Nat,Commun：干細(xì)胞基因或可控制骨骼肌再生

Nat,Commun：干細(xì)胞基因或可控制骨骼肌再生

2016年10月14日訊 我們都知道，Prox1基因在胚胎發(fā)育過程中扮演著重要的角色，日前，一項(xiàng)刊登在國際雜志Nature Communications上的研究報(bào)告中，來自芬蘭的研究人員通過研究發(fā)現(xiàn)，Prox1基因或許對于骨骼肌干細(xì)胞的分化也非常關(guān)鍵。骨骼肌不僅對于運(yùn)動非常重要，而且對于整個(gè)機(jī)體新陳代謝的調(diào)節(jié)也很關(guān)鍵，在機(jī)體損傷之后肌肉有著強(qiáng)大的能力進(jìn)行再生，同時(shí)還能夠不斷適應(yīng)運(yùn)動訓(xùn)練。

此前研究中，研究人員通過研究發(fā)現(xiàn)，Prox1基因或許也有黑暗的一面，比如其在結(jié)直腸癌的發(fā)生過程中扮演著重要的作用。如今研究者發(fā)現(xiàn)，名為衛(wèi)星細(xì)胞的骨骼肌干細(xì)胞同樣能夠表達(dá)Prox1基因，而且當(dāng)該基因處于活化狀態(tài)時(shí)衛(wèi)星細(xì)胞能夠分化為肌肉纖維。

研究者指出，我們在成年人的慢肌纖維中也能夠發(fā)現(xiàn)Prox1基因的表達(dá)，機(jī)體中的慢肌纖維具有良好的耐力和高度的代謝活性，成人機(jī)體中大約有一半的骨骼肌都是慢肌纖維肌肉，研究者Kivela說道，在小鼠機(jī)體中，Prox1基因能夠?qū)⒖旒±w維轉(zhuǎn)換為慢肌纖維，而剔除Prox1基因則會增加快肌纖維基因的活性。

最后研究者表示，本文研究闡明了Prox1基因在衛(wèi)星細(xì)胞分化分化及慢肌纖維維護(hù)過程中扮演的重要角色，為后期深入研究人類肌肉和代謝疾病，比如2型糖尿病等疾病的發(fā)病機(jī)制提供了新的研究線索，研究者Kivela說道，在人類機(jī)體中，Prox1基因的多態(tài)性和2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加直接相關(guān)。

干細(xì)胞簡介

干細(xì)胞（stem cell）是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育潛能分為三類：全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞。干細(xì)胞（Stem Cell）是一種未充分分化，尚不成熟的細(xì)胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱為“萬用細(xì)胞”。

果蠅體節(jié)間細(xì)胞與體節(jié)內(nèi)細(xì)胞的區(qū)別

　　兩種細(xì)胞都屬于體節(jié)細(xì)胞，分布部位不同，差別并不大
　　亦稱隔膜、隔壁。是指兩個(gè)以上體節(jié)的動物各體節(jié)間的隔膜。在發(fā)生上起源于中胚層，由體腔上皮和結(jié)締組織構(gòu)成。在原環(huán)蟲每個(gè)體節(jié)間都很完整，但在寡毛類、多毛類等，則某些體節(jié)間無間隔。哺乳類的橫隔膜、鳥類的斜隔膜也是體節(jié)間膜的特殊的例子。節(jié)肢動物體表各體節(jié)間以及四肢關(guān)節(jié)間所有的節(jié)間膜雖然也稱體節(jié)間膜，但都與此不同。

心血管疾病基因治療：借鑒失敗，邁向成功

打敗智力競賽冠軍后，機(jī)器人將取代醫(yī)生？千兆基因組定序完成 癌癥研究重大里程碑生物資訊共享：隱私風(fēng)險(xiǎn)誰把關(guān)？啟動減肥基因 自由控制食欲開關(guān) 心血管疾病除了會嚴(yán)重危害患者生活品質(zhì)并大幅增加國家醫(yī)療負(fù)擔(dān)，其死亡率在各國也長期穩(wěn)居十大死因的前三名。盡管外科手術(shù)、藥物、以及監(jiān)測工具日新月異，也能有效延長患者壽命，但已經(jīng)受損的心臟或血管組織仍難以恢復(fù)至健康狀態(tài)。即使心臟移植能拯救嚴(yán)重心臟衰竭病患，但一「心」實(shí)在難求，故尋找其他療法實(shí)乃刻不容緩。這十幾年來，基因操作技術(shù)的長足進(jìn)步使得基因療法被寄予厚望，不過目前為止尚未有明確進(jìn)展。究竟過去為什么失敗，未來該怎么發(fā)展？鑒往，或許有助于知來。

