CCR：抗體/小分子組合治療展現(xiàn)對(duì)抗成神經(jīng)細(xì)胞瘤的新希望

CCR：抗體/小分子組合治療展現(xiàn)對(duì)抗成神經(jīng)細(xì)胞瘤的新希望

2016年10月11日訊 最近來自美國洛杉磯兒童醫(yī)院薩班研究所的研究人員進(jìn)行了一項(xiàng)研究，進(jìn)一步揭示了細(xì)胞因子TGFβ1在成神經(jīng)細(xì)胞瘤生長中的作用，并且提示了小分子藥物/抗體組合療法治療這種癌癥的可能性。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在國際學(xué)術(shù)期刊Clinical Cancer Research上。

成神經(jīng)細(xì)胞瘤是一種發(fā)生在神經(jīng)組織的實(shí)體瘤，也是最常見的一種兒童癌癥類型，大約一半發(fā)病兒童不到兩歲，占全部兒童癌癥死亡的15%。使用一種叫做dinutuximab的抗體藥物靶向成神經(jīng)細(xì)胞瘤表面高表達(dá)的GD2分子是目前治療這種疾病的一種治療方法。但是這種基于抗體開發(fā)的治療方法仍不足以防止癌癥復(fù)發(fā)。

除了直接靶向參與疾病發(fā)生的分子，許多抗體療法還靶向激活自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）。NK細(xì)胞是一類受到抗體激活以后能夠殺傷腫瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞。最近發(fā)現(xiàn)類似TGFβ1這樣的蛋白分子能夠抑制腫瘤微環(huán)境中NK細(xì)胞的抗癌功能。

TGFβ1是一種執(zhí)行許多種細(xì)胞功能的分泌蛋白，其功能包括控制細(xì)胞生長、增殖和細(xì)胞死亡。在這項(xiàng)研究中，研究人員找到一個(gè)對(duì)抗成神經(jīng)細(xì)胞瘤的新組合治療方法，其中既包括抗體藥物dinutuximab，又包含一種叫做galunisertib的小分子藥物，這種藥物能夠抑制TGFβ1的作用。研究人員將成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系或病人來源的成神經(jīng)細(xì)胞瘤組織移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)在對(duì)其進(jìn)行組合治療，發(fā)現(xiàn)galunisertib介導(dǎo)對(duì)TGFβ1的抑制，讓dinutuximab和NK細(xì)胞能夠更加有效地殺傷成神經(jīng)細(xì)胞瘤。

"將galunisertib這種藥物加入到基于NK細(xì)胞的細(xì)胞療法中能夠抑制腫瘤生長，促進(jìn)移植了腫瘤組織的小鼠模型的存活。"洛杉磯兒童醫(yī)院薩班研究所的獨(dú)立研究員Robert Seeger這樣說道。他表示galunisertib能夠逆轉(zhuǎn)TGFβ1誘導(dǎo)的對(duì)細(xì)胞殺傷作用的抑制，或可提高基于抗體的免疫治療方法對(duì)成神經(jīng)細(xì)胞瘤的治療效果。

肝癌的免疫治療是怎樣的？

肝癌的形成和發(fā)展過程中，可以通過干擾和抑制機(jī)體免疫功能逃避免疫系統(tǒng)殺傷作用。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者淋巴細(xì)胞亞群，CD4陽性細(xì)胞降低，陽性細(xì)胞增高，導(dǎo)致下降，NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞的活性亦明顯下降，外周血T細(xì)胞亞群及NK活性呈明顯抑制狀態(tài)，患者經(jīng)過繼免疫治療后，T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞活性明顯改善。

臨床類型不同的肝癌，TIL浸潤程度亦不同，無TIL浸潤的患者，術(shù)后生存時(shí)間較TIL浸潤的短，肝癌復(fù)發(fā)率也明顯增高。在肝癌患者血清和肝癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液可發(fā)現(xiàn)一些能抑制機(jī)體免疫功能的物質(zhì)。

通過調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體免疫力，達(dá)到對(duì)肝癌細(xì)胞抑制或殺傷效果的治療方法，稱為免疫治療。臨床常用凍干卡介苗、轉(zhuǎn)移因子、免疫核糖核酸、干擾素、阿地白介素（白細(xì)胞介素2）、腫瘤壞死因子等。

近年應(yīng)用IL-2/LAK和IL-2/TIL等過繼免疫療法治療肝癌，取得了一定的療效。采用合并化療免疫或過繼免疫化療，以及單克隆抗體為載體的導(dǎo)向治療，呈現(xiàn)了良好的趨勢(shì)。但確切的療效尚未肯定，有待進(jìn)一步研究。

