實現(xiàn)分離和回收的目的。
？（A）的分離和純化該質粒
？含質粒的大腸桿菌細胞由的LB培養(yǎng)基250毫升的擴大培養(yǎng)，倒入50毫升的離心管中，4℃下，至3000rpm，離心15分鐘。棄去上清液。應進行消毒處理（丟棄，丟棄液體，以免對環(huán)境造成污染）。加裂解緩沖液（50毫摩爾/ L，葡萄糖10毫摩爾/升的EDTA，25毫摩爾/升的Tris-HCl，pH8.0）中，1 - 2毫升所以懸浮。在室溫下放置5分鐘，加入3.5毫升新鮮的制備SDS /氫氧化鈉溶液（1摩爾/升的NaOH8毫升，20％SDS2毫升蒸餾水30ml）中上下?lián)u晃，冰水浴中5分鐘。振蕩器被禁用，以防止DNA分子斷裂），加入2.5mol / L的醋酸鉀緩沖液（pH 4.8）中2.65.2毫升，垂直晃動，冰浴5分鐘。 4℃，3000轉，離心15分鐘。沉淀蛋白質。上清液中加入無水乙醇，12-24毫升（上清液兩次），以讓室溫后，萬轉離心15分鐘，棄去上清液。加上約的沉淀物體積的0.4倍TE（10 mmol / l的pH為8.0的Tris-HCl，10毫摩爾/升EDTA）溶解沉淀物，添加0.2倍7.5mol / L乙酸銨。提供旋渦混合器和混合，在冰上10分鐘。 4℃，10000RPM離心5min，取上清液丟棄。加上沉淀是0.4倍的10mmol / L的Tris-鹽酸，pH為7.5，10毫摩爾/升EDTA緩沖液中，1/10體積為5mg/ml核糖核酸酶，37℃下，30分鐘保溫。加入等量的酚（苯酚）/ CIAA（480毫升氯仿，異戊醇20毫升），和混合。 4℃，10000RPM，離心5分鐘。上層清液，加酚/ CIAA重復。的上清液溶液中加入1/10均為5mol / l的NaCl和2倍體積的無水乙醇中，-20℃過夜或-70℃2小時或更多。 4℃，萬轉離心10分鐘，并棄去上清液。加入80％乙醇，不晃動，直接萬轉離心，將上清液丟棄，并真空干燥。加入TE溶解適量（約200μL）。內容確定后備用。
？靶基因的（b）的重組質粒的分離和純化
？先取少量純化的重組質粒，限制性內切酶消化，電泳分離的靶基因，確認。的200μl含2mg DNA（重組質粒），例如：加入10μl含100μg的DNA，加90μlTE。 ,1-2小時，1/10體積的緩沖液孵育1微克DNA加2-5U的限制性核酸內切酶。的類型的緩沖液和酶反應溫度的核酸內切酶的類型的不同而不同。 1/10體積為3mol /升乙酸鈉，2倍的乙醇，-70℃下，2小時（-20℃過夜），10,000 rpm下，10分鐘離心，棄去上清液（乙醇沉淀）。適當量的沉淀物溶解在TE（切割質粒DNA與靶基因的混合物）電泳分離（同時與相應的分子量DNA標準電泳）和可視化在UV光下的結果的比較，與一個標準的DNA分子量，以確認靶基因和核酸內切酶切割效果。
？⒈電泳條件：
凝膠制劑：1％瓊脂糖凝膠瓊脂糖（毫克）X50TAE（毫升）EB（溴化乙錠微升）
？？（瓊脂糖）1000 2.0 4.0
？總體積（ml）
？100
膠的濃度（％）：0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
長度的DNA（KB）：60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1
電泳緩沖液：X50TAE（毫升）EB（μl）的總體積（ml）
？20301000
？X50TAE：Trisma基地54克，鈦57.1毫升0.5M EDTA pH值8.020毫升蒸餾水至1000ml。
？EB：10mg/ml的溴化乙錠。 （EB致癌性，操作應小心）。
電泳后，以適當?shù)腄NA（重組質粒）同上條件下切斷，用1.5％的熔點低（<65℃熔點）的瓊脂糖凝膠電泳分離。？含有該基因的區(qū)域的紫外線光下，切出與（凝膠），并放置在離心管中，提取和純化。
