基因測序讓科學家解碼歷史上的致命疾病

利用新方法，研究人員分析了提取自受害者骨頭和牙齒的歷經(jīng)數(shù)世紀之久的病原體。

去年8月，johannes krause進行了一個鮮有人嘗試的“壯舉”：他對一具700年歷史的人體骸骨進行了遺傳尸檢。krause從一個死于14世紀丹麥麻風病人隔離區(qū)的年輕女性牙齒中提取了dna，并計算了來自細菌、污染物以及麻風病病原體（麻風分枝桿菌）的混雜遺傳物質(zhì)有多少。

他驚訝地發(fā)現(xiàn)，40%的dna與現(xiàn)代麻風分枝桿菌相匹配，只有9%的dna是人類dna。作為德國賓根大學的古遺傳學家，krause認為，這不可能。

他再次進行了研究，并得出同樣的結(jié)論?！斑@是瘋狂的?！彼f，“我從未想過，人體骨骼中病原體的dna多于人類dna。而在當今麻風病患者中，你不會發(fā)現(xiàn)這種情況?！?/p>

重現(xiàn)歷史

krause和他的研究生――生物化學家verena schuenemann意識到，自己撞上了一個科學頭獎?！袄萌绱烁邼舛鹊募毦?，我們試著讓一個夢想成真?！眘chuenemann說。他們立刻測序了該古代桿菌基因組，而非像過去那樣依賴實驗室技術捕獲分化的古老dna。

日前，krause及其同事將成果發(fā)表于《科學》雜志網(wǎng)絡版，公布了使用鳥槍測序法測序的中世紀麻風分枝桿菌全基因序列。這個突破令人非常驚訝，因為研究人員尚未對從活著的麻風病人體內(nèi)提取的麻風分枝桿菌基因進行直接測序。這種細菌不能在細胞培養(yǎng)中生長，因此研究人員用人類麻風分枝桿菌感染了犰狳和老鼠，以便獲得足夠的樣本用于測序。

krause研究小組十分幸運地獲得了樣本?！拔覀冊诨蛐蛄蟹矫娅@得了難以置信的進展?！泵绹鸫髮W進化遺傳學家charles nunn說，“這對理解在今天和過去循環(huán)的病原體之間的關系十分重要?！?/p>

利用鋪天蓋地的數(shù)據(jù)，一些實驗室陸續(xù)采集了“傳奇殺手”的dna，其中包括，結(jié)核?。╰b）、鼠疫、霍亂、利什曼蟲、麻風病、馬鈴薯晚疫病以及艾滋病。他們從古代牙齒、骨頭、頭發(fā)、排泄物和土豆皮與葉子中，收集到了這些“罪犯”的線索，然后解碼了基因序列。

始于3年前的相關研究，為人們理解歷史事件打開了新局面，看清了引發(fā)人類最嚴重流行病的“元兇”的真實面目?！昂芏啻嬖谟跉v史記錄中的疾病，我們不清楚病原體是什么?！泵绹鴣喞Ｄ侵萘⒋髮W分子人類學家anne stone說。

相關研究還揭示了病原體首先感染人體哪一部分，以及為何隨著時間的推移，它們會變得更毒或消弭。例如，了解很久之前的都市化引發(fā)嚴重tb桿菌的進化，在當今日益城市化的世界“能夠發(fā)現(xiàn)最好的疫苗接種和藥物治療策略”，英國曼徹斯特大學生物分子考古學家terence brown說。

pcr難題

上世紀90年代初，沒有人相信這會成為可能。當時stone還是一名研究生，在德國馬普學會斯萬特?帕博實驗室工作，她曾試著識別古老天花和tb的基因標記。這項研究是一項挑戰(zhàn)，病原體的基因組比人類基因小1000倍?；氐侥菚r，假如能夠使用聚合酶鏈反應（pcr），測序來自化石的少量dna標記，研究人員會激動萬分。

那時stone甚至無法攫取一些小塊的片段。她試著放大取自一具有400年歷史的意大利那不勒斯木乃伊的重型天花病毒，但是一無所獲。她放棄了古病原體研究，轉(zhuǎn)而研究古老dna與猿和人類的進化。