可分為主動(dòng)、被動(dòng)和過繼免疫。根據(jù)特異性，又可以分為特異性和非特異性免疫。

（1）主動(dòng)免疫治療：①特異性主動(dòng)免疫治療：特異性主動(dòng)免疫是將腫瘤細(xì)胞抗原加入完全或不完全佐劑，制成疫苗，對(duì)機(jī)體進(jìn)行主動(dòng)免疫，以提高機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫力。Hanna等采用豚鼠荷瘤模型進(jìn)行特異性主動(dòng)免疫治療發(fā)現(xiàn)，將靜脈注射106肝癌細(xì)胞的豚鼠作為治療組，90天以后，對(duì)照組動(dòng)物全部死亡，而治療組動(dòng)物存活率為66.7%，同時(shí)觀察到本方法與化療能起協(xié)同殺傷作用。目前，特異性主動(dòng)免疫治療的方法有：制備腫瘤多肽疫苗和基因工程疫苗：

根據(jù)腫瘤相關(guān)抗原的結(jié)構(gòu)，制備出相對(duì)特異的疫苗，使機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫效應(yīng)。

抗獨(dú)特型抗體疫苗：抗腫瘤抗體高變區(qū)存在獨(dú)特型抗原，而抗特異抗原的抗體高變區(qū)與腫瘤抗原結(jié)構(gòu)相似，從而可以模擬腫瘤疫苗觸發(fā)機(jī)體的抗腫瘤反應(yīng)。

但是，主動(dòng)特異性免疫尚存在某些缺陷，近年來，已經(jīng)加強(qiáng)某些相關(guān)的治療研究，如加強(qiáng)肝癌細(xì)胞MHC-I、B7等基因的表達(dá)，使得免疫細(xì)胞能更有效地識(shí)別和清除腫瘤抗原，達(dá)到更好的治療效果。

②主動(dòng)非特異性免疫治療：采用非特異性免疫制劑，增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能，激活效應(yīng)細(xì)胞，提高機(jī)體非特異性免疫能力，以發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的治療叫主動(dòng)非特異性免疫治療。目前常用的免疫刺激劑和調(diào)節(jié)劑有四類：微生物及其制劑：凍干卡介苗、短小棒狀桿菌、鏈球菌及病毒等。生物制劑：如干擾素、腫瘤壞死因子、胸腺素等。

化學(xué)制劑如左旋咪唑等。

以下介紹幾種常用藥物。

①凍干卡介苗：凍干卡介苗能非特異性地激活巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞、K細(xì)胞、NK細(xì)胞，這可能是其抗肝癌的主要作用機(jī)制。臨床試驗(yàn)表明凍干卡介苗對(duì)肝癌具有一定的療效。單純應(yīng)用凍干卡介苗治療143例Ⅱ期肝癌患者，一年生存率為25.8%，而對(duì)照組僅為13.4%。凍干卡介苗與腫瘤疫苗聯(lián)合使用，療效更好。

如接種凍干卡介苗后，皮膚潰瘍數(shù)月才愈合，說明機(jī)體防御能力良好，如對(duì)疫苗無反應(yīng)，則提示預(yù)后不良。凍干卡介苗一般用量為6×108個(gè)活菌，通常采用皮內(nèi)接種、皮上劃痕、口服和瘤內(nèi)注射、腹腔注射等給藥途徑。毒副反應(yīng)主要有局部皮膚紅腫、潰爛，發(fā)熱、肌肉酸痛、畏寒等感冒癥狀群，體溫一般不超過39℃。

②短小棒狀桿菌：短小棒狀桿菌能刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，提高機(jī)體非特異性免疫功能。短小棒狀桿菌結(jié)合化學(xué)治療，使晚期腫瘤患者生存期較單純化療對(duì)照組延長2倍。用短小棒狀桿菌加順鉑腔內(nèi)灌注治療肝癌腹水患者，有效率遠(yuǎn)高于單用順鉑的對(duì)照組。

短小棒狀桿菌臨床常用劑量為4mg/次，1次/周。注射途徑有瘤內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈和腹腔等。

③鏈球菌制劑（OK432）：OK432是從溶血型鏈球菌中開發(fā)出來的一種生物調(diào)節(jié)劑，它可以刺激淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤組織的反應(yīng)，具體機(jī)制尚不太清楚。將OK432局部注射于腫瘤組織，能使腫瘤縮小，AFP水平下降。將OK432與肝癌的其他治療方法如手術(shù)切除、動(dòng)脈栓塞、化療等聯(lián)合使用，可以起到協(xié)同殺傷肝癌細(xì)胞的作用，患者生存期明顯延長。

④干擾素（IFN）：最初發(fā)現(xiàn)，人體在接觸病毒后會(huì)產(chǎn)生一種干擾病毒生長和增殖的蛋白質(zhì)，稱之為干擾素，后來發(fā)現(xiàn)，干擾素對(duì)許多惡性腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用。目前認(rèn)為干擾素的抗腫瘤機(jī)制為抑制腫瘤病毒的繁殖及癌細(xì)胞中癌基因的過表達(dá)，調(diào)節(jié)宿主的免疫活性，如激活單核.巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞活性，介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)，促使內(nèi)源性干擾素的產(chǎn)生，促進(jìn)腫瘤相關(guān)抗原、MHC-I類抗原的表達(dá)，提高效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別能力。