？⒉從低熔點凝膠中提取和純化的DNA片段加上相同的凝膠體積的TE（10 mmol / l的pH為8.0的Tris-HCl，0.1 mmol / L的乙二胺四乙酸），設定為65℃的水浴中溫育5分鐘，將凝膠完全溶解。放至室溫，并加入等量的苯酚（TE飽和，TE閉合，在上部酚以較低者為準），輕輕混勻（不攪拌），12000rpm進，3分鐘離心。重復1-2次。的上清液溶液中加入0.1體積的3mol / L的乙酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積的乙醇??，并進行乙醇沉淀。將純化的DNA溶解于TE加適量確定的內容，備用（可用于基因結構分析的目的，制備探針，等）。除了的低熔點凝膠回收方法，如一般的一個簡短的電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心法，回收DNA片段的凝膠可用透析。
？（C）的樣品DNA的分離和純化
嗎？5-10毫升的1xNTE（，EDTA的Tris-HCl pH7.4的10毫摩爾/升的NaCl 100毫摩爾/ L，1mmol / L的pH值8.0），以調節(jié)細胞是2×107（組織應切碎設置在液氮中冷凍，高速度攪拌切粉，和緩沖液）中的溶液。 λ/10~~λ/20體積（V）的10mg/ml的蛋白酶（Sigma公司Ⅷ型），1/20v 10％SDS，37℃下進行2小時。加入等量的苯酚/ 3xNTE的（3xNTE的信件）和混合（至少7分鐘）。 4℃，3000rpm時10分鐘。的上清液，加入2ml TE（的Tris-HCl，10毫摩爾/ L，pH值7.5，EDTA 1毫摩爾/ L，pH值8.0），調勻。乙醇沉淀。 2mlTE溶解的沉淀物。加1/30xNTE，蛋白酶K（10mg/ml的）被用來代替蛋白酶重復2-4步驟。含量的測定。
？（四）的樣品，純化的RNA被隔離
？純化含有106細胞溶液等量的溶液[4 mol / L時，胍基硫氰酸酯，25毫摩爾/ L的檸檬酸pH值7.0，0.5％肌氨酸鹽（十二烷基肌氨酸鈉）和0.1mol / L的2 - 巰基乙醇]?？傮w積的細胞沉淀的4-5倍，并混合。加0.1體積為2ml / L，醋酸鈉（pH為4.1），1倍體積的苯酚（重蒸水密封），振動篩，0.2體積CIAA劇烈混合10秒鐘。冰水浴中15分鐘。 10000xg4℃，20分鐘。離心（不帶剎車）。小心去除上清。添加等量的丙酮（或乙醇（2次）），-20℃，60分鐘或更長。 10000×g下，4℃下進行20分鐘離心。棄去上清液，。加上約0.3毫升純化溶液與1.5ml離心管，3）的步驟被重復，離心10分鐘，棄去上清液。 75％的乙醇，4℃10分鐘離心，10000×g離心。棄去上清液，。在真空下干燥15分鐘，和待機時間。
？五探針制備
？探針制備是標記的靶基因，核酸標記的缺口翻譯方法，隨機引物法，末端標記法和等常用的方法。該標記物質的放射性元素（如32P等）和非放射性物質（如生物素，地高辛，等）。 32P是最常見的核苷酸標記的同位素標記的dNTP的磷酸基團，容易標記，其特征在于，高活性，最多9000Ci/mmol;發(fā)射高能量的β-射線，最多1.70MeV的標記的自顯影時間探測與其所短，靈敏度高。 32P的半衰期為14天，超過標準的，一般標記，使用一個星期內，即使它的不方便，但利用廢物處理，以減輕壓力。 32P標記應注意保護，1-1.5cm厚的聚甲基丙烯酸甲酯有機玻璃隔離保護動作，應避免直接接觸。胸部的經(jīng)營者應穿戴個人儀表，定期檢測。的實驗中，應用程序特定的探測器（蓋革 - 米勒探測器），檢查的工作區(qū)，手，衣服等，以避免污染發(fā)生。其他同位素標記的，還應當指出的輻射防護。