過去心血管疾病基因治療臨床試驗(yàn)所遭遇的挫折

自 2002 年的 AGENT 臨床試驗(yàn)開始 [1] ，基因治療嘗試用于人類心血管疾病已經(jīng)有十年以上的歷史。試驗(yàn)結(jié)果多顯示基因療法無明顯的安全性疑慮，但對于相關(guān)癥狀和指標(biāo)卻也沒有顯著改善。以 AGENT 試驗(yàn)為例，檢測的療法是為心血管疾病患者以導(dǎo)管注射纖維母細(xì)胞生長因子 4 互補(bǔ) DNA (FGF-4 cDNA) 的腺病毒載體至冠狀動脈，期望能加速新血管生成以恢復(fù)缺血心肌的血液及養(yǎng)分供應(yīng)。盡管這項(xiàng)療法順利通過第一與第二期臨床試驗(yàn)的安全性和初步療效考驗(yàn)，但第三期之 AGENT-3 及 AGENT-4 試驗(yàn) (2007 年) 卻因治療組與對照組在跑步機(jī)運(yùn)動的表現(xiàn)無顯著差異而被迫提前中止 [2]。

類似情況也發(fā)生在 CUPID 試驗(yàn)。肌漿網(wǎng)是肌肉的鈣離子儲存槽，受到神經(jīng)電訊號 *** 就會將鈣離子釋出至肌細(xì)胞促其收縮，收縮過后則必須把鈣離子收回肌漿網(wǎng)，肌肉才能放松以準(zhǔn)備進(jìn)行下次收縮。心臟衰竭有一部份的原因就是上述鈣離子循環(huán)無法正常運(yùn)作，故 CUPID 試驗(yàn)以腺病毒將肌漿網(wǎng) Ca2+-ATP 酶 2a (SERCA2a) 送入心肌細(xì)胞，希望可以恢復(fù)健康的鈣離子流動。但同樣在經(jīng)過第一期臨床試驗(yàn)確保其安全性后，第二期的隨機(jī)分派、雙盲試驗(yàn)也因?yàn)橹饕u估指標(biāo) (治療后到心臟衰竭住院并且發(fā)生死亡、心臟移植、植入左心室輔助器材、或步行能力下降的時(shí)間) 在治療組和對照組之間無顯著差異而不得不終止 [3]。

鑒往：針對過去臨床試驗(yàn)失敗的檢討與改進(jìn)

以上的試驗(yàn)失敗可能與載體選擇、給藥頻率、給藥途徑、目標(biāo)基因選擇，甚至是種族、性別、年齡等因素相關(guān)。另外，這些療法當(dāng)初都是在年輕的動物完成臨床前試驗(yàn)，但實(shí)際臨床試驗(yàn)多是招募病情較嚴(yán)重或年紀(jì)較大的病患，而此時(shí)血管內(nèi)皮再生或鈣離子循環(huán)改善等局部變化可能不足以提升整體運(yùn)動機(jī)能。受試者也可能因?yàn)槠渌斫Y(jié)構(gòu)老化或惡化太快，因而蓋過治療進(jìn)步幅度，導(dǎo)致臨床效果不顯著。

知來：新技術(shù)帶來的新希望

由以上分析可知，設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)須明確制定患者族群，同時(shí)也需要設(shè)計(jì)不易受其他因素干擾的評估指標(biāo)。也許基因療法只適合剛發(fā)生心血管疾病的青壯年患者，不適合用于長期罹患心臟衰竭的年邁患者。又諸如跑步機(jī)運(yùn)動表現(xiàn)這類的臨床評估指標(biāo)，其實(shí)可推想每個(gè)人的運(yùn)動表現(xiàn)本來就有其個(gè)別極限，沒有生病前連400公尺都跑不到的人，很難想像用基因治療后就能突飛猛進(jìn)，這是不可能的。故利用心臟磁振灌流造影 (cardiac magic resonance perfusion imaging) 與正子攝影 (PET) 等進(jìn)階影像工具，或許可以更客觀、細(xì)致地偵測生理變化，進(jìn)而驗(yàn)證基因治療的效果。

雖然基因治療至今為止可說是失敗重重，但新技術(shù)仍持續(xù)問世，也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)各種極具潛力的新基因標(biāo)的，像是在調(diào)控細(xì)胞復(fù)制、分化、鈣離子恒定、心肌收縮力、及凋亡皆占有一席之地的 S100 蛋白質(zhì)家族基因 [4]、可調(diào)控心臟功能并防止心肌細(xì)胞 DNA 損傷與細(xì)胞凋亡的 BRCA1 基因 [5]、抑制細(xì)胞凋亡的 Fas 蛋白之 anti-Fas 基因 [6]，和可誘導(dǎo)干細(xì)胞發(fā)揮修復(fù)功能的 SDF-1/CXCR4 路徑相關(guān)基因 [7-9] 等。未來的趨勢也將是針對一整套基因進(jìn)行調(diào)控 (如 VEGF 加 Ang-1) [10]，因?yàn)閱我换虻母淖円苍S不足以逆轉(zhuǎn)大局。