根據(jù)抗原特異性和分子結(jié)構(gòu)的不同，將干擾素分為α、β、γ三種。

由白細(xì)胞（主要為淋巴細(xì)胞）生成的主要為IFN-α，由成纖維細(xì)胞生成的主要為IFN-β，由植物血凝素刺激正常淋巴細(xì)胞或經(jīng)抗原致敏淋巴細(xì)胞接觸同種抗原后生成的主要為IFN-γ，現(xiàn)已可以通過生物工程技術(shù)，生產(chǎn)出生物學(xué)作用相同，活性更強(qiáng)的各種干擾素。

IFN已大量應(yīng)用于腫瘤的臨床治療，對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤的療效良好，單獨(dú)應(yīng)用實(shí)體瘤治療僅對(duì)腎癌、惡性黑色素瘤療效較可靠。但應(yīng)用IFN與化療等聯(lián)合應(yīng)用治療肝癌，癌腫縮小程度和患者生存時(shí)間均高于對(duì)照組。比較三種干擾素的抗肝癌作用發(fā)現(xiàn)，IFN-γ的抗腫瘤作用比IFN-α、IFN-β療效強(qiáng)。

IFN目前常用的給藥途徑為肌內(nèi)注射，一般劑量為次，1次/d或隔日1次。常見的副反應(yīng)有發(fā)熱、畏寒、肌肉酸痛等流感樣癥狀，少數(shù)患者可出現(xiàn)輕度骨髓抑制現(xiàn)象。副反應(yīng)在用藥初期往往較明顯，以后逐漸減輕，停藥后癥狀消失。

⑤腫瘤壞死因子（TNF）：TNF是單核巨噬細(xì)胞受內(nèi)毒素刺激后產(chǎn)生的一種非糖基化蛋白，由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的為TNF-α，由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的稱TNF-β，由NK細(xì)胞生成的稱為TNF-γ。其抗癌機(jī)制為：

能特異性、選擇性抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成；通過腫瘤細(xì)胞表面受體介導(dǎo)內(nèi)化，進(jìn)入溶酶體，發(fā)揮細(xì)胞毒作用；損傷或阻塞腫瘤血管，引起腫瘤組織出血性或缺血性壞死；增強(qiáng)免疫功能，活化淋巴細(xì)胞，激活NK細(xì)胞；可促進(jìn)IFN-γ的生成；通過增強(qiáng)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞MHC-I型抗原的表達(dá)，提高前凝血素的產(chǎn)生和降低血栓調(diào)節(jié)素的生成，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楸砻娲倌?，引起腫瘤血管內(nèi)血流凝固，介導(dǎo)腫瘤組織細(xì)胞的壞死。

將TNF與化療藥物氟尿嘧啶（5-Fu）、順鉑（DDP）、多柔比星（ADM）或絲裂霉素（MMC）混合，加用碘化油和吸收性明膠海綿為栓塞劑治療中晚期肝癌，腫瘤縮小率、手術(shù)切除率及生存期均較單純化療栓塞組高。有研究將表達(dá)TNF的真核表達(dá)系統(tǒng)導(dǎo)入肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其體外的致瘤性較對(duì)照組明顯減弱。

TNF可用于肌內(nèi)注射、皮下注射、靜脈滴注、動(dòng)脈灌注和腔內(nèi)注射，由于其半衰期短，必須連續(xù)大劑量用藥方能奏效。目前臨床應(yīng)用TNP治療肝癌的經(jīng)驗(yàn)尚不多，給藥方法、劑量有待進(jìn)一步完善。常見的副作用有寒戰(zhàn)、高熱、乏力、肌痛、惡心、嘔吐，一過性ALT和肌酐升高，血小板和白細(xì)胞減少，嚴(yán)重者可出現(xiàn)毛細(xì)血管滲漏綜合征。

（6）阿地白介素（白細(xì)胞介素-2）：IL-2是由抗原活化輔助性T細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，主要誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)細(xì)胞毒或溶細(xì)胞活性。阿地白介素（IL-2）可以誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞、NK細(xì)胞、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞、CD3單抗激活的殺傷細(xì)胞（CD3AK）等效應(yīng)細(xì)胞，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。

（2）被動(dòng)性免疫治療：被動(dòng)性免疫治療是應(yīng)用肝癌相關(guān)抗原的抗體，通過抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用達(dá)到殺滅肝癌細(xì)胞的作用。目前極少單獨(dú)應(yīng)用抗體對(duì)肝癌進(jìn)行被動(dòng)免疫治療，多采用抗體為彈頭的導(dǎo)向治療，詳見導(dǎo)向治療。

（3）過繼性免疫治療：①特異性過繼性免疫治療：應(yīng)用特異性抗原致敏的淋巴細(xì)胞及其因子，如轉(zhuǎn)移因子、免疫核糖核酸對(duì)腫瘤的治療，稱之為特異性過繼免疫治療。

轉(zhuǎn)移因子是一種小分子核酸肽，有免疫特異性，無抗原性，主要作用有：特異性轉(zhuǎn)移細(xì)胞免疫反應(yīng)。“抗原依賴”性增強(qiáng)淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性。非特異性刺激作用，提高細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)單核細(xì)胞吞噬功能，誘導(dǎo)干擾素生成。