？的非放射性標記的ELISA和化學符號。的ELISA法和免疫測定ELISA方法是類似的，除了被標記，而不是該核酸的標記抗體，其實，也稱為標記抗體作為探針，應當指出的文獻讀取。許多商品是生物素（生物素），分別與地高辛，生物素-dUTP標記，生物素的DATP地高辛-dUTP的，等等。血凝素（抗生物素蛋白）是已知的一個非常高的親和性和生物過氧化物酶或堿性磷酸酶（血凝素 - 酶），血凝素標記時，最終形成的雜交反應：探針 - 生物素數(shù) - 血凝素 - 酶復合物（A，B，C）。酶催化底物顯色，觀察結果。不同于一般的酶反應底物，ABC法底物顯色不溶物，觀察結果。酶的復數(shù)形式，重現(xiàn)性差，成本高，但易于運輸保存，靈敏度和輻射標記的相當可觀的。某些化學??標記是使用相應的酶標記的抗體，以形成特定的復合物，上述方法比較，和一些可以是自發(fā)光的。化學標記方法簡單，成本低，但靈敏度相對較低。

信使RNA的合成與加工

一、定義
一轉錄單位
二啟動子（promoter）
三終止子（terminator）
二、RNA聚合酶
一酶的特性：以4種NTP為底物，需模板和鎂離子，合成方向也是5’－3’，但不需要引物。
二酶的分類：
1．噬菌體的RNA聚合酶結構簡單，是單鏈蛋白，功能也簡單。
2．細菌則具有復雜的多亞基結構（450Kd），可識別并轉錄超過1000個轉錄單位。
3．真核生物的酶有多種，根據(jù)a－鵝膏蕈堿（環(huán)狀8肽，阻斷RNA延伸）的抑制作用可分為三類：聚合酶A對它不敏感，分布于核仁，轉錄核糖體RNA；聚合酶B對低濃度敏感，存在于核質，轉錄信使RNA；聚合酶C位于核質，對高濃度敏感，轉錄小分子量RNA，如轉運RNA、5SRNA等。各種RNA聚合酶都是由10-15種不同亞基組成的多亞基復合物。
4． 線粒體和葉綠體也有RNA聚合酶，結構簡單，能合成所有種類RNA。
三酶的構成：大腸桿菌的全酶有5個亞基（α2ββ’ωσ），含2個鋅。β催化形成磷酸二酯鍵，β’結合模板，σ亞基稱為起始因子，可使RNA聚合酶穩(wěn)定地結合到啟動子上。ββ’ωσ稱為核心酶。σ亞基在不同菌種間變動較大，而核心酶比較恒定。酶與不同啟動子的結合能力不同，不同啟動因子可識別不同的啟動子。σ70識別啟動子共有序列，σ32識別熱休克基因，σ60在氮饑餓時起作用。σ通過隨機移動起作用，不需解鏈。
四模板：以完整雙鏈DNA為模板，其中僅一條鏈可轉錄。轉錄時局部解鏈，轉錄后DNA重新形成雙螺旋結構，所以DNA是全保留的。
三、轉錄過程
分為起始、延長和終止三個階段。起始包括對雙鏈DNA特定部位的識別、局部（17bp）解鏈以及在最初兩個核苷酸間形成磷酸二酯鍵。第一個核苷酸摻入的位置稱為轉錄起點。
起始后起始因子離開，核心酶構象改變，沿模板移動，轉錄生成雜交雙鏈（12bp）。隨后DNA互補鏈取代RNA鏈，恢復DNA雙螺旋結構。延伸速度為50nt/s，酶移動17nm。錯誤幾率為10-5。
聚合酶到達終點時，在終止輔助因子的幫助下停止反應，酶和RNA鏈脫落，轉錄結束。
四、啟動子和轉錄因子
一定義：酶識別、結合、開始轉錄的一段DNA序列。強啟動子2秒鐘啟動一次轉錄，弱啟動子10分鐘一次。
二原核生物：大腸桿菌在起點上游約－10堿基對處有保守序列TATAAT，稱為pribnow box，有助于局部解鏈。在其上游還有TTGACA，稱為－35序列，提供RNA聚合酶識別的信號。
三真核生物：復雜，差異較大。
1．信使RNA的啟動子通常有三個保守區(qū)，－25到－30有TATA框，是解鏈位置，并決定轉錄起點；－75位置有CAAT框，與RNA聚合酶的結合有關；更上游還有GC框，某些轉錄因子可結合。后兩個稱為上游因子，對轉錄起始頻率有較大影響；
2． 小RNA的啟動子在轉錄區(qū)內部，有一些輔助因子幫助RNA聚合酶識別。