另外，為避免基因治療偏離標(biāo)的，超音波微氣泡轉(zhuǎn)染 (ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD) 在近幾年逐漸嶄露頭角。其原理是將含特殊基因的載體置入微氣泡，再以心導(dǎo)管打到受損心肌附近，藉超音波誘導(dǎo)微氣泡至目標(biāo)組織，然后于適當(dāng)時(shí)機(jī)誘發(fā)微氣泡破裂讓基因進(jìn)入心肌細(xì)胞。其優(yōu)點(diǎn)有低侵入性、低毒性、低致敏性、與能夠針對特定目標(biāo)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；缺點(diǎn)則包括微氣泡體積過大不易穿過血管壁，以及穩(wěn)定存在時(shí)間過短而需要多次給藥以加強(qiáng)療效。此技術(shù)在動物實(shí)驗(yàn)已獲得許多令人振奮的成果，故研究人員正積極評估用于人類基因治療的可行性 [11]。未來希望借由不斷推陳出新的技術(shù)，加上從過去失敗汲取的寶貴經(jīng)驗(yàn)，最終可讓更多受苦受難的心血管疾病患者能借由基因治療，重獲光明的人生。

參考文獻(xiàn)：

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話題： 心血管疾病

求一醫(yī)學(xué)標(biāo)書的樣本

　　目前，移植排斥反應(yīng)仍然是制約肝移植療效的主要原因。雖然由于免疫抑制劑的臨床應(yīng)用，肝移植的1年的存活率大幅度提高，已超過了80%。但是終生服用免疫抑制劑不僅成為患者沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且造成機(jī)體的免疫功能低下，可能促進(jìn)肝炎及腫瘤復(fù)發(fā)，誘發(fā)感染、腫瘤等疾病。因此，找尋誘導(dǎo)特異性移植耐受的新方法，是克服移植排斥反應(yīng)的最佳途徑。
　　特異性移植耐受是指在無需使用免疫抑制藥物的情況下，受者的免疫系統(tǒng)對同種異體或異種供體抗原長期不發(fā)生免疫反應(yīng)，而對其它抗原可發(fā)生正常免疫應(yīng)答的狀態(tài)。目前認(rèn)為，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受涉及免疫清除、免疫失能、免疫抑制和免疫忽視四類機(jī)制[1]。根據(jù)以上誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制，學(xué)者們發(fā)展出許多誘導(dǎo)移植耐受的新方法[2]：(1)在胸腺內(nèi)直接注射表達(dá)供體抗原的細(xì)胞，在胸腺內(nèi)通過克隆清除誘導(dǎo)免疫耐受。(2)利用骨髓移植造成造血細(xì)胞嵌合體誘導(dǎo)耐受。(3)阻斷T細(xì)胞活化的共刺激信號通路。(4)輸注供體樹突狀細(xì)胞(Dentritic cell，DC)誘導(dǎo)耐受。(5)針對T細(xì)胞粘附和活化相關(guān)分子的單克隆抗體：抗T細(xì)胞及T細(xì)胞亞群的單抗；抗粘附分子或細(xì)胞因子的單抗。(6)其它特異性免疫抑制的方法：合成肽阻斷TCR對同種異體抗原的識別；合成肽阻斷趨化因子及其受體。以上方法均不同程度地誘導(dǎo)了對供體抗原的耐受，但它們存在如下不足：(1)成年人胸腺已經(jīng)萎縮，無法在胸腺內(nèi)直接注射表達(dá)供體抗原的細(xì)胞，故該方法適用范圍大大受限。(2)供體骨髓移植能誘導(dǎo)部分耐受，但不易控制嵌合程度，移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)的發(fā)生率大大增加。(3)DC誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞失能狀態(tài)可通過給予外源性IL-2而逆轉(zhuǎn)；感染或其它因素引起機(jī)體強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生大量的IL-2等細(xì)胞因子也可以通過旁效應(yīng)解除失能的細(xì)胞克?。皇軤顟B(tài)的維持需要抗原的持續(xù)存在，抗原的去除也能逆轉(zhuǎn)失能。(4)阻斷協(xié)同刺激通路、應(yīng)用針對T細(xì)胞粘附和活化相關(guān)分子的單克隆抗體、合成肽阻斷TCR對同種異體抗原的識別、阻斷趨化因子及其受體等方法能誘導(dǎo)出確切的免疫抑制，但是其作用范圍是全身性的、非特異性的，且一旦中止阻斷劑的供給，則移植耐受消失?？傊? 目前誘導(dǎo)移植耐受的方法存在非特異性、容易逆轉(zhuǎn)、實(shí)際操作困難等缺陷。