數(shù)年過去了，其他研究人員宣布使用pcr從骨骼殘骸中搜獲了tb，但是批評者擔心證據(jù)受到了污染。甚至當他們能夠確定古tb時，pcr研究停滯在了如何關聯(lián)古tb菌株和現(xiàn)在的結(jié)核分枝桿菌，因為他們無法獲得足夠的古dna，以揭示菌株間的不同?！拔也辉诤跤腥苏f自己從1.5萬年前的樣本中提取了tb，我只想知道，你能告訴我有關這個tb的什么內(nèi)容?！钡湼绫竟髮W進化生物學家thomas gilbert說。

這大約發(fā)生在高通量測序儀器引發(fā)該領域革命的10年前。當時pcr只能復制至少80個堿基對長度的dna片段，但是古老dna通常更小。新測序機器打開了古老基因的全新世界，包括轟動一時的冰河時代猛犸象，以及滅絕的尼安德特人和丹尼索瓦人的基因修復。

捕獲基因

通緝名單的頭號兇手是黑死病的“代理人”。1347~1351年，它橫掃歐洲，奪去一半人的生命。歷史文獻記載的腹股溝淋巴結(jié)炎十分像那些由耶爾森氏鼠疫桿菌引起的疾病。在抗生素出現(xiàn)之前，鼠疫似乎足以殺死上百萬生命，因此一些歷史學家懷疑，它是黑死病背后的“推手”。早期pcr結(jié)果表明，中世紀受害者遺骨上的遺傳標記屬于現(xiàn)代耶爾森氏鼠疫桿菌的一部分。但是罪名無法成立：實驗結(jié)果不能重復。

2011年加拿大麥克馬斯特大學的hendrik poinar、美國南卡羅來納大學的sharon dewitte和麥克馬斯特大學研究生kirsten bos從英國倫敦東史密斯菲爾德墓地尸骸的牙齒和骨頭中提取了dna。這里埋葬了14世紀鼠疫的受害者。

聯(lián)合krause和schuenemann，兩個實驗室使用了“誘餌”――發(fā)現(xiàn)自現(xiàn)代耶爾森氏鼠疫桿菌的短基因片段――用于捕獲古老序列的類似延伸。研究人員清除了無法附在現(xiàn)代誘餌上的dna。這讓他們不僅捕捉到了匹配序列，還發(fā)現(xiàn)了可能與現(xiàn)代基因不同的dna。研究人員反復清洗了重疊的dna片段，最終平均每個核苷酸收集了30個副本。

結(jié)果顯示，倫敦瘟疫死者確實感染了耶爾森氏鼠疫桿菌。讓該研究小組驚訝的是，14世紀該桿菌的基因組與現(xiàn)代十分相似。目前，研究小組在探索是什么引發(fā)了高死亡率，是一種古老菌株還是中世紀死者較差的健康狀況。

結(jié)核病疑云

tb是世界致死率第二的傳染病，僅排在艾滋病之后。2011年，它導致140萬人死亡。在過去的10年中，研究人員修改了“所有人感染tb都是由幾乎相同的結(jié)核分枝桿菌引起的”這一觀點。他們現(xiàn)在認識到存在7種不同的tb菌株群落，有兩個只在非洲和最近的非洲移民中發(fā)現(xiàn)。

tb與人類的交情“甚篤”：最早的考古學證據(jù)來源于一具發(fā)現(xiàn)自意大利利古利亞的有7800年歷史的骸骨，其脊柱結(jié)節(jié)受損。最早的歷史記錄則出現(xiàn)在公元前4700年的中國。作為與人類和動物共同進化數(shù)千年的結(jié)果，菌株群落在舊世界（非洲、歐洲和亞洲）與新世界（美洲）出現(xiàn)單獨進化。研究人員渴望了解新世界和舊世界菌株彼此間、與動物菌株間如何相關，以及感染人類的過程如何改變了tb的毒性。他們還想知道，耐藥性是否發(fā)生在不同菌株的相同位置，以及速度有多快。

答案可能隱藏在時間的深處。stone和研究生luz-andrea pfister已經(jīng)推翻了人最初是從牛身上感染了tb的舊觀念――而是人們自己傳染了自己。新研究追蹤了現(xiàn)代菌株的共同祖先，結(jié)果顯示，tb可能早在300萬年前就感染了非洲人。目前尚未測序出完整的古結(jié)核分枝桿菌基因序列，但是科學家已經(jīng)取得重大突破。