轉(zhuǎn)移因子配合化療和中藥治療肝癌，能提高機(jī)體免疫功能，減輕臨床癥狀，使腫塊縮小，AFP水平下降，轉(zhuǎn)移因子通常用于皮下注射，毒副作用較少見。

②非特異性過繼性免疫治療：應(yīng)用非特異性免疫因子/免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)惡性腫瘤進(jìn)行治療的方法，叫非特異性過繼性免疫療法（AIT）。

AIT自20世紀(jì)80年代以來，已進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究，它不受宿主免疫狀態(tài)的影響，也不引起免疫耐受，目前研究最多的是淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK）、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞及白細(xì)胞介素-2。

LAK細(xì)胞：將來自患者或異體的淋巴細(xì)胞，體外培養(yǎng)經(jīng)IL-2誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)變成非特異性殺傷淋巴細(xì)胞，然后回輸患者體內(nèi)，利用被誘導(dǎo)激活的淋巴細(xì)胞，發(fā)揮對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。LAK細(xì)胞的前體細(xì)胞可能是具有細(xì)胞毒活性作用的異質(zhì)細(xì)胞群體，不受MHC-Ⅰ型抗原的限制，也不受腫瘤抑制因子的影響，具有廣譜的抗腫瘤作用，因此，對(duì)逃避NK細(xì)胞“捕獲”的腫瘤細(xì)胞也有廣泛的殺傷作用。

最初LAK細(xì)胞是取自腫瘤患者外周血淋巴細(xì)胞，由于血液來源有限，使LAK細(xì)胞的應(yīng)用受到一定程度的限制。繼之研究發(fā)現(xiàn)，來自同種異體的淋巴細(xì)胞，如取自臍帶血的淋巴細(xì)胞，經(jīng)IL-2誘導(dǎo)活化后同樣具有相同的生物學(xué)功能，從而為LAK細(xì)胞拓寬了來源。人們?cè)鴩L試能否應(yīng)用大劑量阿地白介素（IL-2）在體內(nèi)對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行活化而達(dá)到LAK細(xì)胞的治療效果，實(shí)踐證明尚存較大的距離，可能的原因是阿地白介素（IL-2）半衰期短，不能維持足夠的高濃度，而過大劑量的阿地白介素（IL-2）對(duì)機(jī)體的毒副作用大，難以耐受，從而使體內(nèi)環(huán)境不利于LAK細(xì)胞的激活和擴(kuò)增。

目前傾向于經(jīng)肝動(dòng)脈途徑給藥，這樣可以增加局部有效細(xì)胞數(shù)量，減少LAK細(xì)胞用量，減輕毒副反應(yīng)。有癌性胸腹水者可經(jīng)胸、腹腔內(nèi)給藥。阿地白介素（IL-2）與LAK細(xì)胞可以同時(shí)輸注，亦可經(jīng)外周靜脈維持滴注。一般治療的LAK細(xì)胞數(shù)量應(yīng)達(dá)到次，8～10次為1個(gè)療程，阿地白介素（IL-2）用量為（1～3）×105U。

LAK/IL-2的毒副作用主要為畏寒、發(fā)熱、皮疹等。

腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）：分離肝癌組織或癌周淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞，經(jīng)體外IL-2誘導(dǎo)活化和擴(kuò)增，然后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，對(duì)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，即為TIL療法。與LAK細(xì)胞比較，TIL的細(xì)胞來源不同，TIL的前體細(xì)胞絕大部分是細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞，能表達(dá)T細(xì)胞抗原，多數(shù)CD4、CD8陽性。TIL細(xì)胞經(jīng)IL-2誘導(dǎo)后，擴(kuò)增能力強(qiáng)于LAK細(xì)胞，容易獲得所需要的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)。由于TIL細(xì)胞接受自體腫瘤抗原的持續(xù)性刺激，特異性高，殺傷活性比LAK細(xì)胞強(qiáng)50～100倍，因僅對(duì)自體來源的腫瘤細(xì)胞具有識(shí)別和殺傷作用。

TIL細(xì)胞輸入體內(nèi)后迅速分布在肺臟中，24h后聚集于肝、脾，48～72h在癌灶中達(dá)高峰，可維持5～9天。

由于TIL主要是利用患者瘤內(nèi)或癌旁淋巴結(jié)的前體細(xì)胞，所以臨床應(yīng)用受到一定的限制。

免疫學(xué)技術(shù)知識(shí)總結(jié) 第二章

第二章 抗體制備技術(shù)

抗體的基本概念：多克隆抗體（多個(gè)淋巴細(xì)胞克隆所分泌的抗體）和單克隆抗體（單個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所分泌的抗體）

單克隆抗體的特點(diǎn)：

高度均質(zhì)（同一亞類），化學(xué)組成均一，不含或很少含Ig

特異性強(qiáng)，只針對(duì)某一種抗原表位

親和力強(qiáng)

