除了基因測(cè)序還能干什么？下一代測(cè)序在生物醫(yī)療領(lǐng)域的其他應(yīng)用

2016年10月13日訊 目前的下一代基因測(cè)序（NGS）市場(chǎng)，Illumina繼續(xù)獨(dú)占鰲頭。自從推出HiSeq X測(cè)序平臺(tái)以來，大幅度降低了基因測(cè)序的成本，即使是研究級(jí)全基因組測(cè)序的成本一直穩(wěn)定在1000美元左右。至此以后，這一水平的唯一競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手--華大基因的Revolocity測(cè)序儀也顯得吃力。這也引起了許多研究人員猜測(cè)，長(zhǎng)此以往會(huì)導(dǎo)致這一領(lǐng)域缺乏競(jìng)爭(zhēng)力，導(dǎo)致NGS的發(fā)展（至少在短鏈閱讀研究上）十分緩慢。但令人欣慰的是，NGS在其他領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展也十分迅速。

1.長(zhǎng)鏈閱讀技術(shù)

NGS在長(zhǎng)鏈閱讀領(lǐng)域有巨大的進(jìn)展，揭示了基因組合轉(zhuǎn)錄的復(fù)雜性。在基因組的分析過程中，主要的問題是處理重復(fù)序列的DNA。如果序列重復(fù)的長(zhǎng)度要長(zhǎng)于基本閱讀的長(zhǎng)度，那么實(shí)現(xiàn)參考基因組的唯一映射就會(huì)變得很困難，甚至是不可能。

無獨(dú)有偶，基因轉(zhuǎn)錄的分析過程也面臨同樣的挑戰(zhàn)?！按蠖鄶?shù)基因包含了多個(gè)外顯子，以至于mRNA的長(zhǎng)度比閱讀范圍的長(zhǎng)度要長(zhǎng)。”Personalized Healthcare 的Brenton Gravely博士表示：“因此，利用長(zhǎng)鏈閱讀來準(zhǔn)確無誤的了解特定樣品中存在哪一種異構(gòu)體，是不太可能的。”

Oxford Nanopore是一家備受關(guān)注基因測(cè)序公司。去年春天，Oxford Nanopore率先推出了基于納米孔技術(shù)的測(cè)序儀MinION。盡管 后來Oxford Nanopore推遲了正式發(fā)布的時(shí)間，但公司已經(jīng)確實(shí)將它的技術(shù)推廣到大眾。目前，超過1000家研究團(tuán)隊(duì)使用是MinION測(cè)序儀。

在最初版本發(fā)布一年之內(nèi)，通過對(duì)酶化學(xué)和納米孔設(shè)計(jì)的一系列改進(jìn)，MinION的生產(chǎn)量從不足1億增長(zhǎng)至超過10億。從質(zhì)量，產(chǎn)量和成本來看，MinION與Illumina還存在一定差距，但 Oxford Nanopore 的儀器卻在兩方面占有優(yōu)勢(shì)：閱讀長(zhǎng)度和可移動(dòng)性。

在使用者的報(bào)告中反饋出，成千數(shù)萬次閱讀中的平均長(zhǎng)度超過了10萬。DNA的輸入質(zhì)量和預(yù)備存儲(chǔ)似乎是限制閱讀長(zhǎng)度的唯一真正的因素。也就是說，如果滿足了輸入質(zhì)量和預(yù)備存儲(chǔ)，就能夠延長(zhǎng)閱讀長(zhǎng)度。

同時(shí)，MinION還是一款可手持的測(cè)序儀，甚至可以在野外完成數(shù)據(jù)收集，不需要將處理后的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室再進(jìn)行分析。一開始，數(shù)據(jù)質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Illumina，但經(jīng)過改進(jìn)，數(shù)據(jù)質(zhì)量已經(jīng)大幅提高。最新的R9 主打快捷模式，在理想環(huán)境下，測(cè)試的精度已經(jīng)上升到95%。

太平洋生物是長(zhǎng)鏈閱讀測(cè)序的領(lǐng)導(dǎo)者，近年也是成果頗豐。去年美國(guó)人類遺傳學(xué)會(huì)上，公司公布了一個(gè)新的平臺(tái)---Sequel。這個(gè)平臺(tái)是與羅氏合作開發(fā)的成果，相比之前的RS II，在各個(gè)方面都有提升。

與RS II相比，Sequel的輸出率更大，所占空間不到之前2/3，成本也只需要之前的一半。一直以來，太平洋生物科學(xué)公司都希望平臺(tái)能夠充分利用，解決化學(xué)和供應(yīng)問題，特別是對(duì)可消費(fèi)的SMRT（single molecule， real time）細(xì)胞。目前，這兩個(gè)問題似乎都得以解決，公司正在等待第一批客戶生成的數(shù)據(jù)反饋。