去年，一個研究小組從1840~1911年葬于英國利茲圣佐治土窯的一個小女孩骸骨上提取了樣本。brown及其博士后abigail bouwman使用新一代測序儀等技術，制作了500個“誘餌”，捕獲了218個單核苷酸多態(tài)性（snps）。通過分析古老和現(xiàn)代tb菌株中存在或不存在哪些snps，他們編譯了首套歷史上的tb菌株的dna標記。

通過比較，研究人員發(fā)現(xiàn)，利茲女孩感染的菌株與現(xiàn)代的不同，但是與1905年紐約隔離的一個患者體內(nèi)的菌株幾乎相同。該研究生動地展示了病原體如何在航空業(yè)發(fā)達之前，成功穿越如此長的距離?！坝泻芏嗳丝缭酱笪餮?，其中許多去了美國?！眀rown說。

愛爾蘭慘案

1845~1852年，愛爾蘭馬鈴薯歉收使得100多萬人死亡，另外超過100萬人逃到了美國和其他國家。該國一直未從這場災難中完全恢復過來。愛爾蘭現(xiàn)有人口450萬人，還不到饑荒發(fā)生時人口的3/4。

很多人將饑荒歸咎于政治和植物，但是毫無疑問馬鈴薯晚疫病是罪魁禍首。當時，愛爾蘭主要依賴單一馬鈴薯品種――綽號“碼頭工人”的大馬鈴薯――來養(yǎng)活日益增長的人口。一旦這種大馬鈴薯受枯萎病的襲擊，人們就沒有其他的馬鈴薯可以食用。

大部分科學家認為愛爾蘭馬鈴薯枯萎病是由一種名為us-1的馬鈴薯晚疫病菌引起的，它是1843年引發(fā)北美枯萎病菌株的一個直接分支。直到上世紀70年代末，這種菌株在世界范圍內(nèi)一直占主要地位。

但是，研究人員發(fā)現(xiàn)這種菌株，與他們通過分析1845~1896年收集自歐洲和北美洲枯死的馬鈴薯和番茄的葉片而發(fā)現(xiàn)的菌株不同。英國塞恩斯伯里實驗室的kentaro yoshida、schuenemann及同事測序了這些樣本的dna：正如那個有700年歷史的麻風病樣本一樣，馬鈴薯枯萎病病原體也被很好地保存下來，他們使用鳥槍測序法直接測序了其基因序列。

結(jié)果顯示，這些古老植物感染了一種名為herb-1的馬鈴薯晚疫病菌，它與現(xiàn)代的15個馬鈴薯晚疫病菌株不同，盡管us-1與它密切相關?！耙粋€已滅絕的菌株曾橫行于愛爾蘭和歐洲?！甭?lián)合研究者krause說。

中世紀苦難

現(xiàn)在，高分辨率麻風分枝桿菌全基因序列使得krause和同事有機會深入研究這種自圣經(jīng)時代就名聲狼藉的可怕疾病。如今，麻風病早已不像中世紀那樣橫行無忌。德國基爾大學分子考古學家ben krause-kyora表示，就在14世紀前，斯堪的那維亞半島25%甚至更多的成年人死后的骨骼留有麻風病的標記。

krause-kyora將中世紀麻風病死者的牙齒寄給krause用于分析，他們比較了古麻風分枝桿菌基因和11種現(xiàn)代菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種細菌進化速度很慢。中世紀麻風病患者身上的病原體幾乎與目前印度、泰國等地麻風病患者體內(nèi)的病原體相同。

krause研究小組還發(fā)現(xiàn)，中世紀斯堪的納維亞女孩的麻風病菌株或許分離自發(fā)現(xiàn)于當今伊朗和土耳其的一個菌株。這表明這種原始菌株起源于亞洲。11世紀，十字軍或其他旅行者可能將它帶到了歐洲，最終到達斯堪的納維亞半島。

最后，krause還揭開了最初困擾他的難題：為何在古老牙齒中麻風分枝桿菌dna比人類dna多。他認為，麻風分枝桿菌有特別厚的細胞膜，富含脂肪酸，能夠抗侵蝕。如果其他細菌也是這樣，將有希望追蹤那些超越人類dna退化極限（100萬年）的病原體。

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