抗原用量少，無須純化

無批間差異

來源穩(wěn)定，可達(dá)批生產(chǎn)，容易標(biāo)準(zhǔn)化

不易形成沉淀線

操作比較麻煩

什么條件下需要制備單抗：

目的蛋白有類似的結(jié)構(gòu)

抗原不純，無法分開

多抗的效果不好（已經(jīng)排除非特異性反應(yīng)）

希望將抗體用于治療，研制成藥物

希望將抗體用于診斷，研制成診斷試劑。

第一節(jié)?? 多克隆抗體的之別

一、多克隆抗體制備的原理

抗體制備、動(dòng)物免疫、抗體純化

二、多抗的基本條件

1.? ?免疫原的制備

顆粒性抗原：細(xì)胞、病毒、細(xì)菌等，一般具有較強(qiáng)的免疫原性，可以不加佐劑，直接進(jìn)行腹腔注射。

可溶性抗原：可溶性抗原的來源主要是天然純化，或者用目的基因在原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞中表達(dá)，可溶性抗原需要與弗氏佐劑完全或不完全混勻，才可以進(jìn)行免疫。

（1） 完全抗原的提?。杭?xì)胞破碎法、抗原提取、抗原的純化

（2）半抗原與載體的交聯(lián)：載體的選擇、半抗原與載體偶聯(lián)的方法、偶聯(lián)復(fù)合物的鑒定

（3）合成肽抗原：免疫原性肽的選擇、肽的合成和純化

2. 免疫動(dòng)物的選擇：

3.? ?佐劑的準(zhǔn)備：

佐劑的種類：無機(jī)佐劑、有機(jī)佐劑、合成佐劑、油劑

三、多克隆抗體制備的基本方法

1.? 抗原計(jì)量、免疫途徑與免疫日程

免疫動(dòng)物的方法：

免疫原值被：

無佐劑免疫法：適用于顆粒性抗原

弗氏佐劑免疫法：適用于可溶性抗原

鋁佐劑免疫法：適用于人的免疫

免疫動(dòng)物（一般選擇雌性動(dòng)物，溫順并且可以生產(chǎn)）

皮內(nèi)免疫法

皮下或肌肉免疫法

淋巴結(jié)免疫法

混合法

抗體效價(jià)滿意后靜脈注射加強(qiáng)免疫

常見的注射方法；皮下注射、皮內(nèi)注射、尾靜脈注射、靜脈注射

2.? ?小樣試血與采血

抗血清的獲得：眼眶取血、頸動(dòng)脈放血、心臟采血

免疫效果評(píng)價(jià)：取血（兔耳動(dòng)脈、鼠尾靜脈）、檢測(cè)（雙向免疫擴(kuò)散、ELISA）

3.? ?抗體的分離和純化技術(shù)

鹽析法、凝膠過濾法、離子交換層析、親和層析法、電泳分離法

親和層析法原理：利用蛋白質(zhì)之間的特異性結(jié)合（抗原-抗體、受體-配體）將一種配基與凝膠顆粒結(jié)合，捕捉與他相配的物質(zhì)，洗脫另外一種物質(zhì)，并且洗脫一般用改變pH的方法。

主要步驟：將蛋白質(zhì)與活化柱子結(jié)合，將腹水或者血清處理后過柱子，用結(jié)合緩沖液洗柱子（知道A280為零），永安氨酸緩沖液洗脫抗體，等量收集洗脫液，測(cè)定洗脫液的A280值，保留A280值明顯升高的樣品。

4.? ?抗體的鑒定

蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定：紫外分光比色法、雙縮脲法、福林酚法、

免疫效果評(píng)價(jià)：雙向免疫擴(kuò)散、ELISA

純度分析：免疫印跡（WB）

抗體類別分析：免疫金試條

親和力分析：ELISA、熒光偏振

5.? 抗體的保存

抗體的濃縮：吸收、蒸發(fā)、超濾

抗體的保存：濃縮抗議+甘油+防腐劑

免疫效果不佳的原因可能是：抗原純度不夠、免疫原性低、免疫途徑乳化不合格、免疫劑量不合適、動(dòng)物疾病或者種屬差異小。

第二節(jié)? 單克隆抗體制備技術(shù)

一、單克隆抗體制備的原理

1個(gè)B細(xì)胞只能產(chǎn)生1個(gè)抗體。方法是細(xì)胞工程雜交技術(shù)和B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)

需要將單克隆B細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞相結(jié)合才可以永久產(chǎn)生單抗

Barski等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞額自然融合現(xiàn)象，但是頻率很低

岡田等發(fā)現(xiàn)滅火的仙臺(tái)稟賦和聚乙二醇能顯著提高細(xì)胞融合的效率。

二、單抗制備的基本條件

需要培養(yǎng)正常的B細(xì)胞以及B細(xì)胞融合的腫瘤細(xì)胞

1.? ?動(dòng)物的免疫抗原與載體、動(dòng)物的選擇、免疫途徑

舉例：小鼠免疫

第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐劑——小鼠背部皮下注射（4周后）

第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐劑——小鼠背部皮下注射（3周后）

第三次免疫：可溶性抗原加生理鹽水——小鼠腹腔注射（10天后檢測(cè)血清效價(jià)）

加強(qiáng)免疫：可溶性抗原加生理鹽水——小鼠腹腔注射（3天后）

細(xì)胞融合

2.? 酶缺陷型骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)

