，細胞正常情況下很少發(fā)生自噬，除非有誘發(fā)因素的存在
。這些誘發(fā)因素很多
，也是研究的熱門
。既有來自于細胞外的（如外界中的營養(yǎng)成分
、缺血缺氧
、生長因子的濃度等），也有細胞內(nèi)的（代謝壓力
、衰老或破損的細胞器、折疊錯誤或聚集的蛋白質(zhì)等）
。由于這些因素的經(jīng)常性存在
，因此
，細胞保持了一種很低的
、基礎(chǔ)的自噬活性以維持自穩(wěn)
。
2）自噬過程很快
，被誘導(dǎo)后8min即可觀察到自噬體（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶體（autolysosome）基本降解消失
。這有利于細胞快速適應(yīng)惡劣環(huán)境。
3）自噬的可誘導(dǎo)特性：表現(xiàn)在2個方面，第一是自噬相關(guān)蛋白的快速合成
，這是準備階段。第二是自噬體的快速大量形成
，這是執(zhí)行階段
。
4）批量降解：這是與蛋白酶體降解途徑的顯著區(qū)別
5）“捕獲”胞漿成分的非特異性：由于自噬的速度要快
、量要大
，因此特異性不是首先考慮的
，這與自噬的應(yīng)急特性是相適應(yīng)的
。
6）自噬的保守性：由于自噬有利于細胞的存活
，因此無論是物種間、還是各細胞類型之間（包括腫瘤細胞）
，自噬都普遍被保留下來（誰不喜歡留一手呢？）
。
4
、自噬過程的調(diào)控： 從上面總結(jié)的自噬特點中可以看出
，自噬這一過程一旦啟動
，必須在度過危機后適時停止，否則
，其非特異性捕獲胞漿成分的特性將導(dǎo)致細胞發(fā)生不可逆的損傷。這也提醒我們在研究自噬時一定要動態(tài)觀察
，任何橫斷面的研究結(jié)果都不足以評價自噬的活性。目前
，已經(jīng)報告了很多因素能誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬
，如饑餓
、生長因子缺乏
、微生物感染、細胞器損傷
、蛋白質(zhì)折疊錯誤或聚集
、DNA損傷、放療
、化療等等
，這么多刺激信號如何傳遞的
、哪些自噬蛋白接受信號
、又有哪些自噬蛋白去執(zhí)行等很多問題都還在等待進一步解答中
。
關(guān)于傳遞自噬信號的通路目前比較肯定的有：
抑制類
1）Class?I?PI3K?pathway（PI-phosphatidylinositol
，磷脂酰肌醇）與IRS?(Insulin?receptor?substrate)結(jié)合
，接受胰島素受體傳來的信號（血糖水平高抑制自噬）
2）mTOR?pathway（mammalian?target?of?rapamycin）
mTOR在人類中的同源基因是FRAP1（FK506?binding?protein?12-rapamycin?associated?protein?1），是一個絲/蘇氨酸蛋白激酶
。能接受多種上游信號，如Class?I?PI3K
、IGF-1/2、MAPK
，能感受營養(yǎng)和能量的變化,rapamycin是最典型最常用的自噬激動劑.
激活類
1）Class?III?PI3K
結(jié)構(gòu)上類似于Class?I?PI3K，但作用相反
。3-MA是Class?III?PI3K的抑制劑,因此3-MA可以作為自噬的抑制劑.