五、終止子和終止因子
一定義
二所有原核生物的終止子在終點之前都有一個回文結構，可使酶減慢移動或暫停合成。大腸桿菌有兩類終止子：
1． 簡單終止子，回文區(qū)有一段富含GC對的序列，回文后有寡聚尿苷。
2．依賴ρ的終止子，必須在有ρ因子時才能發(fā)揮作用，不含GC對，也無寡聚尿苷。ρ因子是蛋白質，可與酶作用，釋放RNA，并使酶脫離。
三某些因子可使酶越過終止子繼續(xù)轉錄，稱為通讀。常見于某些噬菌體的時序控制，早期基因與晚期基因以終止子相隔，早期基因產(chǎn)生抗終止因子，使發(fā)生通讀以表達晚期基因。
六、轉錄的調控
一遺傳信息的表達有時序調控和適應調控，轉錄水平的調控是關鍵環(huán)節(jié)，因為這是表達的第一步。轉錄調控主要發(fā)生在起始和終止階段。
二操縱子是細菌基因表達和調控的單位，有正調節(jié)和負調節(jié)因子。阻遏蛋白的作用屬于負調控。環(huán)腺苷酸通過其受體蛋白（CRP）促進轉錄，可促進許多誘導酶的合成。操縱子可構成綜合性調控網(wǎng)絡，如SOS反應等。對終止子也有調控作用，如衰減子。
三真核生物不組成操縱子，而是通過激素、生長因子等進行調控。某些DNA序列對轉錄起增強作用，稱為增強子。 一、原核生物
一核糖體RNA：大腸桿菌共有7個核糖體RNA的轉錄單位，每個轉錄單位由16S、23S、5SRNA和若干轉運RNA基因組成。16S和23S之間常由轉運RNA隔開。轉錄產(chǎn)物在RNA酶III的作用下裂解產(chǎn)生核糖體RNA的前體P16和P23，再由相應成熟酶加工切除附加序列。前體加工時還進行甲基化，產(chǎn)生修飾成分，特別是a-甲基核苷。N4,2’-O二甲基胞苷（m4Cm）是16S核糖體RNA特有成分。5S核糖體RNA一般無修飾成分。
二轉運RNA：有60個基因，其加工包括：
1．內切酶在兩端切斷，大腸桿菌RNA酶P是5’成熟酶；
2.外切酶從3’修剪，除去附加順序。RNA酶D是3’成熟酶；
3．3’端加上CCAOH，由轉運RNA核苷酰轉移酶催化，某些轉運RNA已有，切除附加序列后即露出；
4．核苷的修飾：修飾成分包括甲基化堿基和假尿苷，修飾酶具有高度特異性。甲基化對堿基和序列都有嚴格要求，一般以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體。
三信使RNA：細菌多數(shù)不用加工，轉錄與翻譯是偶聯(lián)的。也有少數(shù)多順反子信使RNA必須由內切酶切成較小的單位，然后翻譯。如核糖體大亞基蛋白與RNA聚合酶的b亞基基因組成混合操縱子，轉錄后需經(jīng)RNA酶III切開，各自翻譯。因為RNA聚合酶的合成水平低得多，切開有利于各自的翻譯調控。較長的RNA會產(chǎn)生高級結構，不利于翻譯，切開可改變其結構，從而影響其功能。
二、真核生物
一核糖體RNA：基因拷貝數(shù)多，在幾十到幾千之間?；虺纱嘏帕性谝黄?，由RNA聚合酶I轉錄生成一個較長的前體，哺乳動物為45S。核仁是rRNA合成與核糖體亞基生物合成的場所。 RNA酶III等核酸內切酶在加工中起重要作用。5SRNA基因也是成簇排列的，由RNA聚合酶III轉錄，經(jīng)加工參與構成大亞基。核糖體RNA可被甲基化，主要在核苷2’羥基，比原核生物甲基化程度高。多數(shù)核糖體RNA沒有內含子，有些有內含子但不轉錄。
二轉運RNA：由RNA聚合酶III轉錄，加工與原核相似，但3’端的CCA都是后加的，還有2’-O-甲基核糖。
三信使RNA：真核生物編碼蛋白質的基因以單個基因為轉錄單位，但有內含子，需切除。信使RNA的原初轉錄產(chǎn)物是分子量很大的前體，在核內加工時形成大小不等的中間物，稱為核內不均一RNA(hnRNA）。其加工過程包括：