除了以上兩家，行業(yè)內(nèi)有影響力的還有GemCode的10X Genomics，可以從底層短鏈閱讀數(shù)據(jù)生成連接。盡管這項(xiàng)技術(shù)還存在一些瑕疵，比如對(duì)于長(zhǎng)于底層短鏈閱讀的重復(fù)片段作用不大。但目前平臺(tái)運(yùn)作良好，今年早些時(shí)候還與Illumina 簽訂了聯(lián)合營(yíng)銷協(xié)議，如果 Illumina的Moleculo synthetic長(zhǎng)鏈閱讀技術(shù)衰退，則協(xié)議開始生效。

盡管有所進(jìn)步，但長(zhǎng)鏈閱讀技術(shù)，特別是基因轉(zhuǎn)錄測(cè)序，仍有問題仍急需解決?！岸渲幸粋€(gè)問題就是目前這些平臺(tái)的吞吐量，但更大的問題是，逆轉(zhuǎn)錄酶的間斷性還不夠?！盙ravely博士解釋道：“在RNA直接測(cè)序中，性能優(yōu)越的逆轉(zhuǎn)錄酶可以帶來很大的改變。”

令轉(zhuǎn)錄研究人員興奮的是，Oxford Nanopore在最近發(fā)表的一篇論文中表明，他們正著手推出利用MinION 直接測(cè)序RNA的商業(yè)試劑盒。

2.單細(xì)胞基因組學(xué)

另一個(gè)應(yīng)用就是單細(xì)胞基因組學(xué)。到目前為止，所有NGS項(xiàng)目（只有極少數(shù)例外）都是在混合細(xì)胞中進(jìn)行的，即從上千乃至上萬個(gè)細(xì)胞中對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序。如果所有的細(xì)胞都是完全均勻的，那么所有細(xì)胞可作為一般情況下的體細(xì)胞基因組，這并不是一個(gè)問題。然而，許多應(yīng)用程序中，并不是所有的細(xì)胞都是完全均勻的，需要集中匯集挑選關(guān)鍵信息。

例如，腫瘤活檢就極富異質(zhì)性，包含了體細(xì)胞和癌細(xì)胞。不僅如此，即使是同一個(gè)腫瘤的癌細(xì)胞也可能有不同的基因組。匯聚多個(gè)細(xì)胞，就會(huì)產(chǎn)生一個(gè)混合的基因組庫(kù)，加大了解釋和分析的難度。目前的研究水平，只有小部分的細(xì)胞變化是可以忽略不計(jì)的。

一開始，研究人員采取的策略是嘗試在活檢組織內(nèi)部的幾個(gè)不同的地方，分別采取幾個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量。如果積累了足夠多的個(gè)體測(cè)量，那么就可以建立一個(gè)全面的腫瘤基因組視圖。

另一個(gè)方法就是單細(xì)胞途徑。轉(zhuǎn)錄組是高度可變的細(xì)胞，將細(xì)胞聚集起來可以掩蓋基因表達(dá)模式的潛在變異。

“就在幾年前，上百個(gè)單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄學(xué)分析可能花費(fèi)大量的時(shí)間和資源?！被蚪M學(xué)科學(xué)家Richard Shen最近離開了Illumina跳槽到RS技術(shù)公司，他提到：“現(xiàn)在，隨著簡(jiǎn)單易用的NGS文庫(kù)技術(shù)的發(fā)展，大大降低了開發(fā)成本，分析上千個(gè)單細(xì)胞不僅成為現(xiàn)實(shí)，而且所分析得到的數(shù)據(jù)在許多應(yīng)用中也顯示了價(jià)值?！?/p>

對(duì)于單細(xì)胞庫(kù)的制備，許多平臺(tái)都可以實(shí)現(xiàn)：Fluidigm的C1，可以同時(shí)處理800個(gè)細(xì)胞；Chromium的10X Genomics，更是可同時(shí)處理多達(dá)48000個(gè)細(xì)胞。這樣的處理能力，并不是每個(gè)研究人員的目的，Gravely 指出：“一些平臺(tái)或者自制設(shè)備的吞吐量是非常讓人興奮的，我們所希望看到的是疊加效果，比如像holy grai這樣的單細(xì)胞長(zhǎng)鏈閱讀測(cè)序儀?！?/p>

3.癌癥液體活檢

同樣吸引人注意應(yīng)用就是癌癥診斷的液體活檢。某種程度上，NGS在腫瘤活檢領(lǐng)域的應(yīng)用在正越來越普及。Foundation醫(yī)學(xué)的FoundationOne測(cè)試就是最好的例子。一個(gè)由315種相關(guān)癌癥基因的標(biāo)記組合成的單一測(cè)試面板。這些基本面板測(cè)試取代了傳統(tǒng)的單一基因測(cè)試。

癌癥診斷也在從腫瘤組織活檢向液體活檢偏移。不同于從腫瘤上切片提取DNA，癌癥液體活檢從循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）或者患者血液中游離細(xì)胞中提取游離DNA（cfDNA）。就目前來看，由于提供了許多解刨和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的信息，腫瘤組織活檢暫時(shí)不會(huì)消失，但是許多液體活檢的研究人員表示，液體活檢具有更多功能性。