　　肝移植排斥反應(yīng)啟動時(shí)，首先表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞對匯管區(qū)中央靜脈周圍的浸潤，隨著排斥反應(yīng)的進(jìn)展，淋巴細(xì)胞的損傷導(dǎo)致小葉間膽管上皮細(xì)胞、中央靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥，最后波及匯管區(qū)周圍的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，造成廣泛的肝臟炎性反應(yīng)。因此肝移植排斥反應(yīng)的過程是從匯管區(qū)啟動，進(jìn)而擴(kuò)展至小葉間膽管上皮細(xì)胞、中央靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、匯管區(qū)周圍的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。移植排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，CTL細(xì)胞在活化后可以通過以下兩條途徑殺傷靶細(xì)胞：(1)穿孔素/顆粒酶途徑。(2)Fas/FasL途徑：在CTL細(xì)胞識別靶細(xì)胞后，細(xì)胞表面表達(dá)的高水平FasL與靶細(xì)胞表面的Fas相互識別，通過Fas觸發(fā)靶細(xì)胞內(nèi)部的凋亡程序，使靶細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)兩條途徑相互獨(dú)立。然而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)單一阻斷Fas/FasL途徑即可抑制CTL對靶細(xì)胞的殺傷，其原因可能與體內(nèi)環(huán)境有關(guān)28.
　　誘騙受體3(Decoy receptor 3，DcR3)是一種新發(fā)現(xiàn)的可結(jié)合FasL的可溶性TNFR超家庭成員，RNA印跡表明DcR3 mRNA 表達(dá)于胎肺、腦、肝及成人脾、結(jié)腸和肺，特別是在肺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系的表達(dá)很高，也可由T細(xì)胞絲裂原激活的外周血單核細(xì)胞分泌。DcR3 分子質(zhì)量為35kDa，肽鏈長300個(gè)氨基酸殘基。DcR3 的配體是LIGHT、FasL、TL1A。其主要作用有：(1)與Fas競爭性結(jié)合FasL，阻斷FasL所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，這一作用可以減弱CTL和NK細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷[14]。(2)通過抑制LIGHT與HveA 或TR2之間的雙向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、TL1A至DcR3的單向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制T細(xì)胞激活。7 (3)抑制CXCL12/基質(zhì)細(xì)胞來源的因子1α(SDF-1α) 、FasL對T細(xì)胞的趨化作用，從而減少CD4+和CD8+T細(xì)胞對腫瘤的浸潤。25. 27．(4)通過調(diào)節(jié)DC分化和成熟從而抑制CD4+ T細(xì)胞增生。20．(5)抑制T細(xì)胞偽足形成，阻止它們形成不可分離的細(xì)胞簇從而調(diào)節(jié)T細(xì)胞與其它細(xì)胞如APC的相互作用。7
　　因此根據(jù)其作用機(jī)理，人們推測其可能有以下四方面的作用(1)腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視。（2）抗炎作用。(3)致癌作用。（4）誘導(dǎo)移植耐受。目前的研究工作已經(jīng)肯定DcR3基因?qū)δ[瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視、抑制炎癥反應(yīng)的作用，但DcR3基因的高表達(dá)與細(xì)胞癌變無相關(guān)性，不是癌基因。Wu等證實(shí)DcR3減少了FasL、IFN-γ誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞凋亡及胰島素釋放，可防止同種異基因胰島移植時(shí)的胰島原發(fā)性無功能。2Zhang等于心臟移植術(shù)前一天開始連續(xù)7天靜脈注射DcR3，小鼠心臟存活時(shí)間比對照組延長3.3天，提示DcR3可以減弱T細(xì)胞對同種異體抗原的反應(yīng)。24我們利用腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AAV)（AAV Helper－Free System, Stratagene 公司）作為DcR3基因的載體，將AAV病毒顆粒從門靜脈、肝動脈、膽管注入冷保存時(shí)的供肝，成功實(shí)現(xiàn)了DcR3基因在供肝的表達(dá)，在沒有使用免疫抑制劑的情況下，供肝正常存活了105天（目前仍然存活，繼續(xù)觀察中），而對照組僅存活了15天（見研究工作基礎(chǔ)）。AAV Helper－Free System的特點(diǎn)有：病毒載體產(chǎn)生、效價(jià)滴定階段均不需野生型腺病毒共感染，因此有極高的生物安全性、宿主的免疫反應(yīng)極??；AAV可感染的細(xì)胞類型廣泛，感染不依賴于活躍的細(xì)胞分裂；AAV病毒滴度高，常規(guī)可達(dá)107病毒顆粒/ml，經(jīng)濃縮可達(dá)1012病毒顆粒/ml；AAV在允許復(fù)制的條件下可在染色體外復(fù)制，在不能復(fù)制的條件下可以5-10%的效率定點(diǎn)整合入宿主19號染色體的一個(gè)2-4kb的區(qū)域，因此AAV被證明有應(yīng)用于基因長期表達(dá)的價(jià)值。