細(xì)胞DNA合成途徑：

次黃嘌呤（H）通過嘌呤合成跑路途經(jīng)合成HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶）進(jìn)一步合成鳥嘌呤核苷酸

胸腺嘧啶核苷（T）通過嘧啶合成旁路途經(jīng)合成TK（胸腺嘧啶核苷激酶），進(jìn)一步合成胸腺嘧啶脫氧核苷酸

氨基酸、谷氨酰胺、鳥核苷單磷酸通過核酸生物合成主要途徑結(jié)合上面兩步合成的鳥嘌呤核苷酸以及胸腺嘧啶脫氧核苷酸形成DNA

將第三步當(dāng)中氨基端變?yōu)榘被剩ˋ），則無法形成DNA。

因此酶缺陷型細(xì)胞的篩選就是HAT篩選

3.? ?單抗檢測(cè)方法的建立

免疫酶技術(shù)

免疫熒光技術(shù)

免疫擴(kuò)散技術(shù)

三、單抗制備的基本方法

1.? ?酶缺陷型骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)

組織培養(yǎng)的基本條件：

儀器：包括CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈臺(tái)、液氮罐、低速低溫離心機(jī)

試劑：培養(yǎng)液、HAT選擇培養(yǎng)液、HT培養(yǎng)液、血清、抗生素

耗材：培養(yǎng)板、培養(yǎng)品、吸管、移液管

骨髓瘤細(xì)胞系的選擇要點(diǎn)：

（1）? 所選的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)與提供免疫脾細(xì)胞的動(dòng)物品系相同

（2）? 自身不產(chǎn)生免疫球蛋白的重鏈和輕鏈

（3）? 對(duì)氨基碟呤敏感

（4）? 與免疫脾細(xì)胞融合后產(chǎn)生穩(wěn)定分泌的Ig雜交細(xì)胞

2.? ?飼養(yǎng)細(xì)胞的制備

飼養(yǎng)細(xì)胞的作用：

（1） 增加細(xì)胞濃度，滿足新生雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的要求

（2）? 吞噬清楚死亡的細(xì)胞

（3）? 分泌生長刺激因子促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞的生長

飼養(yǎng)細(xì)胞的種類和制備方法

（1）? 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞

（2）? 小鼠脾細(xì)胞

（3）? 成纖維細(xì)胞

3.? ? ?脾細(xì)胞的分離

（1）? 拉頸椎處死小鼠

（2）? 無菌操作取出脾臟

（3）? 清洗、研磨

（4）? 收集細(xì)胞

（5）? 離心洗滌

（6）? 細(xì)胞計(jì)數(shù)

4.? ? ?細(xì)胞融合：骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞按照1:10或1:5的比例混合并加入促融劑PEG

細(xì)胞融合的方法：PEG融合、仙臺(tái)病毒、電融合

5.? ? HAT選擇性培養(yǎng)

?????? HAT選擇性培養(yǎng)的原理：細(xì)胞的DNA生物合成右主要途徑和補(bǔ)償途徑。當(dāng)A存在是，能夠阻斷DNA合成的主要途徑，須通過補(bǔ)償途徑合成DNA，這時(shí)就需要HGPRT利用H合成DNA，或者TK利用T合成DNA。

?????? 由于選用西黃嘌呤鳥嘌呤荷塘轉(zhuǎn)移酶缺陷型（HPRR-）骨髓瘤在細(xì)胞或者胸腺嘧啶割肝激酶缺陷型（TK-）細(xì)胞作為親本，該校只能通過群全條件的DNA培養(yǎng)基才可合成，因此雜種細(xì)胞通過互補(bǔ)作用獲得HGPPT或者TK基因。只有雜種細(xì)胞可以活，酶缺乏性細(xì)胞完全無法存活，單克隆B細(xì)胞一般不能長期生長，就起到了分離雜交細(xì)胞的作用。

?????? 細(xì)胞生長情況：融合3-4天之后，可以看到刑訴骨髓瘤細(xì)胞，混元透亮的克隆。融合后第7-9天去培養(yǎng)上清，檢測(cè)特異性抗體。

?????? 篩選后存活的細(xì)胞就是脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合細(xì)胞。

6.? ? ?陽性克隆的篩選

分泌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的檢測(cè)方法

免疫酶技術(shù)：簡介ELISA法

免疫熒光技術(shù)：間接免疫熒光測(cè)定法、流式細(xì)胞分析技術(shù)（陰性對(duì)照：骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，陽性對(duì)照：免疫鼠血清）

7.? ? ?克隆化培養(yǎng)：陽性細(xì)胞的單克隆化

克隆是指由單個(gè)細(xì)胞繁殖、擴(kuò)增而形成的性狀均一的細(xì)胞集落的過程。

常見方法有：有限稀釋法和軟瓊脂克隆技術(shù)