5
、自噬的研究方法： 正常培養(yǎng)的細胞自噬活性很低，不適于觀察
，因此，必須對自噬進行人工干預(yù)和調(diào)節(jié)
，經(jīng)報道的工具藥有：
（一）自噬誘導(dǎo)劑
? ?1）Bredeldin A /Thapsigargin / Tunicamycin?：? 模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
2
）Carbamazepine/L-690
，330/ LithiumChloride（氯化鋰）： IMPase?抑制劑 （即Inositolmonophosphatase
，肌醇單磷酸酶）
3
）Earle's平衡鹽溶液：? 制造饑餓
4
）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3KPathway抑制劑
5
）Rapamycin：mTOR抑制劑
6
）Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑
（二）自噬抑制劑
1
）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）?hVps34?抑制劑
2
）Bafilomycin A1：質(zhì)子泵抑制劑
3
）Hydroxychloroquine（羥氯喹）：Lysosomal lumenalkalizer（溶酶體腔堿化劑）除了選用上述工具藥外，一般還需結(jié)合遺傳學(xué)技術(shù)對自噬相關(guān)基因進行干預(yù)：包括反義RNA干擾技術(shù)（Knockdown）
、突變株篩選
、外源基因?qū)氲取?br>
細胞經(jīng)誘導(dǎo)或抑制后
，需對自噬過程進行觀察和檢測
，常用的策略和技術(shù)有：
1）觀察自噬體的形成
由于自噬體屬于亞細胞結(jié)構(gòu)
，普通光鏡下看不到
，因此
，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為：新月狀或杯狀
，雙層或多層膜
，有包繞胞漿成分的趨勢
。自噬體（AV1）的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)
，內(nèi)含胞漿成分
，如線粒體
、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)
、核糖體等
。自噬溶酶體（AV2）的特征為：單層膜
，胞漿成分已降解。（autophagic?vacuole
，AV）
2）在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3等融合蛋白來示蹤自噬形成：(常用)
GFP-LC3單熒光指示體系：由于電鏡耗時長
，不利于監(jiān)測（Monitoring）自噬形成
。我們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了GFP-LC3指示技術(shù)：無自噬時
，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中
；自噬形成時
，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜
，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點
，一個斑點相當于一個自噬體
，可以通過計數(shù)來評價自噬活性的高低。雙熒光指示體系：漢恒生物科技（上海）有限公司已開發(fā)出用于表達mRFP-GFP-LC3融合蛋白的病毒產(chǎn)品
。mRFP用于標記及追蹤LC3，GFP的減弱可指示溶酶體與自噬小體的融合形成自噬溶酶體
，即由于GFP熒光蛋白對酸性敏感
，當自噬體與溶酶體融合后GFP熒光發(fā)生淬滅,此時只能檢測到紅色熒光。
3）利用Western?Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價自噬形成
。
自噬形成時，胞漿型LC3（即LC3-I）會酶解掉一小段多肽
，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-II）
，因此，LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低
。
(Note：LC3抗體對LC3-II有更高的親和力，會造成假陽性
。方法2和3需結(jié)合使用
，同時需考慮溶酶體活性的影響)