1．5’端加帽子：在轉錄的早期或轉錄終止前已經(jīng)形成。首先從5’端脫去一個磷酸，再與GTP生成5’，5’三磷酸相連的鍵，最后以S-腺苷甲硫氨酸進行甲基化，形成帽子結構。帽子結構有多種，起識別和穩(wěn)定作用。
2． 3’端加尾：在核內完成。先由RNA酶III在3’端切斷，再由多聚腺苷酸聚合酶加尾。尾與通過核膜有關，還可防止核酸外切酶降解。
3． 內部甲基化：主要是6-甲基腺嘌呤，在hnRNA中已經(jīng)存在?？赡軐η绑w的加工起識別作用。
三、RNA的拼接
一轉運RNA的拼接：由酶催化，酶識別共同的二級結構，而不是序列。通常內含子插入到靠近反密碼子處，與反密碼子配對，取代反密碼子環(huán)。第一步由內切酶切除插入序列，不需ATP；第二步由RNA連接酶連接，需要ATP。
二四膜蟲核糖體RNA的拼接：某些四膜蟲26S核糖體RNA基因中有一個內含子，其拼接只需一價和二價陽離子及鳥苷酸或鳥苷存在即可自發(fā)進行。其實質是磷酸酯的轉移反應，鳥苷酸起輔助因子的作用，提供游離3’羥基。
三信使RNA：真核生物編碼蛋白質的核基因的內含子屬于第二類內含子，左端為GT，右端為AG。先在左端切開，產(chǎn)生的5’末端與3’端上游形成5’，2’-磷酸二酯鍵，構成套索結構。然后內含子右端切開，兩個外顯子連接起來。通過不同的拼接方式，可形成不同的信使RNA。 一、噬菌體QbRNA的復制
其RNA是單鏈，正鏈，侵入大腸桿菌后立即翻譯，產(chǎn)生復制酶的b亞基，與宿主的三個亞基（α為核糖體蛋白，γ、δ均為肽鏈延長因子）構成復制酶，進行復制。先以正鏈為模板合成負鏈，再根據(jù)負鏈合成正鏈。合成負鏈時需要宿主的兩個蛋白因子，合成正鏈則不需要，所以可大量合成。病毒的蛋白質合成受RNA高級結構的調控。
二、病毒RNA復制的主要方式
一病毒含正鏈RNA，先合成復制酶，復制后合成其他蛋白質進行裝配。如噬菌體Qb及灰質炎病毒。
二病毒含負鏈和復制酶，先合成正鏈，再合成病毒蛋白和復制病毒RNA。如狂犬病毒。
三病毒含雙鏈RNA和復制酶，如呼腸孤病毒。先復制正鏈，再翻譯成病毒蛋白，最后合成負鏈，形成雙鏈RNA分子。
四致癌RNA病毒：如白血病病毒和肉瘤病毒，先逆轉錄生成DNA前病毒，再轉錄、翻譯。
第四節(jié) RNA生物合成的抑制劑
一、堿基類似物
有些人工合成的堿基類似物能干擾和抑制核酸的合成。作用方式有以下兩類：
一作為代謝拮抗物，直接抑制核苷酸生物合成有關酶類。如6-巰基嘌呤進入體內后可轉變?yōu)閹€基嘌呤核苷酸，抑制嘌呤核苷酸的合成?？勺鳛榭拱┧幬铮委熂毙园籽〉?。此類物質一般需轉變?yōu)橄鄳暮塑账岵拍鼙憩F(xiàn)出抑制作用。
二進入核酸分子，形成異常RNA或DNA，影響核酸的功能并導致突變。5-氟尿嘧啶類似尿嘧啶，可進入RNA，與腺嘌呤配對或異構成烯醇式與鳥嘌呤配對，使A-T對轉變?yōu)镚-C對。因為正常細胞可將其分解，而癌細胞不能，所以可選擇性抑制癌細胞生長。
二、DNA模板功能抑制物
一烷化劑：帶有活性烷基，能使DNA烷基化。鳥嘌呤烷化后易脫落，雙功能烷化劑可造成雙鏈交聯(lián)，磷酸基烷化可導致DNA鏈斷裂。通常有較大毒性，引起突變或致癌。
二放線菌素類：可與DNA形成非共價復合物，抑制其模板功能。包括一些抗癌抗生素。
三嵌入染料：含有扁平芳香族發(fā)色團，可插入雙鏈DNA相鄰堿基對之間。常含丫啶或菲啶環(huán)，與堿基大小類似，可在復制時增加一個核苷酸，導致移碼突變。如溴乙啶。
三、RNA聚合酶抑制劑
一利福霉素：抑制細菌RNA聚合酶活性。
二利鏈菌素：與細菌RNA聚合酶b亞基結合，抑制RNA鏈的延長。
a-鵝膏蕈堿：抑制真核生物RNA聚合酶。

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