有限稀釋法：從陽性分泌孔收集雜交瘤細(xì)胞。

軟瓊脂克隆技術(shù)：從陽性分泌孔中收集雜交瘤細(xì)胞，一適當(dāng)濃度雜交瘤細(xì)胞加入到軟瓊脂培養(yǎng)基中，形成有一個(gè)細(xì)胞增殖來的細(xì)胞集群。

單克隆抗體的鑒定：

（1）? 抗體敏感性檢測(cè)：對(duì)腹水和培養(yǎng)基上清進(jìn)行效價(jià)測(cè)定

（2）? 抗體特異性鑒定：是否與其他抗原右交互反應(yīng)。

（3） 抗體效價(jià)測(cè)定

（4）? 抗體亞類鑒定：IgG（IgG1、IgG2、IgG3）、IgM

（5）? 抗體親和力鑒定

（6）? 識(shí)別表位分析

8.? ? 單克隆抗體的擴(kuò)大生產(chǎn)：細(xì)胞培養(yǎng)法、小鼠體內(nèi)誘生法、生物反應(yīng)器

細(xì)胞培養(yǎng)法：雜交瘤細(xì)胞、培養(yǎng)瓶或罐中培養(yǎng)、收集上清液、純化抗體

動(dòng)物體內(nèi)誘生法：Balb/c小鼠、腹腔注射0.5ml液體是啦或降植烷、腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞、收集腹水

生物反應(yīng)器：發(fā)酵罐培養(yǎng)

單抗培養(yǎng)常見的問題：

（1）? 污染：培養(yǎng)環(huán)境、操作

（2）? 融合細(xì)胞不生長：PEG、血清、HAT培養(yǎng)基

（3）? 抗體分泌不足：支原體污染、細(xì)胞突變、培養(yǎng)體系有問題

（4）? 雜交瘤細(xì)胞難以克隆化：血清質(zhì)量、細(xì)胞活性

第三節(jié)? 基因工程抗體制備技術(shù)

基因工程抗體：通過基因工程的手段，按照個(gè)人意愿進(jìn)行細(xì)胞人工改造的技術(shù)。

優(yōu)點(diǎn)主要有：特異性高、質(zhì)量穩(wěn)定、成本低廉、工藝簡單、異源性滴低、穿透性好、功能豐富。

一、鼠源抗體人源化

鼠源抗體應(yīng)用中的障礙：免疫原性、半衰期短、抗體功能片段失活。

1.? ? ?嵌合抗體：可變區(qū)基因克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建、嵌合抗體的表達(dá)

2.? ? ?改型抗體

二、小分子抗體：Fab抗體、Fv抗體和單鏈抗體、單域抗體、最小識(shí)別單位

小分子抗體的優(yōu)點(diǎn)：

（1）可在原核體系中表達(dá)，降低生產(chǎn)成本。

（2）因?yàn)槠浞肿恿啃?，穿透能力?qiáng)，易進(jìn)入病灶部位，有利于對(duì)腫瘤等疾病的治療。

（3）不含F(xiàn)c片段，不與Fc受體結(jié)合，可減少因廣泛分布的Fc受體而帶來的不利影響。

（4）在體內(nèi)半衰期短，有利于體內(nèi)毒性物質(zhì)的消除

（5）易于進(jìn)一步基因工程分改造。

三、]基于抗體的應(yīng)用

1.? ? ?CAR-T免疫治療：

?????? CAR-T免疫療法：即嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法，是一種新型的過繼性細(xì)胞療法，即利用病人自身的免疫細(xì)胞來清除癌細(xì)胞的細(xì)胞療法，并非藥物。

?????? CAR-T技術(shù)：通過整個(gè)嵌合抗原受體的經(jīng)過基因修飾的T細(xì)胞抵抗腫瘤細(xì)胞的療法。嵌合抗原受體可以特異性識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原或者腫瘤特異性抗原，識(shí)別結(jié)合后將激活及增值信號(hào)傳遞到T細(xì)胞內(nèi)，引起T細(xì)胞激活，增殖釋放細(xì)胞因子，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。

2. 免疫檢查點(diǎn)

3.? 免疫毒素

4.? ADC

5.? 雙特異性抗體

第四節(jié)??[endif]抗體庫技術(shù)

抗體庫技術(shù)：即用基因克隆技術(shù)將全套抗體輕重鏈可變區(qū)基因克隆出來，重組到原核表達(dá)載體上，通過原核系統(tǒng)直接表達(dá)有功能的抗體分子片段，并篩選出特異性的抗體分子和可變區(qū)基因。

一、噬菌體展示技術(shù)原理：噬菌體展示技術(shù)是將外源蛋白質(zhì)或者DNA序列查到噬菌體外殼上的適當(dāng)位置，使外源基因隨著外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時(shí)，外源蛋白隨著噬菌體的重新組裝而展現(xiàn)倒是菌體表面的生物技術(shù)。到目前為止，人們已經(jīng)靠發(fā)出單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、T4噬菌體展示系統(tǒng)、λ噬菌體展示系統(tǒng)等。