我們目前的研究工作的特色有：（1）證明了腺相關(guān)病毒攜帶的DcR3基因可以誘導(dǎo)肝移植耐受。(2)采用AAV Helper－Free System克服了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低、隨機(jī)整合入受者染色體中而致腫瘤的危險(xiǎn)的缺點(diǎn)[1]以及腺病毒載體雖然有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)率,但因不能在染色體外復(fù)制或整合入受者染色體中,目的基因只能一過性表達(dá)的缺點(diǎn)[2]。我們目前研究工作的缺陷有：（1）DcR3基因僅在肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞表達(dá)，而急性排斥反應(yīng)啟動時(shí)CTL細(xì)胞首先浸潤的是匯管區(qū)的中央靜脈周圍，因此它尚不能阻止急性排斥反應(yīng)的啟動，僅能阻止CTL細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞的攻擊。（2）DcR3基因轉(zhuǎn)染的血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞是成熟的細(xì)胞。雖然攜帶DcR3基因的AAV可在染色體外復(fù)制或整合入宿主基因組而使DcR3基因存在長期表達(dá)的可能，但是成熟細(xì)胞存在新老交替，DcR3基因的表達(dá)隨著細(xì)胞的死亡而消失。因此為了完善我們目前的研究工作，我們需要作以下的改進(jìn)：（1）將DcR3基因的表達(dá)定位于匯管區(qū)中央靜脈周圍，抑制排斥反應(yīng)的啟動。如能進(jìn)一步將DcR3基因表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞，則更能防止個(gè)別活化的CTL細(xì)胞對它們的攻擊，從而形成抑制排斥反應(yīng)的“雙保險(xiǎn)”。（2）實(shí)現(xiàn)DcR3基因的持續(xù)表達(dá)。
　　肝干細(xì)胞（Hepatic Stem Cell，HSC）是指具有自我更新能力和具有分化形成肝細(xì)胞與膽管細(xì)胞潛能的原始細(xì)胞。最近有人證實(shí)它尚可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞(Gao Z, McAlister VC, Williams GM. Repopulation of liver endothelium by bone-marrow-derived cells. Lancet. 2001 Mar 24;357(9260):932-3.) [11]。肝干細(xì)胞的基本特征可概括為兩點(diǎn)：①具有多向分化能力，可向肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。②具有自我更新與自我維持能力，對肝臟損傷或疾病產(chǎn)生反應(yīng)并進(jìn)行修復(fù)。其形態(tài)特點(diǎn)是細(xì)胞體積小、核大而胞質(zhì)少、呈卵圓形、具有特殊的表面標(biāo)志如AFP、肝細(xì)胞標(biāo)志（白蛋白）、膽管上皮細(xì)胞標(biāo)志（CK7、CK19）以及肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞共有的標(biāo)志(CK8、CK18)。目前有人證實(shí)其尚有血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志。
　　該類細(xì)胞不僅在胚胎肝組織中存在，而且在成年肝組織中也存在。肝內(nèi)的肝干細(xì)胞稱為卵圓細(xì)胞(Hepatic Oval Cell，HOC)或小肝細(xì)胞。它們在正常情況下位于肝臟匯管區(qū)的Hering小管[D]，當(dāng)肝臟受到損傷（肝毒性藥物、手術(shù)、創(chuàng)傷、缺血再灌注等）時(shí)，它們迅速增生分化，補(bǔ)充受損的肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，因而被稱為肝干細(xì)胞池[A]。目前大量文獻(xiàn)證實(shí)，肝臟損傷時(shí)，肝臟有三個(gè)水平的細(xì)胞修復(fù)：肝細(xì)胞、Hering 小管的雙向干細(xì)胞、Hering小管周圍的來自骨髓的肝干細(xì)胞。骨髓來源的干細(xì)胞可定居于Hering小管周圍，在肝臟損傷時(shí)發(fā)揮修復(fù)作用[K]。Theise ND等通過三維觀測得出Hering 小管、匯管區(qū)周圍是肝干細(xì)胞存在的場所的結(jié)論[G]。Petersen 證實(shí)肝內(nèi)存在骨髓來源的干細(xì)胞，Theise 大鼠2%，人4-40%。Alison0.5-2%(hsc8,78,79)。Lagasse 30%.認(rèn)為Hering管可能是人肝干細(xì)胞起源分化及滯留場所(TheiseND,SaxenaR,PortmannBC,etal.Thecanalsofheringandhepaticstemcellsinhumans[J].Hepa-tology,1999,30:1425-1433.)