“從癌癥篩查的角度來看，液體活檢更具有吸引力，因?yàn)樗麄儾坏?jiǎn)單準(zhǔn)確，而且可以進(jìn)行癌癥之前的常規(guī)檢查。”Freenome聯(lián)合創(chuàng)始人兼首席執(zhí)行官 Gabriel Otte表示：“從預(yù)防和確診病人的檢測(cè)來看，液體活檢同樣具有優(yōu)勢(shì)，尤其是那些超過30%因?yàn)楦鞣N原因不適合侵入性活檢的病例?！?/p>

作為一個(gè)熱門的新領(lǐng)域，一些新興企業(yè)正迅速成長(zhǎng)，更多的大公司正在革新以占取龐大且不斷增長(zhǎng)的市場(chǎng)。

早在2014年，Guardant Health聲稱他們是第一個(gè)走向市場(chǎng)的液體活檢企業(yè)。這一診斷被稱為Guardant360。Freenome采取了不同的手段，通過測(cè)試癌癥全基因組來實(shí)現(xiàn)癌癥診斷。“我們依靠我們的深度學(xué)習(xí)?！監(jiān)tte表示：“為了做出準(zhǔn)確的癌癥檢測(cè)，我們根據(jù)最相關(guān)的特定區(qū)域?qū)ψ龀隽颂囟ǖ姆謪^(qū)?！?/p>

Illumina的測(cè)序技術(shù)已經(jīng)被大多數(shù)公司利用，在這場(chǎng)競(jìng)技中，也推出自己的液體活檢公司---Grail。也許是為了避免與自己的客戶出現(xiàn)直接競(jìng)爭(zhēng)，Illumina表示將主要圍繞前期篩選，這個(gè)沒有其他公司關(guān)注，且更具挑戰(zhàn)性的任務(wù)。

4.縱向研究

隨著液體活檢的出現(xiàn)，監(jiān)測(cè)研究性試驗(yàn)中腫瘤患者的反映，以及適當(dāng)?shù)臉悠犯櫼呀?jīng)變得越來越重要。這一過程，至少需要分析3種樣品：腫瘤組織，正常組織和循環(huán)游離DNA。

當(dāng)測(cè)序在的目標(biāo)較大，比如對(duì)全基因組進(jìn)行排序時(shí)，遺傳指紋是可以被確定的，以至于在數(shù)據(jù)分析過程中樣本可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)钠ヅ?。然而，Swift Biosciences生物學(xué)家Drew McUsic博士表示，當(dāng)測(cè)序目標(biāo)較小時(shí)，遺傳指紋不能產(chǎn)生。

“直到現(xiàn)在，研究人員仍利用單核苷酸的多樣性與LIMS系統(tǒng)排列配對(duì)來正確跟蹤樣本?！盡cUsic博士指出：“這些方法依賴于對(duì)多個(gè)樣本的正確標(biāo)記，以及數(shù)據(jù)文件與材料的精確匹配?！?/p>

為了尋找更精確的樣本識(shí)別方法，Swift生物科技開發(fā)了一款A(yù)ccel-Amplicon？ Sample_ID 面板。遺傳指紋由104個(gè)外顯子和性別特異性擴(kuò)增子提供，作為低比例spike-in（待測(cè)樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)樣，以檢測(cè)你在實(shí)驗(yàn)操作過程中的樣品損失），添加到任意一個(gè)Swift增擴(kuò)平臺(tái)，例如 Accel-Amplicon 56G Oncology Panel v2。McUsic博士還補(bǔ)充到：“從淺顯的生殖測(cè)序到到深度覆蓋性體細(xì)胞突變檢測(cè)都可以使用這樣的技術(shù)。”

該技術(shù)不僅提供了一個(gè)有效的，單管檢測(cè)分析腫瘤標(biāo)本的體細(xì)胞突變，同時(shí)在相同的測(cè)序文件內(nèi)產(chǎn)生基因指紋。他繼續(xù)說道，隨著越來越多的項(xiàng)目被設(shè)計(jì)應(yīng)用到跟蹤腫瘤患者的反應(yīng)率，在這些縱向研究將選擇合適的標(biāo)本跟蹤工具將顯得越來越重要。

目前來看，Illumina將繼續(xù)占有市場(chǎng)主導(dǎo)地位以及短鏈閱讀的高通量，但其他公司也在其他領(lǐng)域?qū)で筮M(jìn)步。Oxford Nanopore宣布了許多即將展開的研究，包括高通量的納米孔測(cè)序儀PromethION。該公司聲稱，他的吞吐量將能夠與Illumina的 HiSeq X競(jìng)爭(zhēng)。公司還就 兩臺(tái)自動(dòng)化樣品儀器VolTRAX和 Zumbador展開討論，保證未來DNA測(cè)序的全方位簡(jiǎn)化。

太平洋生物的 Sequel 平臺(tái)也有望被迅速采用。它可能帶來測(cè)序成本的降低，升值可能趕超Illumina?？梢钥隙ǖ氖牵S著使用的簡(jiǎn)化和成本的減少，NGS臨床使用的障礙將得到改善。

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