二、噬菌體抗體制備的基本程序

1.? ? ?收集淋巴細(xì)胞提取mRNA并轉(zhuǎn)錄到cDNA或直接提取斯堡基因組的DNA

2.? ? ?擴(kuò)增DNA的抗體可變區(qū)基因

3.???? [構(gòu)建重組噬菌體庫

4.? ? ?篩選所需特征的重組噬菌體

5.? ? ?采用突變或鏈置換使親和力成熟

三、噬菌體抗體技術(shù)的特點(diǎn)

1.? ? ?篩選步驟簡單、快速、有效

2.? ? ?擴(kuò)大了篩選流量，一次就可以篩選多于1010個(gè)的克隆

3.? ? ?抗體基因型與表現(xiàn)性聯(lián)系密切，基因穩(wěn)定且容易改造

4.? ? 模擬天然免疫系統(tǒng)親和力成熟過程

5.? ? ?無需人工接種

6.? ? ?可替代動(dòng)物多克隆抗體

7.? ? ?構(gòu)建康體苦時(shí)。輕重鏈可變區(qū)基因在體外隨機(jī)組合，可產(chǎn)生體內(nèi)部存在的輕重鏈組合，得到新的特異性抗體。

8.? ? ?可以在預(yù)案和系統(tǒng)中表達(dá)，大規(guī)模生產(chǎn)方便，且成本低。

四、抗體庫技術(shù)的應(yīng)用

1.? ? ?制備全人源抗體

2.? ? ?改良基因工程抗體

腫瘤免疫治療的單克隆抗體類免疫檢查點(diǎn)抑制

1. Anti-CTLA-4單抗
細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4, CTLA-4）又名CD152，是由CTLA-4基因編碼的一種跨膜蛋白，表達(dá)于活化的CD4和CD8 T細(xì)胞。CTLA-4和CD28均為免疫球蛋白超家族成員，具有高度同源性，二者與相同的配體B7-2（CD86）和B7-1（CD80）結(jié)合。與CD28功能相反，CTLA-4與其配體B7分子結(jié)合后后產(chǎn)生抑制性信號(hào)，抑制T細(xì)胞激活，是免疫系統(tǒng)一個(gè)至關(guān)重要的 “剎車”。CTLA-4是使腫瘤細(xì)胞免受T細(xì)胞攻擊的一個(gè)重要機(jī)制。因此阻斷CTLA-4的免疫效應(yīng)可刺激免疫細(xì)胞活化，大量增殖，從而誘導(dǎo)或增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。
目前兩種靶向CTLA-4的抗體Ipilimumab和Tremelimumab在黑色素瘤、腎癌、前列腺癌、肺癌等的臨床研究已廣發(fā)開展。1/2期臨床研究結(jié)果顯示兩種抗體無論是抗體單藥還是聯(lián)合IL-2，gp100疫苗或化療均顯示安全有效。
Ipilimumab是全人源化單抗，已被美國FDA批準(zhǔn)用于晚期黑色素瘤。在肺癌治療中的Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗(yàn)也迅速開展。Tremelimumab也是一種人源化CTLA-4單抗，是一種IgG2抗體，目前在多種腫瘤中的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。
2. Anti-PD-1/PD-L1單抗
程序性死亡受體1（programmed death 1, PD-1）為CD28超家族成員。 PD-1表達(dá)于活化的T細(xì)胞，B細(xì)胞及髓系細(xì)胞，其有兩個(gè)配體，即程序性死亡配體-1（programmed death ligand 1, PD-L1）和PD-L2。PD-L1/L2在抗原遞呈細(xì)胞都表達(dá)，PD-L1在多種組織也有表達(dá)。PD-1與PD-L1的結(jié)合介導(dǎo)T細(xì)胞活化的共抑制信號(hào)，調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化和增殖，起到類似于CTLA-4的負(fù)調(diào)節(jié)作用。華裔科學(xué)家陳列平實(shí)驗(yàn)室首先發(fā)現(xiàn)PD-L1在腫瘤組織高表達(dá)，而且調(diào)節(jié)腫瘤浸潤C(jī)D8 T細(xì)胞的功能。因此，以PD-1/PD-L1為靶點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)對(duì)抗腫瘤有重要的意義。
近年來，已有多種Anti-PD-1/PD-L1抗體在腫瘤免疫治療的臨床研究迅速開展。目前Pembrolizumab和Nivolumab已被FDA批準(zhǔn)用于晚期黑色素瘤，最近Nivolumab也已被美國FDA批準(zhǔn)用于晚期鱗狀非小細(xì)胞肺癌的治療。另外，MPDL3280A （anti-PD-L1單抗），Avelumab（anti-PD-L1單抗）等也已進(jìn)入多個(gè)晚期臨床研究中，覆蓋非小細(xì)胞癌，黑色素瘤，膀胱癌等多個(gè)瘤種。
3. 其它類型單克隆抗體
其它如增強(qiáng)T細(xì)胞第二信號(hào)從而促進(jìn)腫瘤特異性T細(xì)胞活化和增值的單抗類，如腫瘤壞死因子TNF受體家族的OX40和4-1BB單抗也在研發(fā)中。

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