　　肝干細(xì)胞的肝外來源包括胰腺的上皮細(xì)胞、胰島前體細(xì)胞、骨髓造血干細(xì)胞[3,4]。自1999年P(guān)etersen等發(fā)現(xiàn)肝卵圓細(xì)胞可來源于骨髓后,從骨髓細(xì)胞中鑒定肝干細(xì)胞成為近年研究的熱點(diǎn)。目前研究證實(shí)從骨髓中分離純化的造血干細(xì)胞的多個(gè)亞群在一定的微環(huán)境或細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下可分化為肝干細(xì)胞[B]。目前,在骨髓中已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞亞群具有分化為肝細(xì)胞的潛能,如KTLS細(xì)胞(c-kithighThylowLin-Sca-1+)[H]、β2-m-Thy-1+細(xì)胞[12]、CD44-CD45-HLA-c-kit-的多能成體前體細(xì)胞(multipotent adult progenitor cells, MAPC)[I]及C1qRp+細(xì)胞(Lin-CD45+CD38-CD34+/-)[J]等。這些細(xì)胞均涉及多個(gè)不同的表面標(biāo)志,可能代表著骨髓干細(xì)胞的不同發(fā)育階段或譜系中的不同分支。這些細(xì)胞因子肯定存在于細(xì)胞的微環(huán)境中，包括細(xì)胞外基質(zhì)中參與粘附過程的信號分子以及參與正常細(xì)胞發(fā)育、分化、成熟的細(xì)胞因子[B] [E]。Petersen 等[L]、Theise等[M,N]和Alison等[O]的研究相繼指出,骨髓干細(xì)胞或造血干細(xì)胞能夠在鼠肝內(nèi)轉(zhuǎn)化成為肝卵圓細(xì)胞甚至成熟的肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞,并同時(shí)證明這種現(xiàn)象也存在于人類體內(nèi)。用高濃度的肝細(xì)胞生長因子(HGF)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓細(xì)胞,RT-PCR檢測到白蛋白及AFP的表達(dá),免疫細(xì)胞化學(xué)也證實(shí)了經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞出現(xiàn)了AFP、白蛋白及CK8/18等肝前體細(xì)胞的特征性表達(dá)。應(yīng)用磁株細(xì)胞篩選法分離人或大鼠骨髓細(xì)胞中的β2m-Thy-1+細(xì)胞,能夠表達(dá)肝細(xì)胞的特征[P]。這些骨髓來源的肝干細(xì)胞(BDHSC)肝內(nèi)移植后很快就整合入肝板,并且分化為成熟的肝細(xì)胞,而在體外培養(yǎng)的過程中加入膽汁化血清可促進(jìn)它們向肝細(xì)胞方向分化。蔡云峰等用免疫磁珠法成功分離出骨髓干細(xì)胞的多個(gè)亞群，并證明大鼠骨髓內(nèi)β2微球蛋白陰性(β2 m- ) 細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)誘導(dǎo)后呈多角形細(xì)胞表現(xiàn), 白蛋白、AFP、 CK8 / 1 8表達(dá)陽性，其他干細(xì)胞類型未見類似變化。提示該亞群骨髓干細(xì)胞有向肝干細(xì)胞分化的能力。我們參照他們介紹的方法成功分離了1.5×105數(shù)量級的肝干細(xì)胞純度為95%，培養(yǎng)7天后可達(dá)2×106數(shù)量級。經(jīng)免疫組化染色證明其有肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志，因此推測其可能分化為以上3種細(xì)胞（見研究工作基礎(chǔ)）。這些研究結(jié)果都說明骨髓細(xì)胞中存在有能分化為肝細(xì)胞的干細(xì)胞群。
　　肝臟基因治療的一大難題是被用作基因修飾的成熟肝細(xì)胞在體外不易擴(kuò)增和傳代，肝干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖能力，即使經(jīng)過基因修飾仍有可能傳代，這為克服目前基因治療中的主要問題開辟了新的途徑。以肝干細(xì)胞作為載體具有一次性介入，永久性治療的特點(diǎn)，且永生化的肝干細(xì)胞無致癌的危險(xiǎn)性[F]。
　　基于以上研究成果，我們設(shè)想利用肝干細(xì)胞在肝臟匯管區(qū)中央靜脈周圍的靶向定植并在必要時(shí)分化補(bǔ)充受損或衰老的血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞的生物學(xué)特性，以腺相關(guān)病毒為載體將DcR3基因轉(zhuǎn)入從雄性近交系Wistar大鼠骨髓中分離純化的肝干細(xì)胞，將雌性近交系Wistar大鼠肝臟植入雌性近交系Lewis大鼠，同時(shí)將轉(zhuǎn)染DcR3基因的肝干細(xì)胞經(jīng)門靜脈注入移植后的肝臟。DcR3基因隨著肝干細(xì)胞的定植主要在匯管區(qū)持續(xù)表達(dá)，必要時(shí)部分隨著肝干細(xì)胞的進(jìn)一步分化而表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞，從而在啟動（主要）、攻擊（次要）兩個(gè)環(huán)節(jié)抑制排斥反應(yīng)的發(fā)生。DcR3基因強(qiáng)大的免疫抑制作用被局限在肝臟之中，從而誘導(dǎo)出特異針對肝臟的移植耐受狀態(tài)。
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　　2.項(xiàng)目的研究內(nèi)容、研究目標(biāo)，以及擬解決的關(guān)鍵問題。（此部分為重點(diǎn)闡述內(nèi)容）