4)?利用Western?Blot檢測p62蛋白來評價自噬以及自噬流的強弱:起初自噬所降解的底物被認為是隨機的,但是后來的研究表明有些蛋白是選擇性降解的,在這些蛋白之中研究的最為透徹的是p62蛋白
，p62蛋白水平的多少與自噬流的強弱有著反比例關(guān)系
。
5）MDC或者Cyto-ID染色：包括自噬體
，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的
。
6）Cell Tracker?TM?Green染色：主要用于雙染色
，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的
。
6、自噬體的發(fā)生： 目前認為，自噬體的膜不是直接來源于高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)
，而是在胞漿中重新生成的，但具體的機制尚不清楚
。當beclin-1被活化后，胞漿中先形成很多個membrane source（自噬體膜發(fā)生中心）
，在它們不斷擴展的過程中(phagophore到autolysosome)
，VMP1蛋白由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體轉(zhuǎn)位到自噬體膜上（VMP1又叫TMEM49
，已知唯一與自噬有關(guān)的? 跨膜 蛋白）
，同時，MAP1-LC3由胞漿型（即LC3-I）轉(zhuǎn)位到自噬體膜（即LC3-II）
，LC3這一轉(zhuǎn)變過程可被Western Blot和熒光顯微鏡檢測到
，現(xiàn)已成為監(jiān)測自噬體形成的推薦方法
。
7
、自噬與細胞死亡的關(guān)系：
? ? ? 有必要說明一下的是，細胞死亡是一個非常復(fù)雜的過程
，為了研究方便
，需進行分類
，但我們思考時不要局限于這些?人為的分類，而應(yīng)注重于現(xiàn)象本身來研究其背后的機制
。
? ? ??一直以來人們從不同角度
、用不同方法來觀察細胞的死亡，并把細胞的死亡方式分為2類：壞死和凋亡
，因為兩者有著明顯的區(qū)別，其中最主要的區(qū)別之一就是細胞膜的通透性——壞死細胞的細胞膜喪失了完整性
，內(nèi)容物被釋放出來
，染料可自由進入細胞
，而凋亡細胞保持完整
，無內(nèi)容物釋放，染料也被排斥
。很多實驗亦根據(jù)這一原理來設(shè)計以區(qū)分壞死和凋亡
，這將在后面一一介紹
，如同剛剛說明的那樣
，這些實驗只能說明細胞膜的通透性（必要條件，不是充分必要條件）
，而不能用來證實壞死細胞或凋亡細胞
。一般認為壞死是被動的
，不可控的
，而凋亡是主動的，可控的
。為了強調(diào)這一點
，凋亡被定義為程序性細胞死亡（program celldeath
，PCD）
。但無論是壞死還是凋亡
，都是一個過程
，是需要時間的（尤其是凋亡
，從啟動到完成
，細胞要執(zhí)行很多反應(yīng)）
，而且細胞死亡后都有“尸體”。
在研究自噬與凋亡的關(guān)系時
，人們發(fā)現(xiàn)細胞死亡前胞漿中存在大量的自噬體或自噬溶酶體
，但這樣的細胞缺乏凋亡的典型特點
，如核固縮（pyknosis）,?核破裂（karyorhexis）
、細胞皺縮（shrinkage）、沒有凋亡小體的形成等
，被稱為自噬樣細胞死亡（autophagic celldeath
，ACD）
，它是一種新的細胞程序性死亡
，為了與凋亡區(qū)別
，被命名為Type II cell death
，相應(yīng)的
，凋亡為Type I cell death
，壞死為Type III cell death。盡管這樣
，但對于自噬是否是細胞死亡的直接原因目前還存在很大的爭議
。到底是Cell death? by? autophagy（自噬引起死亡）還是Cell death? with ?autophagy（死亡時有自噬發(fā)生，但不是直接原因）
？對此，自噬研究領(lǐng)域“大?div id="jfovm50" class="index-wrap">！奔墝＜襆evine Beth在一篇nature的Review中表達了自己的觀點
。由于在形態(tài)學(xué)上2者無明顯區(qū)別
，但通過阻斷自噬
，觀察細胞的結(jié)局可區(qū)分開來：Cell death? by ?autophagy細胞存活，而Cell death? with ?autophagy細胞死亡
。
8
、自噬與腫瘤的關(guān)系：
? ? ? 與凋亡（在腫瘤細胞中一般都存在缺限）不同
，自噬是被優(yōu)先保留的