　　2.1 研究內(nèi)容
　　2.1.1構(gòu)建攜帶DcR3基因的腺相關(guān)病毒載體，并將其轉(zhuǎn)染AAV293細(xì)胞，收集AAV病毒顆粒備用。
　　2.1.2從雄性近交系Wistar大鼠股骨、脛骨抽取骨髓，分離出肝干細(xì)胞，用上述腺相關(guān)病毒顆粒轉(zhuǎn)染，并進(jìn)行表達(dá)鑒定。
　　2.1.3將雌性近交系Wistar大鼠肝臟植入雌性近交系Lewis大鼠，同時(shí)將轉(zhuǎn)染的雄性近交系Wistar大鼠的肝干細(xì)胞經(jīng)門靜脈注入肝臟。
　　2.1.4根據(jù)Y染色體及AAV病毒載體自帶的綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)志確定轉(zhuǎn)基因肝干細(xì)胞在供肝中的定植、分布情況。
　　2.1.5檢測轉(zhuǎn)入肝干細(xì)胞的DcR3基因在供肝中的表達(dá)情況。
　　2.1.6觀測肝移植術(shù)后移植排斥反應(yīng)的發(fā)生情況。
　　2.2研究目標(biāo)：本課題擬構(gòu)建攜帶DcR3基因的腺相關(guān)病毒，將其轉(zhuǎn)染雄性近交系Wistar大鼠骨髓來源的肝干細(xì)胞；將雌性近交系Wistar大鼠肝臟植入雌性近交系Lewis大鼠，同時(shí)將轉(zhuǎn)染DcR3基因的肝干細(xì)胞經(jīng)門靜脈注入移植后的肝臟；使DcR3基因在供肝中長期表達(dá)，從而誘導(dǎo)特異針對肝臟的移植耐受狀態(tài)。探討：(1)轉(zhuǎn)基因肝干細(xì)胞在供肝中的定植、分布情況。(2)轉(zhuǎn)入肝干細(xì)胞的DcR3基因在供肝中的表達(dá)情況。(3)轉(zhuǎn)基因肝干細(xì)胞在供肝中的分布及其基因表達(dá)與移植耐受的關(guān)系。
　　2.3擬解決的關(guān)鍵問題
　　2.3.1腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染肝干細(xì)胞的效率：干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染難度較大，是本課題的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本課題成員（刪去）于2001年用腺病毒成功感染了神經(jīng)干細(xì)胞，成功率約 80%～90%，且經(jīng)傳代培養(yǎng) 12代后仍具干細(xì)胞特性。腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染效率高于腺病毒，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型較腺病毒更廣泛。因此本課題組有能力完成腺相關(guān)病毒對肝干細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。
　　2.3.2轉(zhuǎn)基因肝干細(xì)胞在供肝匯管區(qū)中定植的數(shù)量：肝干細(xì)胞在匯管區(qū)的定植數(shù)量與肝臟受到的損傷程度有關(guān)。損傷越重，肝干細(xì)胞在匯管區(qū)的定植數(shù)量越多，反之亦然。肝移植時(shí)肝臟缺血再灌注對肝臟已是一種損傷，為了進(jìn)一步提高肝干細(xì)胞在匯管區(qū)的定植數(shù)量，可在冷保存時(shí)切除大鼠肝臟的一葉，然后完成肝移植。
　　3.擬采取的研究方案及可行性分析。（包括有關(guān)方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)手段、關(guān)鍵技術(shù)等說明）
　　3.1研究方案
　　3.1.1 DcR3基因的克隆，參照Pitti RM等介紹的方法進(jìn)行。
　　3.1.2構(gòu)建攜帶DcR3基因的腺相關(guān)病毒載體，并用其感染AAV－293細(xì)胞進(jìn)行體外表達(dá)鑒定、收集AAV病毒顆粒備用。
　　3.1.3從雄性近交系Wistar大鼠股骨、脛骨抽取骨髓，分離肝干細(xì)胞并進(jìn)行純化、鑒定，參照Itzhak Avital等介紹的方法進(jìn)行。
　　3.1.4腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)染肝干細(xì)胞，采用直接感染方法。
　　3.1.5體外試驗(yàn)：表達(dá)DcR3基因的肝干細(xì)胞抑制FasL誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡試驗(yàn)；表達(dá)DcR3基因的肝干細(xì)胞抑制FasL誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞趨化試驗(yàn)
　　3.1.6動物實(shí)驗(yàn)：大鼠肝移植采用袖套法，移植完成時(shí)將轉(zhuǎn)染DcR3基因的肝干細(xì)胞經(jīng)門靜脈注入肝臟；分別于術(shù)后3天、7天、14天、21天、28天取血液及肝臟標(biāo)本，采用常規(guī)生化法檢測肝功能，Northern blot、Western blot檢測DcR3基因在肝臟中的表達(dá)情況，免疫組化法檢測受體CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞在供肝中的浸潤情況，TUNEL法檢測供肝中細(xì)胞凋亡情況，常規(guī)石蠟切片HE染色觀察移植排斥反應(yīng)的發(fā)生情況。
　　3.2技術(shù)路線