。無論是腫瘤細胞還是正常細胞
，保持一種基礎(chǔ)
、低水平的自噬活性是至關(guān)重要的
。因為細胞中隨時產(chǎn)生的“垃圾”（破損或衰老的細胞器
、長壽命蛋白質(zhì)
、錯誤合成或折疊錯誤的蛋白質(zhì)等等）都需要及時清除，而這主要靠自噬來完成
，因此，? 自噬具有維持細胞自穩(wěn)的功能
；如果將自噬相關(guān)基因突變失活
，如神經(jīng)元會發(fā)生大量聚集蛋白
，并出現(xiàn)神經(jīng)元退化
。同時
，自噬的產(chǎn)物
，如氨基酸
、脂肪酸等小分子物質(zhì)又可為細胞提供一定的能量和合成底物
，可以說
，? 自噬就是一個“備用倉庫”
。如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就會餓死
。更重要的是
，自噬活性可在代謝應(yīng)激（饑餓、生長因子缺乏
、射線
、化療等）時大大增強
，表現(xiàn)為胞漿中迅速涌現(xiàn)大量自噬體
，這一現(xiàn)象被稱為“自噬潮”（autophagic flux）
，廣泛用于自噬形成的監(jiān)測
。自噬潮為細胞度過危機提供了緊急的營養(yǎng)和能量支持
，有利于細胞的存活
。
鑒于自噬的上述作用，自噬可為腫瘤細胞帶來幾大好處：
1
）腫瘤細胞本身就具有高代謝的特點
，對營養(yǎng)和能量的需求比正常細胞更高，但腫瘤微環(huán)境往往不能如意
，如腫瘤發(fā)生初始期到血管發(fā)生之前
、腫瘤長大發(fā)生血管崩塌時、腫瘤細胞脫離原發(fā)灶游走時等都會出現(xiàn)營養(yǎng)不足或供應(yīng)中斷
，而此時提高自噬活性可以有助于度過這一危機。
2）當化療
、放療后
，腫瘤細胞會產(chǎn)生大量的破損細胞器
、損壞的蛋白質(zhì)等有害成分
，而此時提高自噬活性可及時清除這些有害物質(zhì)
，并提供應(yīng)急的底物和能量為修復(fù)受損DNA贏得時間和條件
。由于自噬減少了腫瘤細胞在代謝應(yīng)激時發(fā)生壞死的機會，而對于腫瘤細胞群體而言
，需要一部分細胞發(fā)生壞死，以引發(fā)適度的炎癥（有利于血管的長入
、吸引免疫細胞分泌生長因子等）。研究發(fā)現(xiàn)
，很多類型的腫瘤在代謝應(yīng)激時會“組成性”活化PI3K信號以抑制自噬（由于凋亡通路已受阻
，抑制自噬會促進壞死）
，但具體機制尚不清楚
。
自噬與腫瘤的關(guān)系可能是雙重的
。①對不同的細胞，自噬的作用可能不同
。②相同的細胞在不同的外部因素作用時
，自噬的作用可能不同。③在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段
，自噬的作用可能不同。腫瘤生長的早期階段自噬增強
，是由于此時腫瘤的血管化作用不足
，癌細胞的營養(yǎng)供給有限，需要通過自噬為自身提供營養(yǎng)
。腫瘤進入發(fā)展階段后基因變異積累，使包括?Beclin?1在內(nèi)的眾多抑癌基因失活
，自噬活力降低。④對單個細胞和對整個腫瘤阻滯的作用可能不同
。自噬功能不全的細胞易于壞死
，但是壞死組織產(chǎn)生的細胞因子（包括部分生長因子）反而會促進腫瘤的生長。上述各種假設(shè)均有待證實
。腫瘤為細胞分化障礙性的疾病已得到肯定，但自噬在腫瘤細胞的分化抑制過程中起著什么樣的作用
，自噬水平提高是抑制分化甚至導(dǎo)致去分化還是促進分化等問題尚未解決
。
9
、在研究自噬相關(guān)蛋白時
，需對其進行定位
。由于自噬體與溶酶體、線粒體
、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)
、高爾基體關(guān)系密切，為了區(qū)別
，常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位：
Lamp-2：溶酶體膜蛋白
，可用于監(jiān)測自噬體與溶酶體融合
。
LysoTrackerTM探針：有紅或藍色可選
，顯示所有酸性液泡
。
pDsRed2-mito：載體
，轉(zhuǎn)染后表達一個融合蛋白（紅色熒光蛋白+線粒體基質(zhì)定位信號），可用來檢測線粒體被自噬掉的程度（Mitophagy）
。
MitoTracker探針：特異性顯示活的線粒體
，熒光在經(jīng)過固定后還能保留
。
Hsp60：定位與線粒體基質(zhì)
，細胞死亡時不會被釋放
。
Calreticulin（鈣網(wǎng)織蛋白）：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔 ?
Note：這些蛋白均為胞漿蛋白
，爬片或胰酶消化的細胞在做免疫熒光前需先透膜（permeabilize）
，可采用0.1%SDS處理
自噬與細胞死亡經(jīng)常需一起考慮
，下面介紹一些檢測細胞死亡的方法：
1）△ψmdissipation（線粒體跨膜電位的消失）：TMRM發(fā)紅色熒光
，DiOC6（3）發(fā)綠色熒光。
2）Phosphatidylserine Externalization（磷脂酰絲氨酸外翻）：Annexin V-FITC（綠色）染細胞膜
。
3）檢測線粒體產(chǎn)生的ROS：無熒光的HE（hydroethidine
，氫化乙啶）可被ROS氧化為EthBr（ethidium bromide
，溴乙啡啶），發(fā)紅色熒光
。NAO（nonylacridine orange，烷化吖啶橙
，可發(fā)熒光）能與非氧化的cardiolipin（心磷脂，可被ROS氧化）反應(yīng)而失去熒光
。
4）線粒體IMS蛋白的釋放：AIF
，細胞色素c
，分別用熒光二抗染色
。
5）Capase 3a?染色：用熒光二抗染色，胞漿彌散分布
。
6）細胞膜完整性檢測：DAPI（藍色）
、Hoechst 33342或PI（紅色）染核。胞膜完整的細胞（活細胞和早中期凋亡細胞）排斥
，可聯(lián)用annexin V。
10
、如何用實驗區(qū)分Cell death by autophagy和Cell death with autophagy？
第一步：利用上述方法證實細胞死亡
第二步：證實細胞死亡前發(fā)生了自噬
第三步：在形態(tài)學(xué)上區(qū)別開“自噬樣死亡”與凋亡
第四步：利用遺傳學(xué)手段（反義RNA干擾Knockdown掉Atg基因或hVps34）或工具藥抑制自噬
第五步：細胞存活則為Cell death by autophagy
，反之
，細胞死亡則為Cell death with autophagy
。
自噬的抑制根據(jù)自噬形成的過程
，自噬的抑制也分為不同的階段
，包括自噬的起始階段
，自噬泡和溶酶體融合階段，以及溶酶體內(nèi)的降解階段
。目前常用的一些抑制藥物如下：
? ??1）對自噬體形成的抑制：主要是PI3K通路的抑制劑（如3-MA, Wortmannin，LY294002等）
，這些藥物均可干擾或阻斷自噬體形成。3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）是磷脂酰肌醇3激酶的抑制劑
，可特異性阻斷Autophagy中自噬體的形成
，被廣泛用作Autophagy的抑制劑
。另外
，渥曼青霉素（Wortmannin）
、LY294002?也可用作Autophagy的抑制劑
。? ??
? ? ? ?2）對自噬體與溶酶體融合的抑制：對自噬體與溶酶體融合過程進行阻斷也能起著抑制自噬的作用
，這些藥物有巴伐洛霉素A1
、長春堿
、諾考達唑等
。巴伐洛霉素A1（Bafilomycin A1）是一種來源于灰色鏈霉菌的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素
，分子式C35H58O9，是空泡型H+-ATP酶的特異性抑制劑
，具有抗菌、抗真菌
、抗腫瘤等作用。當突觸小泡經(jīng)歷胞外分泌時，巴伐洛霉素A1可以避免小泡重新酸化
。有研究表明，在已發(fā)生自噬的腫瘤細胞中加入巴伐洛霉素A1，可使蛋白降解被抑制
，自噬體增多而自噬溶酶體數(shù)目減少
，并且自噬體中的酸性磷酸酶的活性也明顯降低
，從而證明其阻斷了自噬體與溶酶體的融合過程。這種阻斷是可逆的
，在去除了藥物作用后，自噬體仍可以與溶酶體融合形成自噬溶酶體
，繼續(xù)自噬進程。
? ??3）對溶酶體降解的抑制:自噬體與溶酶體融合后最終被溶酶體中的水解酶水解
，它首先經(jīng)過囊泡酸化，達到所需的PH值后經(jīng)多種蛋白酶作用使囊內(nèi)容物降解
，降解產(chǎn)物在細胞內(nèi)再循環(huán)利用。對溶酶體的降解進行抑制，使得被降解的囊泡內(nèi)容物大量蓄積于溶酶體內(nèi)
，而不能釋放出來進入細胞內(nèi)再循環(huán)利用，這也同樣起著抑制自噬的作用
。因此，蛋白酶抑制劑
，如E64d、Pepstatin A等
，在抑制溶酶體降解的過程中發(fā)揮著自噬抑制劑的作用。E64d和Pepstatin A均屬于蛋白酶抑制劑
，二者以1：1的比例聯(lián)用可以抑制自噬。有研究表明
，在結(jié)腸癌細胞系中聯(lián)用E64d及Pepstatin A，可明顯抑制溶酶體的降解從而阻斷自噬的進展
，而自噬體的形成并沒有受到明顯影響。
11
、自噬領(lǐng)域的大牛們：
? ?1）YoshinoriOhsumi博士。日本科學(xué)家
，克隆了第一個酵母自噬基因Atg1以及LC3，主要成果在酵母模型下自噬研究
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