　　3.3可行性分析
　　3.3.1理論上，骨髓來源的肝干細(xì)胞是肝臟匯管區(qū)卵圓細(xì)胞、嗜堿性小肝細(xì)胞的前體細(xì)胞。研究證明經(jīng)門靜脈注入的肝干細(xì)胞定植的肝臟匯管區(qū)的Hering小管，可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞。匯管區(qū)是肝移植排斥反應(yīng)時(shí)CTL細(xì)胞首先浸潤的區(qū)域，血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞是CTL細(xì)胞攻擊的靶細(xì)胞。因此肝干細(xì)胞將轉(zhuǎn)染的免疫抑制基因帶入肝臟并匯管區(qū)及血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，從而誘導(dǎo)特異針對肝臟的移植耐受狀態(tài)在理論上是可行的。
　　3.3.2本研究所涉及的技術(shù)均為成熟的免疫學(xué)技術(shù)；本研究所擁有本研究所需的設(shè)備和條件。
　　4.本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處。
　　本研究利用了肝干細(xì)胞在肝臟定植、分化的靶向性，將其作為免疫抑制分子的載體，使非特異性的免疫抑制分子的作用局限于肝臟之中，克服了免疫抑制分子作用范圍過大的缺點(diǎn)，從而誘導(dǎo)特異針對肝臟的移植耐受狀態(tài)。
　　5.年度研究計(jì)劃及預(yù)期研究結(jié)果。（包括擬組織的重要學(xué)術(shù)交流活動、國際合作與交流計(jì)劃等）
　　年度研究計(jì)劃
　　2005.01-2005.09 DcR3基因的克隆，構(gòu)建攜帶DcR3基因的腺相關(guān)病毒載體備用。
　　2005.10-2006.06 分離、純化、鑒定雄性近交系大鼠骨髓來源的肝干細(xì)胞，并用腺相關(guān)病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染；DcR3基因的體外表達(dá)鑒定；所轉(zhuǎn)染的DcR3基因的體外功能實(shí)驗(yàn)。
　　2006.07-2007.06 完成肝移植的動物模型，將轉(zhuǎn)染后的肝干細(xì)胞經(jīng)門靜脈注入肝臟。按期取肝臟標(biāo)本，根據(jù)Y染色體標(biāo)志染色及GFP，確定轉(zhuǎn)基因肝干細(xì)胞在供肝中的定植、分布情況；檢測轉(zhuǎn)入肝干細(xì)胞的基因在肝臟中的表達(dá)情況；移植排斥反應(yīng)的發(fā)生情況。
　　2007.07-2007.12 補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)遺漏，整理實(shí)驗(yàn)資料，統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，撰寫論文。
　　預(yù)期研究結(jié)果
　　1.證明轉(zhuǎn)染DcR3基因的肝干細(xì)胞能在供肝匯管區(qū)及部分血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)出長期的肝移植免疫耐受。
　　2.在國外學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表論文2-3篇，在國內(nèi)核心期刊發(fā)表論文6-8篇，并在國內(nèi)學(xué)術(shù)會議交流。
　　(二）研究基礎(chǔ)與工作條件
　　1.工作基礎(chǔ)（與本項(xiàng)目相關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工作成績）
　　2月底至3月初出結(jié)果。
　　2.工作條件（包括已具備的實(shí)驗(yàn)條件，沿缺少的實(shí)驗(yàn)條件和擬解決的途徑，包括利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和部門開放實(shí)驗(yàn)室的計(jì)劃與落實(shí)情況。）
　　刪去
　　3.申請人簡歷（包括申請者和項(xiàng)目組主要成員的學(xué)歷和研究工作簡歷，近期已發(fā)表與本項(xiàng)目有關(guān)的主要論著目錄和獲得學(xué)術(shù)獎勵情況及在本項(xiàng)目中承擔(dān)的任務(wù)。）
　　刪去
　?。ㄈ┙?jīng)費(fèi)申請說明（要求按照《國家自然科學(xué)基金經(jīng)費(fèi)管理辦法》認(rèn)真填寫，購置5萬元以上固定資產(chǎn)及設(shè)備等，須逐項(xiàng)說明與項(xiàng)目研究的直接相關(guān)性及必要性。）
　?。ㄋ模┢渌郊鍐危ǜ郊牧蠌?fù)印后隨紙質(zhì)《申請書》一并上交）（隨紙質(zhì)申請書一同報(bào)送的附件清單，如：具有中級技術(shù)職稱申請者的推薦信或在職研究生申請項(xiàng)目的導(dǎo)師推薦信等。）

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